擬南芥醇腈酶基因在大腸桿菌中的表達優(yōu)化及酶學性質(zhì)分析

繆江林靜洪裴曉林俞冰

1.浙江中醫(yī)藥大學 杭州 310053 2.杭州師范大學

擬南芥醇腈酶基因在大腸桿菌中的表達優(yōu)化及酶學性質(zhì)分析

繆江1林靜洪2裴曉林2俞冰1

1.浙江中醫(yī)藥大學 杭州 310053 2.杭州師范大學

[目的]優(yōu)化重組醇腈酶在大腸桿菌(Escherichia coli)中的表達工藝，考察其酶學性質(zhì)。[方法]基于密碼子的偏好性，對擬南芥(Arabidopsis thaliana)醇腈酶基因進行密碼子優(yōu)化，克隆該基因到表達載體pET-28a(+)上，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-28a(+)-HNL-At。采用單因素法優(yōu)化表達工藝，Ni柱親和層析純化目的蛋白，紫外熒光光度法考察酶學性質(zhì)。[結(jié)果]通過IPTG誘導成功實現(xiàn)來源于擬南芥醇腈酶基因在大腸桿菌中的重組表達，對誘導條件優(yōu)化后，發(fā)酵液中重組酶活力達到29.3U·mL-1，較未優(yōu)化前提高68%。通過Ni柱親和層析對目的蛋白進行純化，經(jīng)SDS-PAGE分析重組醇腈酶相對分子質(zhì)量約為30kDa。通過酶學性質(zhì)分析，最適反應pH為5，最適反應溫度為30℃，比酶活為213.9U·mg-1。[結(jié)論]實現(xiàn)重組醇腈酶在大腸桿菌中的高效表達，優(yōu)化工藝簡單可行，酶學性質(zhì)表征正確，為進一步的酶法制備手性氰醇類化合物奠定基礎。

擬南芥；醇腈酶；大腸桿菌；表達優(yōu)化；酶學性質(zhì)

醇腈酶又稱羥氰裂解酶 (Hydroxynitrile Lyases, HNLs)，在自然界中來源廣泛，能可逆地催化HCN和醛酮類化合物生成手性氰醇化合物[1]。手性氰醇化合物是一類關鍵的中間體，被廣泛應用于常山堿和喜樹堿、抗菌藥甲砜霉素、殺蟲劑擬除蟲菊酯等手性藥物和農(nóng)藥中間體的合成[2-4]。Beate[5]等報道Prunus amygdalus HNL(PaHNL)催化合成(R)-2,2-二甲基-1-氰基丙二醇，產(chǎn)率100%，對映體過量(enantiomeric excess,ee)達97%以上。Manuel[6]等報道Hevea brasiliensis HNL(HbHNL)催化合成(S)-1-[2-(二甲胺)-1-(4-甲氧苯基)乙基]環(huán)己醇，其ee達99%以上。Christoph[7]等報道Manihot esculenta HNL(MeHNL)催化合成(S) -4-甲氧基苯乙醇腈，ee達96%。以醇腈酶作為催化劑，合成(R)或(S)型手性氰醇，具有催化效率高、反應條件溫和、產(chǎn)率和光學純度高、底物適用范圍廣等特點，受到越來越多的關注[8]。

Jennifer[9]等從擬南芥(Arabidopsis thaliana)中發(fā)現(xiàn)一個新型的醇腈酶，它是α/β水解酶家族的第一個(R)選擇性的醇腈酶。與HbHNL和MeHNL序列比對顯示，Arabidopsis thaliana HNL（AtHNL）和前者有70%的序列相似性和45%~47%的序列同源性。Kathrin[10]等報道AtHNL催化合成(R)苯乙醇腈，產(chǎn)率100%，ee達98%以上。Danie[11]等報道AtHNL催化合成(R)-2-氯代苯乙醇腈，產(chǎn)率100%，ee達99%以上。在自然界中，醇腈酶在植物中的表達量非常低，需要復雜的純化工藝才能獲得目的酶蛋白[13]。因此，本文擬通過基因重組技術，構(gòu)建來源于擬南芥其醇腈酶基因的表達載體，通過誘導工藝的優(yōu)化，實現(xiàn)其在大腸桿菌中的過量功能表達。同時，采用親和層析色譜法純化獲得重組蛋白，對其酶學性質(zhì)進行系統(tǒng)表征。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌種和質(zhì)粒 E.coli DH5α，E.coli BL21(DE3)，pET-28a(+)由杭州師范大學生物催化實驗室保存。

