抑制自噬對貝伐單抗誘導(dǎo)的結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞凋亡的影響

柴 婷，任 爽，張燕燕，匡 菁，楊家梅

鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院腫瘤科 鄭州 450014

抑制自噬對貝伐單抗誘導(dǎo)的結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞凋亡的影響

柴 婷，任 爽，張燕燕，匡 菁，楊家梅#

鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院腫瘤科 鄭州 450014

#通信作者，女，1965年12月生，碩士，主任醫(yī)師，研究方向：腫瘤化療，E-mail：yjm6601@163.com

自噬；貝伐單抗；結(jié)腸癌；凋亡

目的：探討抑制自噬對貝伐單抗誘導(dǎo)的結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞凋亡的影響。方法：用貝伐單抗、自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA)處理人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞48 h，Annexin V-FITC染色、流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡，吖啶橙染色、熒光顯微鏡觀察細(xì)胞酸性自噬泡的變化，Western blot法檢測細(xì)胞內(nèi)自噬相關(guān)蛋白Beclin-1以及凋亡相關(guān)蛋白Caspase-9的表達(dá)。結(jié)果：貝伐單抗作用48 h對HCT116細(xì)胞的半數(shù)抑制劑量(IC50)為16 mg/L，3-MA的IC50為5 mmol/L。在此濃度下，3-MA單獨(dú)作用可降低細(xì)胞中Beclin-1的表達(dá)，貝伐單抗單獨(dú)作用可增強(qiáng)細(xì)胞中Beclin-1的表達(dá)，二者聯(lián)用有拮抗作用(P<0.05)。3-MA和貝伐單抗單獨(dú)作用均可提高細(xì)胞凋亡率(P<0.05)，增強(qiáng)細(xì)胞中Caspase-9蛋白的表達(dá)(P<0.05)，二者聯(lián)用有協(xié)同作用(P<0.05)。結(jié)論：抑制自噬可增強(qiáng)貝伐單抗對結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞的殺傷作用。

貝伐單抗是靶向血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的單克隆抗體，可以明顯抑制腫瘤組織新生血管的形成，從而造成旺盛生長的腫瘤細(xì)胞的供血不足，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞缺血、缺氧[1]。自噬是腫瘤細(xì)胞對抗各種抗腫瘤作用的有效手段，通過降解受損的腫瘤細(xì)胞細(xì)胞器、大分子蛋白質(zhì)，給腫瘤細(xì)胞提供生物合成所需的分子底物，幫

助其應(yīng)對惡劣的生存環(huán)境并維持細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)。特別是在腫瘤化療過程中，自噬能夠通過隔離并降解被藥物破壞的蛋白或細(xì)胞器，保護(hù)細(xì)胞并對抗化療藥物，降低化療藥物的療效[2-5]。該研究中，作者用自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA)和貝伐單抗單獨(dú)或聯(lián)合作用于結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞，觀察抑制自噬對貝伐單抗誘導(dǎo)的HCT116細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 HCT116細(xì)胞株由河南省高等學(xué)校臨床醫(yī)學(xué)重點(diǎn)學(xué)科開放實(shí)驗(yàn)室凍存。貝伐單抗購自Roche公司，3-MA、膜聯(lián)蛋白V(Annexin V)-異硫氰酸熒光素(FITC)/碘化丙啶(PI)細(xì)胞凋亡檢測試劑盒均購自凱基生物科技發(fā)展有限公司，胎牛血清購自四季青生物工程材料有限公司，MTT購自Sigma公司，RPMI 1640及胰蛋白酶消化液購自Solarbio公司， Beclin-1及Caspase-9多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司。

1.2 貝伐單抗和3-MA作用濃度的篩選 配制0、4、8、16、32、64 mg/L的貝伐單抗溶液及0.0、1.0、2.5、5.0、7.0、10.0 mmol/L的3-MA溶液，均用dH2O稀釋。HCT116細(xì)胞復(fù)蘇后用RPMI 1640培養(yǎng)基于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)，每3 d更換培養(yǎng)液1次，使用胰蛋白酶消化傳代。取對數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)細(xì)胞密度為1×108L-1，接種于96孔板，每孔加入細(xì)胞懸液100 μL,連續(xù)培養(yǎng)24 h后棄培養(yǎng)液，分別加入100 μL不同濃度的貝伐單抗溶液或3-MA溶液作用24、48、72 h，然后MTT法檢測細(xì)胞生長抑制率，酶標(biāo)儀測定波長為490 nm，記錄吸光度(A)值。以生理鹽水培養(yǎng)的細(xì)胞為對照，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞生長抑制率=(1-A實(shí)驗(yàn)組/A對照)×100%。繪制細(xì)胞生長曲線確定貝伐單抗或3-MA的半數(shù)抑制劑量(IC50)，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 貝伐單抗聯(lián)合3-MA對HCT116細(xì)胞的影響

