王娜泠 胡則輝 卞光明 王躍斌 胡成碩 柴學軍

摘要[目的]研究蟹類DNA條形碼技術(shù)。[方法]利用PCR技術(shù)對浙江沿海6種常見蟹類（n=34）mtDNA COI基因進行擴增，最終獲得688 bp基因片段。[結(jié)果]7個紅星梭子蟹（Portunus sanguinolentus）樣品中檢測出5個單倍型，5個銳齒蟳（Charybdis acuta）樣品中檢測出5個單倍型，銹斑蟳（C.feriatus）、日本蟳（C.japonica）、綿蟹（Dromia dehaani）、三疣梭子蟹（P.trituberculatus）樣品中檢測出單倍型數(shù)分別為3、2、2、1；6種蟹類COI基因T、C、A、G的平均含量分別為25.3%、18.2%、36.2%和20.3%，A+T含量為58.5%～64.1%；種內(nèi)變異較小，遺傳距離處于0.000～0.004，種間遺傳距離為0.143～0.235；使用最大似然法構(gòu)建的分子進化樹揭示相同物種個體首先聚類，不存在不同物種個體交叉聚類。[結(jié)論]COI-L1490/H2198通用引物在蟹類條形碼研究中具有普遍適用性，mtDNA COI基因能夠作為6種蟹類有效鑒別的DNA條形碼，且區(qū)分度高、支持形態(tài)學分類結(jié)果。

關(guān)鍵詞蟹類；DNA條形碼；COI基因

中圖分類號S188+.1；Q75文獻標識碼A文章編號0517-6611（2017）26-0131-02

Identification Technology Research on DNA Barcode of Six Crabs Species

WANG Naling， HU Zehui， BIAN Guangming，CHAI Xuejun* et al

（Marine and Fisheries Research Institute of Zhejiang Ocean University， Zhejiang Marine Fisheries Institute， Zhoushan，Zhejiang 316021）

Abstract[Odjective] To study DNA barcode of crab. [Method] PCR technique was used to amplify the mtDNA COI gene in six crabs species collected from Zhejiang coastal sea， obtaining 688 bp gene fragment. [Result] Seven individuals of Portunus sanguinolentus were tested for five haplotypes， five haplotypes were detected in five C.acuta samples， and the haplotypes of C. feriatus， C .japonica， D.dehaani， P. trituberculatus were 3， 2， 2 and 1.The average content of 6 species of COI gene T， C， A and G of crabs was 25.3%， 18.2%， 36.2% and 20.3%，A + T was 58.5%-64.1%. The variation of the species was just a little， the genetic distance was 0.000-0.004， the range of genetic distance was 0.149-0.241. Phylogenetic tree using maximum likelihood method revealed that the same species of species firstly cluster， and there was no individual crossclustering of individual species. [Conclusion] The analysis indicated that the primer pair of COI-L1490/H2198 for crabs had universal applicability in the barcode study. mtDNA COI gene could be used as a DNA barcode of 6 crabs， with higher distinguish degree supporting the morphological classification.

Key wordsCrabs；DNA barcode；COI gene

浙江海域蟹類資源十分豐富，自20世紀70年代后期以來，捕撈強度劇增，致使浙江沿海傳統(tǒng)的底層魚類資源衰退，捕食蝦蟹類的魚類減少，使蝦蟹類生存空間擴大，資源發(fā)生量增多，數(shù)量增長較快[1]?？焖佟⒕珳疏b定各種蟹類，對于物種保護、蟹類資源高效利用具有重要意義。然而，海洋生物形態(tài)鑒定方法具有較大局限性，易受物種性別和發(fā)育階段的限制，物種表型可塑性以及遺傳多樣性都會使其無法精準識別物種[2]。

DNA 條形碼（DNA barcode）是一段能夠快速、準確鑒別物種的標準DNA 序列[3]。DNA條形碼技術(shù)對樣品要求低、克服表型類似影響、檢測自動化、管理數(shù)據(jù)化、鑒別規(guī)模化，與傳統(tǒng)的分類方法相互佐證，能夠?qū)崿F(xiàn)物種的高效、精準鑒定。Raupach等[4]研究分析北海甲殼類動物高效識別系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)DNA條形碼技術(shù)在北海甲殼類動物的識別中具有高效性。Radulovici等[5]對圣勞倫斯河河口和海灣的 460 種海洋甲殼類（n=507）進行COI分析，結(jié)果顯示種間差異比種內(nèi)差異高25倍，95%的個體序列差異和形態(tài)相一致，證實了DNA條形碼技術(shù)在海洋甲殼類物種鑒定中的有效性。目前，蟹類mtDNA COI基因條形碼研究主要見于青蟹屬（Scylla spp）[6-7]、華溪蟹屬（Sinopotamon spp）[8-9]、蟳屬（Charybdis spp）[10]。

該研究通過PCR技術(shù)對浙江沿海6種常見蟹類（n=34）mtDNA COI 基因進行擴增，獲得相應(yīng)DNA條形碼，以期為海洋生態(tài)學、海洋分類學和海洋生物分子系統(tǒng)學研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)與資料，為浙江沿海蟹類種質(zhì)資源的保護與合理開發(fā)利用以及海關(guān)檢測等領(lǐng)域提供科學的理論依據(jù)和技術(shù)參考。