1.1.2 主要試劑 限制性內(nèi)切酶 BamHI(批號KB3403BA)、XhoI(批號：CK2101C)、DNA marker(批號A1101A)、protein marker(批號：C2001B)、T4DNA連接酶(批號：K6601AA)由Takara公司提供；質(zhì)粒和膠回收試劑盒購自愛思進公司 (批號：01216KA1)；PCR清潔試劑盒(批號EP101-01)購自北京全式生物技術有限公司；(D)-扁桃腈(批號：547YL-FB)購自梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司；其它試劑均為市售分析純試劑。

1.1.3 培養(yǎng)基配制 LB培養(yǎng)基（質(zhì)量分數(shù)）:胰蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，氯化鈉1%，瓊脂粉2%（固體培養(yǎng)基用）；pH 7.0。LB培養(yǎng)基用于培養(yǎng)重組大腸桿菌，使用時添加卡那霉素終濃度至50μg·mL-1。

1.2 實驗方法

1.2.1 HNL基因的克隆 基于擬南芥醇腈酶基因序列設計引物：上游引物5’-CGGGATCCATGGAACGCAAACATCATTTTGTG-3’(含BamHI位點)，下游引物5’-CCGCTCGAGTTACATATAATCTGTAGCAATAGCGCTT-3’(含XhoI位點)。PCR反應條件為：98℃變性2min；再接著98℃ 10s，58℃ 5s，72℃ 5s，30個循環(huán)；最后72℃延伸5min。PCR引物由上海生工合成，PCR產(chǎn)物跑膠驗證并切膠回收。

1.2.2 重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建 PCR產(chǎn)物經(jīng)雙酶切(BamHI和XhoI)，再與質(zhì)粒pET-28a(+)在22℃連接1h；采用熱激法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coli DH5α感受態(tài)，在含Kan抗性平板上篩選轉(zhuǎn)化子，挑選陽性轉(zhuǎn)化子送鉑尚生物技術(上海)有限公司測序。經(jīng)測序鑒定正確后，再將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coli BL21(DE3)，重組質(zhì)粒命名為pET-28a(+)-HNL-At，菌種保藏至-80℃冰箱。

1.2.3 醇腈酶活力的測定 醇腈酶可催化(D)-扁桃腈裂解為苯甲醛和氫氰酸，前者在280nm處有很高的吸收峰[14]。測定醇腈酶酶活力反應體系：0.7mL 50mmol· L-1乙酸緩沖液(pH 5.5，酶溶解其中)，0.2mL 50mmol· L-1檸檬酸-磷酸緩沖液(pH 3.5，含67mmol·L-1(D)-扁桃腈)，0.1mL酶液，反應中底物終濃度為13.4mmol· mL-1，室溫下反應1min，采用紫外分光光度計(DU730，Beckman)測定吸光度，檢測波長為280nm，即ΔA，每個數(shù)據(jù)重復測3次。以不含酶液的反應體系為對照(ΔA′)。酶活定義：1min(D)-扁桃腈經(jīng)醇腈酶催化生成1μmol苯甲醛酶的量定義為1U。

1.2.4 誘導表達和條件優(yōu)化 將工程菌接種于10mL LB培養(yǎng)基(含Kan抗性)中，37℃，220r/mim震蕩培養(yǎng)12~16h。取培養(yǎng)的菌液，按1%的接種量接種于三角瓶含有100mL LB培養(yǎng)基中，37℃，220r/mim震蕩培養(yǎng)2~3h，至合適的OD600(一般為0.6)，分別對誘導強度(0.168、0.336、0.504、0.672、0.840、1.008mmol·L-1)，誘導溫度(18℃、22℃、26℃、30℃、33℃、37℃)，誘導時間(3h、6h、9h、12h、15h)和誘導時機(OD6000.3、OD600=0.6、OD600=0.9、OD600=1.2)進行優(yōu)化。