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組 取對數(shù)生長期的HCT116細(xì)胞，調(diào)細(xì)胞密度為1×108L-1并接種于細(xì)胞培養(yǎng)板，分4組處理，分別為對照組(加入生理鹽水)、貝伐單抗組、3-MA組及聯(lián)合組,每組3個(gè)復(fù)孔。

1.3.2 細(xì)胞自噬變化的觀察 取對數(shù)生長期的HCT116細(xì)胞，經(jīng)胰蛋白酶消化處理后接種于24孔板，待細(xì)胞貼壁，按1.3.1分組處理48 h，棄培養(yǎng)液，加入濃度為10 mg/L的吖啶橙(AO)，室溫、避光條件下孵育20 min，冷PBS洗滌3次，最后于倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞中酸性自噬泡的變化。

1.3.3 細(xì)胞凋亡率檢測 將細(xì)胞接種于6孔板，待細(xì)胞貼壁，按1.3.1分組處理48 h，離心收集懸浮細(xì)胞，使用胰蛋白酶消化并收集細(xì)胞，用冷PBS洗滌2次，加入5 μL Annexin V-FITC染色液并混勻，4 ℃避光條件下孵育15 min，隨后加入10 μL PI并輕輕混勻，同等條件下孵育5 min，然后上流式細(xì)胞儀檢測。1.3.4 細(xì)胞中Beclin-1和Caspase-9蛋白檢測 HCT116細(xì)胞同上分組處理48 h后，用Western blot法檢測Beclin-1和Caspase-9蛋白的表達(dá)。一抗工作濃度均為1:500，辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗工作濃度均為1:2 000。以GAPDH為內(nèi)參照。最后行ECL，掃描拍照，應(yīng)用Image J圖像處理軟件進(jìn)行灰度分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 13.0進(jìn)行分析。采用2×2析因設(shè)計(jì)的方差分析比較貝伐單抗、3-MA單用及聯(lián)用對HCT116細(xì)胞凋亡率、Beclin-1和Caspase-9蛋白表達(dá)的影響，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 貝伐單抗和3-MA作用濃度的篩選 HCT116細(xì)胞生長曲線見圖1。作用于HCT116細(xì)胞48 h，貝伐單抗的IC50為16 mg/L，3-MA的IC50為5 mmol/L，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)貝伐單抗和3-MA的作用濃度選用16 mg/L和5 mmol/L。

圖1 貝伐單抗(上)和3-MA(下)作用下HCT116細(xì)胞的生長曲線

2.2 貝伐單抗聯(lián)合3-MA作用后HCT116細(xì)胞自噬變化 倒置熒光顯微鏡下(圖2)觀察，對照組細(xì)胞胞核呈綠色熒光，胞質(zhì)可見少量點(diǎn)狀紅色熒光；貝伐單抗組細(xì)胞胞核呈黃綠色熒光，且胞質(zhì)呈點(diǎn)片狀紅色熒光；3-MA組細(xì)胞胞核呈綠色熒光，胞質(zhì)未見紅色熒光；聯(lián)合組細(xì)胞胞核呈淡綠色熒光，胞質(zhì)可見稀少紅色熒光。結(jié)果提示，對照組、貝伐單抗組存在自噬現(xiàn)象，而3-MA可以抑制貝伐單抗誘導(dǎo)的HCT116細(xì)胞自噬。

A:對照組;B:貝伐單抗組;C：3-MA 組；D：聯(lián)合組。圖2 細(xì)胞自噬表現(xiàn)(AO染色，×400)

2.3 貝伐單抗聯(lián)合3-MA作用后HCT116細(xì)胞凋亡率檢測結(jié)果 見表1。3-MA和貝伐單抗均可誘導(dǎo)HCT116細(xì)胞凋亡，且兩者有協(xié)同作用。

表1 4組HCT116細(xì)胞凋亡率的比較(n=3) %

F3-MA=5 690.925,F貝伐單抗= 525 121.004,F交互=9 674.245，P均<0.001。

2.4 貝伐單抗聯(lián)合3-MA作用后HCT116細(xì)胞中Beclin-1和Caspase-9蛋白的表達(dá) 見圖3，表2、3。3-MA和貝伐單抗單獨(dú)作用均可增強(qiáng)HCT116細(xì)胞中Caspase-9的表達(dá)，且兩者有協(xié)同作用。3-MA可降低HCT116細(xì)胞中Beclin-1蛋白的表達(dá)，貝伐單抗則促其表達(dá)，兩者有拮抗作用。

1：對照組；2：3-MA組；3：貝伐單抗組；4：聯(lián)合組。圖3 4組細(xì)胞中Beclin-1和Caspase-9蛋白的表達(dá)

