香煙煙霧染毒對(duì)雄性大鼠睪丸組織一氧化氮水平的影響*

張 靜,鄧 晟,仲春雪,黃云飛,張 晨△,何麗娟,鄒 瑩

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院毒理學(xué)教研室,烏魯木齊 830011;2.新疆維吾爾自治區(qū)疾病預(yù)防控制中心，烏魯木齊 830001)

香煙煙霧染毒對(duì)雄性大鼠睪丸組織一氧化氮水平的影響*

張 靜1,鄧 晟2,仲春雪1,黃云飛1,張 晨1△,何麗娟1,鄒 瑩1

(1.新疆醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院毒理學(xué)教研室,烏魯木齊 830011;2.新疆維吾爾自治區(qū)疾病預(yù)防控制中心，烏魯木齊 830001)

目的 探討香煙煙霧染毒對(duì)大鼠睪丸組織結(jié)構(gòu)及睪丸組織一氧化氮(NO)水平的影響。方法 清潔級(jí)成年雄性SD大鼠160只，分為對(duì)照組和低、中、高劑量染毒組，各組大鼠分別染毒2、4、6、8、12周，每組10只。染毒組采用呼吸道靜式染毒，每天1次，每次0.5 h。觀察大鼠睪丸組織結(jié)構(gòu)，檢測(cè)各組大鼠體質(zhì)量及睪丸組織NO水平。結(jié)果 染毒4、6、8、12周時(shí)，中、高劑量染毒組大鼠體質(zhì)量與對(duì)照組和低劑量組相比均明顯降低(P<0.05)，染毒8、12周時(shí)，高劑量染毒組大鼠體質(zhì)量與中劑量組相比明顯降低(P<0.05)，并且隨著染毒劑量的增加，降低更加明顯。染毒2、4、6、8周時(shí)，高劑量組大鼠睪丸組織NO水平與對(duì)照組和低、中劑量組相比均明顯升高(P<0.05)；染毒8周時(shí)，中劑量組大鼠睪丸組織NO水平與對(duì)照組相比明顯升高(P<0.05)；染毒12周時(shí)，低、中、高劑量組大鼠睪丸組織NO水平與對(duì)照組相比均明顯升高 (P<0.05) ，中、高劑量組大鼠睪丸組織NO水平與低劑量組相比明顯升高 (P<0.05)。結(jié)論 香煙煙霧染毒可致雄性大鼠睪丸組織NO水平升高，導(dǎo)致雄性大鼠睪丸組織損傷。

睪丸；煙草；煙霧；毒物；雄性大鼠；一氧化氮

男性生殖健康問(wèn)題是影響家庭和諧和社會(huì)穩(wěn)定的重要醫(yī)學(xué)問(wèn)題。目前，男性精液質(zhì)量下降造成的不育問(wèn)題已經(jīng)引起了全世界的關(guān)注。香煙煙霧中含有多種致癌物質(zhì)和細(xì)胞誘變劑，可能對(duì)男性生育產(chǎn)生不利影響[1]。WHO指出，煙草危害是現(xiàn)今全球最嚴(yán)峻的公共衛(wèi)生問(wèn)題之一[2]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球15歲以上人群中吸煙者占22%，每年約有600萬(wàn)人死于吸煙相關(guān)疾病，與吸煙相關(guān)的死亡已占全世界死因構(gòu)成第1位[3]。有一些學(xué)者報(bào)道吸煙會(huì)對(duì)雄性生殖產(chǎn)生不利影響[4-7]，但至今毒性機(jī)理尚不明確。本研究建立大鼠吸煙模型，觀察香煙煙霧暴露對(duì)大鼠睪丸組織的損害特點(diǎn)，檢測(cè)香煙煙霧暴露對(duì)大鼠睪丸組織中一氧化氮(NO)水平的影響，為探討香煙煙霧暴露對(duì)雄性生殖毒性的機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：清潔級(jí)成年雄性SD大鼠160只，由新疆維吾爾自治區(qū)疾病預(yù)防控制中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)為SCXK(新)2011-0001，大鼠體質(zhì)量為180～220 g。(2)受試物：新疆卷煙廠生產(chǎn)的某品牌過(guò)濾嘴香煙，煙氣煙堿量每支1.2 mg，焦油量每支12.0 mg。(3)主要試劑：NO檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所)，考馬斯亮藍(lán)蛋白定量試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)方法 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為對(duì)照組和及低(10根)、中(20根)、高(30根)染毒劑量組，各組大鼠分別染毒2、4、6、8、12周，每組10只。染毒組大鼠置于自制染毒箱內(nèi)(80 cm×60 cm×80 cm)，采用呼吸道靜式染毒，香煙煙霧由真空泵抽入，1次/天， 0.5小時(shí)/次。對(duì)照組大鼠每天相同時(shí)間放置于染毒箱內(nèi)，但未進(jìn)行染毒。