1.2.5 重組HNL的純化 用結(jié)合緩沖液(Binding Buffer)(20mmol·L-1pH 7.5磷酸鈉緩沖液，500mmol· L-1NaCl，50mmol·L-1咪唑)重懸靜息細胞，置于冰浴中，采用超聲進行細胞破碎。12000×g離心20min，收集細胞破壁上清液，經(jīng)0.22μm濾膜過濾。采用Ni親和層析柱(Ni-chelating column)進行蛋白純化流程：用10倍柱體積Binding Buffer平衡柱子，再將30mL破壁上清液緩緩上樣，上樣完成后停留1h；10倍柱體積Binding Buffer洗去沒有結(jié)合的雜蛋白，流出液留樣；用洗脫液緩沖液(Elution Buffer)(20mmol·L-1pH 7.5磷酸鈉緩沖液，500mmol·L-1NaCl，250mmol·L-1咪唑)收集目的蛋白，流出液留樣。Bradford法測定蛋白濃度，采用SDS-PAGE分析重組HNL的表達和純化過程。

1.2.6 最適pH值 底物 (D)-扁桃腈在pH分別為3.5、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0的緩沖溶液中，按酶活測定方法測定酶活，計算相對酶活力。

1.2.7 最適反應溫度及熱穩(wěn)定性 純化后的HNL在不同溫度：15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃，測定最適反應溫度，并在30℃、40℃、50℃、60℃下進行保溫，每隔30min檢測剩余酶活。計算相對酶活力。

1.2.8 動力學參數(shù)Km和Vmax值測定 底物(D)-扁桃腈在pH5.5緩沖液下分別配成不同濃度：0.743、0.867、1.040、1.300、1.733、2.600、5.200、10.400μmol·mL-1。在最適反應條件下，按酶活測定方法測定酶活。做雙倒數(shù)圖，計算Km和Vmax值。

2 結(jié)果

2.1 重組HNL表達質(zhì)粒的構(gòu)建和驗證 以質(zhì)粒pET-24a(+)-HNL-At（實驗室保藏）為模板，PCR擴增得到特征DNA片段，大小為777bp，與目的HNL基因大小相符，結(jié)果(圖1-A)。與pET28a(+)連接獲得重組HNL表達質(zhì)粒pET-28a(+)-HNL-At。測序結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒pET-28a(+)-HNL-At中HNL基因序列與目的基因序列相似度為100%。表達質(zhì)粒pET-28a(+)-HNL-At經(jīng)雙酶切驗證所示，獲得5329bp和774bp的兩條帶，結(jié)果（圖1-B）。該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E. coli BL21(DE3)獲得基因工程菌。經(jīng)初步誘導表達，該基因工程菌顯示出明顯的醇腈酶活力，進一步證明重組質(zhì)粒pET-28a(+)-HNL-At的正確性。

圖1 PCR產(chǎn)物的驗證，重組質(zhì)粒pET-28a(+)-HNL-At的酶切驗證Fig.1 Identification of PCR products,enzyme digestion of recombinant plasmid pET-28a(+)-HNL-At

2.2 工程菌的表達條件優(yōu)化

2.2.1 誘導強度對重組蛋白表達的影響 取培養(yǎng)的菌液，按1%轉(zhuǎn)接于50mL培養(yǎng)基中，于37℃擴大培養(yǎng)至OD600=0.6，誘導溫度為18℃。加異丙基硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG)終濃度分別至0.168、0.336、0.504、0.672、0.840和1.008mmol·L-1；誘導12h后測細胞干重，靜息細胞經(jīng)超聲波破碎后測粗酶活，結(jié)果（圖2-A）。IPTG能有效提高外源基因的表達，IPTG誘導終濃度為0.504mmol·L-1時，酶活最高。