1材料與方法

1.1材料

該試驗所用蟹類取自浙江沿海，置于實驗室超低溫冰箱 （-20 ℃）保存?zhèn)溆?，具體采集信息見表1。

1.2方法

1.2.1基因組DNA提取。

采用天根海洋動物基因組提取試劑盒（TIANamp Marine Animals DNA Kit）操作說明提取樣品總基因組DNA，經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性后，用Nanodrop 2000紫外分光光度計檢測DNA質(zhì)量與濃度，并稀釋為50 ng/μL，置于-20 ℃保存。

1.2.2PCR擴增及測序。

PCR采用通用引物COI-L1490：5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG -3′和COI-H2198：5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′（上海生工合成），反應(yīng)體系為25 μL，包含2×Taq MasterMix（康維世紀）12.5 μL，模板DNA 100 ng，10 μmol/L的引物各1 μL，ddH2O補足至25 μL。PCR反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性45 s，49 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測驗證條帶的大小后，送往上海杰李生物技術(shù)有限公司測序。

1.3數(shù)據(jù)分析

采用BioEdit[11]對所得序列進行編輯，用MEGA 5.0軟件[12]分析序列堿基組成，并使用 Kimura 2-parameter模型計算各蟹類遺傳距離，利用最大似然法（Maximum Likelihood，ML）構(gòu)建分子發(fā)育進化樹，并采用Bootstrap 1000檢驗系統(tǒng)樹各分支的置信度。

2結(jié)果與分析

2.1PCR瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

PCR擴增產(chǎn)物凝膠電泳結(jié)果見圖1。產(chǎn)物片段大小與設(shè)計的目的片段長度相符（688 bp），條帶明亮、清晰、無雜帶，滿足測序要求。

2.2序列分析

采用BioEdit對測序所得序列進行編

輯，去除序列兩端不穩(wěn)定部分，并通過Blast分析比較，確認得到688 bp的COI基因片段。7個P.sanguinolentus樣品中檢測出5個單倍型（Ps1～5），5個C.acuta樣品檢測到5個單倍型（Ca1～5），4個C.feriatus樣品中檢測到3個單倍型（Cf1～3）、C.japonica、D.dehaani、P.trituberculatus檢測出單倍型（Cj1～2、Dd1～2、Pt）數(shù)依次為2、2、1。

通過MEGA 5.0軟件計算6種蟹類COI序列的堿基組成（表2），T、C、A、G的平均含量分別為25.3%、18.2%、362%和20.3%，A+T的平均含量為61.5%。6種蟹類COI基因A+T含量為58.9%～64.1%，明顯高于G+C含量，與甲殼類等無脊椎動物COI基因片段結(jié)構(gòu)相似，具有后生動物線粒體基因AT偏倚性[13-14]。

2.3遺傳距離

對所獲6種蟹類COI序列進行遺傳距離分析，由表3可知，6種蟹類種內(nèi)變異較小，遺傳距離處于0.000～0.004，平均值為0.003；種間遺傳距離為0.143～0.235，平均值為0.192，其中P.sanguinolentus與C.acuta種間遺傳距離最高（0.235），C.japonica與C.feriatus遺傳距離最低（0.143）。

2.4系統(tǒng)進化關(guān)系

利用最大似然法構(gòu)建6種蟹類分子進化樹（圖2），支上數(shù)值為1 000次重復抽樣檢驗置信度，如拓撲圖所示，同一物種首先聚類，分子樹分為3個類群，C.japonica、C.feriatus和C.acuta首先聚為1支，P.sanguinolentus、P.trituberculatus聚為1支，D.dehaani獨立為1支。

3討論

Hebert等[15]提出，種內(nèi)遺傳距離很少大于2%，大部分種內(nèi)遺傳距離小于1%，種間遺傳距離大于種內(nèi)遺傳距離是利用COI序列有效鑒別物種關(guān)鍵。該研究中6種蟹類種內(nèi)遺傳距離處于0.000～0.004，平均值為0.003；種間遺傳距離為0.143～0.235，平均值為0.192，種間平均遺傳距離是種內(nèi)的64倍，滿足Hebert等[15]推薦的10倍種內(nèi)變異作為標記物種遺傳分化的標準序列閾值；ML系統(tǒng)進化樹顯示：相同物種個體首先聚類，不存在不同物種個體交叉聚類，鑒別區(qū)分度高，支持形態(tài)學分類結(jié)果。由此表明，以mtDNA COI基因作為6個蟹類品種鑒定的DNA條形碼具有可行性和有效性。此外，基于線粒體COI基因P.sanguinolentus、C.acuta的單倍型較高，適用于群體遺傳多樣性研究。

該研究通過mtDNA COI基因通用型引物COI-L1490/H2198成功對6種浙江沿海常見蟹類進行PCR擴增，表明COI-L1490/H2198型引物在蟹類條形碼研究中具有普遍適用性。研究結(jié)果為浙江沿海蟹類鑒別研究提供一定基礎(chǔ)資料，但僅依靠單個或少數(shù)幾個基因數(shù)據(jù)的比對，尚不足以準確判斷相關(guān)海域物種的群體遺傳多樣性。遺傳距離分析結(jié)果表明，P.trituberculatus與P.sanguinolentus同屬于Portunus spp.，但其遺傳距離（0.196）高于P.trituberculatus與C.feriatus的遺傳距離（0.176）。故而，在研究相關(guān)蟹類群體遺傳多

樣性時，應(yīng)獲取更多的序列片段以完善相關(guān)蟹類基因組數(shù)據(jù)。

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