1.2.2 標(biāo)本采集 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后各組大鼠腹腔注射水合氯醛(按每100 g體質(zhì)量0.3 mL計(jì)算)麻醉，迅速摘取睪丸和附睪，放入4 ℃生理鹽水中漂洗，濾紙吸干水分后，用電子天平稱其濕質(zhì)量，右側(cè)睪丸制備組織勻漿，左側(cè)睪丸4%多聚甲醛固定，制作病理切片。

1.2.3 睪丸組織勻漿制備 稱取適量睪丸組織，按質(zhì)量∶體積=1∶9的比例加入生理鹽水，機(jī)械勻漿，2 500 r/min，離心10 min，取上清液，即為10%濃度睪丸組織勻漿；取生理鹽水10倍稀釋該組織勻漿，得1%濃度睪丸組織勻漿。

1.2.4 測(cè)定方法

1.2.4.1 考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定睪丸組織勻漿中蛋白水平 取1%濃度睪丸組織勻漿按說(shuō)明書(shū)步驟加樣，吹打混勻，靜置10 min，于波長(zhǎng)595 nm處，測(cè)定各管樣品吸光度值。按公式計(jì)算各樣品蛋白濃度。

1.2.4.2 NO水平測(cè)定 取10%濃度睪丸組織勻漿，按說(shuō)明書(shū)操作步驟加樣，吹打混勻，室溫靜置10 min后在波長(zhǎng)550 nm處，測(cè)定各管樣品吸光度值，按公式計(jì)算各樣品NO水平。

2 結(jié) 果

2.1 一般情況觀察 對(duì)照組大鼠被毛潔凈有光澤，活動(dòng)敏捷，精神狀態(tài)良好，飲水、飲食正常，試驗(yàn)期內(nèi)體質(zhì)量增加明顯。染毒組大鼠被毛無(wú)光澤，倦怠懶動(dòng)，行動(dòng)活躍度降低，出現(xiàn)不同程度飲水、飲食量減少，體質(zhì)量增長(zhǎng)緩慢。其中高劑量染毒組大鼠在染毒后期進(jìn)食差，體質(zhì)量減輕，行動(dòng)遲緩，精神萎靡。

2.2 大鼠體質(zhì)量變化 染毒2周時(shí)，各劑量組大鼠體質(zhì)量與對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；染毒4、6、8、12周時(shí)，低劑量染毒組大鼠體質(zhì)量與對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，中、高劑量染毒組大鼠體質(zhì)量與對(duì)照組和低劑量組相比均明顯降低(P<0.05)；染毒8、12周時(shí)，高劑量染毒組大鼠體質(zhì)量與中劑量組相比明顯降低(P<0.05)，并且隨著染毒劑量的增加，體質(zhì)量降低更加明顯，見(jiàn)表1。

2.3 睪丸及附睪重量、臟器系數(shù)比較 與對(duì)照組比較，各染毒組大鼠睪丸及附睪重量、臟器系數(shù)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表2。