2.2.2 誘導溫度對重組蛋白表達的影響 取培養(yǎng)的菌液，按1%轉(zhuǎn)接于50mL培養(yǎng)基中，于37℃擴大培養(yǎng)至OD600=0.6，加IPTG終濃度至0.504mmol·L-1，分別在18℃、22℃、26℃、30℃、33℃，37℃誘導12h。誘導后測細胞干重，靜息細胞經(jīng)超聲波破碎后測酶活，結(jié)果（圖2-B）。高溫和低溫都不利于醇腈酶可溶表達，30℃是該酶最適合的誘導溫度。

2.2.3 誘導時間對重組蛋白表達的影響 取培養(yǎng)的菌液，按1%轉(zhuǎn)接于50mL培養(yǎng)基中，于37℃擴大培養(yǎng)至OD600=0.6，誘導溫度為30℃，IPTG終濃度0.504mmol· L-1，分別誘導3h、6h、9h、12h、15h，誘導完后測細胞干重，結(jié)果顯示誘導6h時酶活最大（2-C）。在誘導前期，酶活隨誘導時間增加而上升，6h后酶活趨于穩(wěn)定。

2.2.4 誘導時機對重組蛋白表達的影響 取培養(yǎng)的菌液，按1%轉(zhuǎn)接于50mL培養(yǎng)基中，于37℃擴大培養(yǎng)至OD600=0.3、OD600=0.6、OD600=0.9，OD600=1.2時開始誘導6h，誘導溫度為30℃，IPTG終濃度0.504mmol·L-1誘導完成后測細胞干重。由圖2-D可知，誘導時機為OD600=0.9時，酶活最高。

2.3 HNL蛋白的表達和純化 按優(yōu)化后的條件，取培養(yǎng)的菌液，按1%轉(zhuǎn)接于600mL培養(yǎng)基培養(yǎng)至OD600=0.9，加IPTG至終濃度為0.504mmol·L-1，30℃誘導6h。4℃收集的菌體，去離子水清洗1~2次，取超聲波破碎后的上清，按1.2.3所述方法測粗酶活。上清經(jīng)0.22μm濾膜過濾后，按1.2.5所述方法緩慢上樣Ni柱親和層析純化。所得產(chǎn)物經(jīng)脫鹽處理，冷凍干燥得到純化醇腈酶。如圖3所示，SDS-PAGE驗證得到1條30kDa左右的條帶，與目的蛋白大小相符合。

圖2 不同誘導條件對粗酶活的影響Fig.2 Effects of different induction conditions on enzyme activity

圖3 重組醇腈酶SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of recombinant Hydroxynitrile lyase

2.4 純化后HNL的最適pH 純化后的HNL的最適pH，結(jié)果(4-A)。測得HNL最適反應pH為5.0，該酶在弱酸中依然有酶活；但是由于底物在中性及弱堿性中存在較強的自分解，故將考察酶的最適反應pH及酸堿穩(wěn)定性范圍設置在pH 3.0~7.0。pH 4.5~ 6.0之間，該酶有較好的活力，pH 5.0時，HNL比酶活達到最大。

2.5 純化后HNL的最適反應溫度及熱穩(wěn)定性 純化后的HNL的最適反應溫度及熱穩(wěn)定性，結(jié)果（圖4-B）（圖4-C）。在pH5.0時，測得不同反應溫度下HNL的比酶活大小，最適反應溫度為30℃。酶的熱穩(wěn)定較好，30℃、40℃、50℃保溫2.5h，依然有很高的活力，60℃保溫時，酶活半衰期為1.5h左右，6h后基本喪失活力。該酶在60℃以下，有較好的熱穩(wěn)定性。

2.6 純化后HNL的動力學參數(shù)Km和Vmax值為了觀察HNL對底物的特異性，通過非線性回歸方程計算出了HNL的米氏常數(shù) Km值及最大反應速率 Vmax，結(jié)果（4-D）。當酶活力為最高酶活一半時所對應的底物濃度為 0.476mmol-1，即 Km值為0.476mmol-1，Vmax為0.245μmol·mL-1·min-1。