表2 4組細(xì)胞Beclin-1蛋白表達(dá)的比較(n=3)

F3-MA=1 680.884,F貝伐單抗=8 776.717,F交互=66.749，P均<0.001。

表3 4組細(xì)胞Caspase-9蛋白表達(dá)的比較(n=3)

F3-MA=1 615.213,F貝伐單抗=5 978.611,F交互=89.905，P均<0.001。

3 討論

大量新生血管的形成是腫瘤的特征之一[6]。貝伐單抗為新型靶向VEGF的人源化單克隆抗體，主要通過中和VEGF，阻斷其與膜上相關(guān)受體的結(jié)合，從而減少腫瘤細(xì)胞的血供、氧供等，抑制腫瘤細(xì)胞的生長、轉(zhuǎn)移[7]。目前貝伐單抗主要應(yīng)用于晚期結(jié)直腸癌、非小細(xì)胞肺癌等惡性腫瘤的輔助治療，可顯著延長患者的生存期[8-9]。

自噬是細(xì)胞一種重要的防御和自我保護(hù)機(jī)制[10]。在腫瘤早期，自噬通過破壞腫瘤細(xì)胞來抑制腫瘤的發(fā)生；在腫瘤的增殖期，腫瘤內(nèi)部會出現(xiàn)血供不良，自噬可以使其對抗缺氧和營養(yǎng)不足。研究[11]表明，應(yīng)用分子靶向藥物治療惡性腫瘤的同時(shí)也可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬，從而削弱分子靶向藥物的療效。使用伊馬替尼治療慢性髓系白血病時(shí)，伊馬替尼可通過誘導(dǎo)自噬相關(guān)基因Beclin-1高表達(dá)，從而對白血病細(xì)胞起到保護(hù)作用，而抑制自噬可促進(jìn)伊馬替尼誘導(dǎo)的白血病細(xì)胞的死亡[12]。曲妥珠單抗在治療HER-2(+)的乳腺癌過程中易發(fā)生耐藥，而聯(lián)合應(yīng)用3-MA可增強(qiáng)曲妥珠單抗的治療效果[13]。

該研究中，作者采用3-MA、貝伐單抗單獨(dú)或聯(lián)合作用于HCT116細(xì)胞，觀察HCT116細(xì)胞自噬變化，檢測自噬相關(guān)蛋白Beclin-1表達(dá)的變化，同時(shí)檢測細(xì)胞凋亡率和凋亡相關(guān)蛋白Caspase-9表達(dá)的變化。結(jié)果顯示，3-MA可增強(qiáng)貝伐單抗誘導(dǎo)的結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞的凋亡，減弱貝伐單抗誘導(dǎo)的HCT116細(xì)胞的自噬水平。

該研究結(jié)果提示，自噬抑制劑3-MA可增強(qiáng)貝伐單抗的抗腫瘤作用，自噬抑制劑和貝伐單抗聯(lián)合應(yīng)用可成為一種新的結(jié)腸癌輔助治療方法。

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(2016-08-31收稿 責(zé)任編輯王 曼)

Effect of autophagy inhibition on bevacizumab-induced apoptosis of human colon cancer HCT116 cells

CHAITing,RENShuang,ZHANGYanyan,KUANGJing,YANGJiamei

DepartmentofOncology,theSecondAffiliatedHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450014

autophagy;bevacizumab;colon cancer;apoptosis

Aim: To study the effect of autophagy inhibition on bevacizumab-induced apoptosis of HCT116 cells.Methods: Human colon cancer HCT116 cells were treated with bevacizumab and autophagy inhibitor 3-methyl adenine(3-MA) alone or combined for 48 h, cell apoptosis rate was detected by Annexin V-FITC staining and flow cytometry, the changes of acidic autophagic vacuoles observed by acridine orange staining, the expressions of autophagy-related protein Beclin-1 and apoptosis-related protein Caspase-9 were detected by Western blot. Results: The median inhibition dose of bevacizumab for 48 h was 16 mg/L, and that of 3-MA was 5 mmol/L. At these doses,3-MA alone could decrease the expression of Beclin-1 in the cells(P<0.05), while bevacizumab alone could enhance Beclin-1 expression(P<0.05), and the effects of bevacizumab and 3-MA were antagonistic(P<0.05). 3-MA and bevacizumab alone could increase the apoptosis rate(P<0.05) and enhance the expression of Caspase-9 protein in the cells(P<0.05), and they had synergistic effect(P<0.05).Conclusion: Autophagy inhibition may enhance the killing effect of bevacizumab on the human colon cancer HCT116 cells.

10.13705/j.issn.1671-6825.2017.03.028

R735.3