2.4 大鼠睪丸組織病理變化 對(duì)照組大鼠睪丸精曲小管形態(tài)規(guī)則，生精上皮基膜完好無(wú)缺，各級(jí)生精細(xì)胞緊密排列，曲細(xì)精管管腔內(nèi)還可見(jiàn)大量精子；染毒組大鼠生精小管和間質(zhì)組織均可見(jiàn)明顯的變性改變，界膜局部剝脫，曲細(xì)精管內(nèi)生精細(xì)胞層數(shù)明顯減少，細(xì)胞排列紊亂，各級(jí)生精細(xì)胞、精子數(shù)量降低，甚至未觀察到游離精子。隨著染毒劑量的增加和染毒時(shí)間的延長(zhǎng)，大鼠睪丸組織損傷加重，見(jiàn)圖1。

2.5 大鼠睪丸組織NO水平比較 隨著染毒劑量和染毒時(shí)間的增加，大鼠睪丸組織NO水平逐漸升高。方差分析結(jié)果顯示：染毒2～12周時(shí)，各劑量組大鼠睪丸組織NO水平比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；進(jìn)一步兩兩比較顯示：染毒2、4、6、8周時(shí)，高劑量組大鼠睪丸組織NO水平與對(duì)照組和低、中劑量組比較均明顯升高(P<0.05)；染毒8周時(shí)，中劑量組大鼠睪丸組織NO水平與對(duì)照組比較明顯升高(P<0.05)；染毒12周時(shí)，低、中、高劑量組大鼠睪丸組織NO水平與對(duì)照組比較均明顯升高 (P<0.05) ，中、高劑量組大鼠睪丸組織NO水平與低劑量組比較明顯升高 (P<0.05)，見(jiàn)表3。

表1 各組大鼠不同時(shí)間體質(zhì)量比較

a：P<0.05，與對(duì)照組比較;b：P<0.05，與低劑量組比較;c：P<0.05，與中劑量組比較。

表2 各組大鼠睪丸及附睪重量、臟器系數(shù)比較

續(xù)表2 各組大鼠睪丸及附睪重量、臟器系數(shù)比較

A：對(duì)照組；B：2周低劑量組；C：2周中劑量組；D：2周高劑量組；E：4周低劑量組；F：4周中劑量組；G：4周高劑量組；H：6周低劑量組；I：6周中劑量組；J：6周高劑量組；K：8周低劑量組；L：8周中劑量組；M：8周高劑量組；N：12周低劑量組；O：12周中劑量組；P：12周高劑量組。

圖1 各組大鼠睪丸組織病理圖片(×400)

a：P<0.05，與對(duì)照組比較;b：P<0.05，與低劑量組比較;c：P<0.05，與中劑量組比較。

3 討 論

吸煙是與人類生活環(huán)境最密切相關(guān)的行為之一，并給全世界公共衛(wèi)生領(lǐng)域帶來(lái)巨大的財(cái)政和醫(yī)療負(fù)擔(dān)[8]。吸煙對(duì)人體健康的危害是眾所周知的，吸煙也被認(rèn)為是男性不育的高危因素之一[9]。長(zhǎng)期吸煙對(duì)男性生殖系統(tǒng)的負(fù)面影響已在臨床研究中得到證實(shí)[10]。

本研究觀察發(fā)現(xiàn)，染毒組大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)較對(duì)照組減緩。各組大鼠睪丸、附睪重量及臟器系數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，推測(cè)其原因可能是由于低劑量組大鼠染毒劑量較小，而尼古丁(香煙中主要有害物質(zhì))代謝較快，尚未能引起實(shí)驗(yàn)大鼠體質(zhì)量、睪丸臟器系數(shù)及附睪臟器系數(shù)的改變。此外，中、高劑量染毒組，尤其是高劑量組大鼠染毒后期，體質(zhì)量增長(zhǎng)緩慢，甚至出現(xiàn)負(fù)增長(zhǎng)，也可能是染毒組大鼠睪丸、附睪臟器系數(shù)未出現(xiàn)顯著變化的原因之一。

NO在哺乳動(dòng)物生殖系統(tǒng)中廣泛存在，不僅與精子發(fā)生、成熟密切相關(guān)，還可調(diào)節(jié)雄激素分泌[11]。NO具有雙重調(diào)節(jié)作用，低濃度NO可以通過(guò)捕捉氧自由基等作用使膜脂質(zhì)過(guò)氧化減少，從而幫助精子免于氧自由基的損害，保障精子發(fā)生及睪酮分泌[12]；高濃度NO則會(huì)損傷脂膜，引起組織損害，也可通過(guò)cGMP作用影響精子發(fā)生及睪酮分泌[13]。Nobunaga等[14]報(bào)道生育組精漿中NO水平顯著低于不育組，而精子活力顯著高于不育組，提示高濃度NO可致精子活力降低。林霖等[15]研究發(fā)現(xiàn)鉬染毒組小鼠睪丸NO水平升高，且呈劑量-反應(yīng)關(guān)系，隨著染毒劑量的增加，睪丸組織損傷加重。喬彥等[16]報(bào)道尼古丁染毒組小鼠睪丸組織中NO水平顯著升高，睪酮水平顯著下降，誘導(dǎo)型NOS蛋白表達(dá)增加，精子活力降低。本研究顯示，隨著香煙煙霧染毒劑量的增加和染毒時(shí)間的延長(zhǎng)，大鼠睪丸組織中NO水平逐漸升高，睪丸組織損傷加重。這與前述研究[14-16]結(jié)果相似。本課題組前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，吸煙可造成雄性小鼠睪丸組織勻漿中NOS水平升高，而NOS能催化L-精氨酸分解成胍氨酸產(chǎn)生NO，使小鼠睪丸組織中NO水平升高[17]。這也與本研究結(jié)果相吻合。

綜上所述，在本實(shí)驗(yàn)條件下，香煙煙霧染毒可致雄性大鼠睪丸組織NO水平升高，并導(dǎo)致雄性大鼠睪丸組織損傷。

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The effect of cigarette smoke exposure on nitric oxide level in testis of male rats*

ZhangJing1,DengSheng2,ZhongChunxue1,HuangYunfei1,ZhangChen1△,HeLijuan1,ZouYing1

(1.DepartmentofToxicology,CollegeofPublicHealth,XinjiangMedicalUniversity,Urumqi,theXinjiangUygurAutonomousRegion830011,China；2.XinjiangCenterforDiseaseControlandPrevention,Urumqi,theXinjiangUygurAutonomousRegion830001,China)

Objective To explore the effect of cigarette smoke exposure on testis structure and nitric oxide (NO) level in testis of rats.Methods A total of 160 adult male SD rats were divided into control group and low,medium,high dose groups.The smoke-exposed rats were respectively exposed to the smog for the periods of 2,4,6,8 and 12 weeks,10 rats in each group.The smoke-exposed rats were exposed to cigarette smoke for 0.5 h per day.The testicular tissue structure was observed and the body mass and the NO level of testis were measured.Results Compared with the control group and low dose group,the body mass of the rats was significantly lower in the medium and high dose groups exposed for 4,6,8,12 weeks (P<0.05).Compared with the medium dose groups,the body mass of the rats was significantly lower in the high dose group exposed for 8 weeks and 12 weeks (P<0.05).And with the increase of exposure dose,the reducing was even more obvious.Compared with the control group and low and medium dose groups,NO level in testis of rats was significantly increased in the high dose groups exposed for 2,4,6,8 weeks (P<0.05).Compared with the control group,NO level in testis of rats was significantly increased in the medium dose groups exposed for 8 weeks (P<0.05).Compared with the control group,NO level in testis of rats was significantly increased in the low,medium and high dose groups exposed for 12 weeks (P<0.05);and compared with the low dose group,NO level in testis of rats was significantly increased in the medium and high dose groups(P<0.05).Conclusion Cigarette smoke exposure may have impacts on testis tissue and lead to the increase of NO level in testis of male rats.

testis;tobacco;smog;poisons;male rats;nitric oxide

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.14.005

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81260433)；新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2014211C015)。 作者簡(jiǎn)介：張靜(1979-)，副教授，博士，主要從事生殖發(fā)育毒理方面研究。△

，E-mail:zhangchendr@163.com。

R114

A

1671-8348(2017)14-1885-04

2016-11-18

2017-01-06)