圖4 HNL酶學性質(zhì)表征結(jié)果圖Fig.4 Results of enzymetic properties on HNL

3 討論

據(jù)報道，大約200種植物含有HNLs活性，主要來源于高等植物，如橡膠樹、杏樹、木薯和高粱屬植物等[8]。目前，僅純化和表征了18種不同來源的HNLs蛋白，表現(xiàn)出不同的氨基酸序列和酶學性質(zhì)[7,15-16]。根據(jù)醇腈酶蛋白是否依賴黃素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide,FAD)可分為兩類：氧化還原酶類和α/β水解酶類[8,18]。依賴FAD的HNLs主要來源于薔薇科梅屬和蘋果屬，李亞科，有PaHNL，PmHNL，PsHNL等。此類HNLs的氨基酸序列和氧化還原酶、Zn2+-依賴醇脫氫酶具有較高的同源度，而且在N-端含有序列高度保守的FAD的結(jié)合域[19]。研究發(fā)現(xiàn)，輔酶FAD并不直接參與氧化還原反應，但具有穩(wěn)定酶結(jié)構(gòu)的作用，缺乏輔酶FAD會引起酶的失活[8]。另一類FAD非依賴HNLs屬于α/β水解酶類，主要分布于亞麻科、禾本科、鐵青樹科、大戟科中，有MeHNL，HbHNL，AtHNL等；其中AtHNL是此類中的(R)型醇腈酶。該類酶活性位點位于蛋白質(zhì)內(nèi)部，通過側(cè)面非極性殘基的狹窄通道和外面環(huán)境相連接，含有催化三聯(lián)體：Ser80-His235-Asp207(HbHNL)，Ser80-His236-Asp208(MeHNL)和 Ser81-His236-Asp208(AtHNL)，此類醇腈酶遵循親核反應機制，其中絲氨酸使底物氰醇去質(zhì)子化，組氨酸使產(chǎn)物氰根離子質(zhì)子化，從而完成氰醇的水解反應[8,20-21]。

手性氰醇中含有羥基和氰基官能團，作為手性藥物的重要前體砌塊，可轉(zhuǎn)化為α-羥基酯、α-羥基酸、α-羥基醛、β-羥基酰胺等具有光學活性化合物，如圖5所示[22-27]。

圖5 氰醇的合成及其在化學合成中的應用Fig.5 Cyanohydrin synthesis and its application in chemical synthesis

為了提高Arabidopsis thaliana醇腈酶基因的活性，選擇質(zhì)粒pET-28a(+)作為構(gòu)建載體，本文研究了該基因在Escherichia coli細胞中的表達?；诿艽a子優(yōu)化，通過克隆Arabidopsis thaliana醇腈酶基因，得到了HNL的編碼基因，其開放閱讀框（open reading frame,ORF）長777bp，編碼一個含258個氨基酸的酶蛋白。另外，在N端加上6×His標簽便于分離純化目的蛋白。Ni柱親和層析是實驗室蛋白分離純化的常用方法，具有操作簡便，高效等特點[28]。Ni2+能與目的蛋白中His-tag特異性結(jié)合，將目的蛋白吸附在鰲合了Ni2+的填料上，而不含His-tag的雜蛋白就會隨Binding Buffer流出[29]。

在表達工藝的優(yōu)化中，通過固定其他因素，依次考察不同誘導強度、誘導溫度、誘導時間，誘導時機對HNL蛋白表達的影響。確定誘導強度和誘導溫度是影響目的蛋白的表達的主要因素。IPTG與異乳糖的作用相同，對重組菌表達有較大影響，考慮到低濃度時可容蛋白表達量少，高濃度IPTG可能對細胞有毒性，最終選擇0.504mmol·L-1的IPTG終濃度。溫度較低對大腸桿菌的生長不利，菌體的數(shù)量少導致蛋白表達少，酶活也相應減小。溫度較高有利于菌體生長，但是合成速度太快，以至于蛋白來不及正確的折疊，部分蛋白以包涵體的形式出現(xiàn)。本實驗主要研究可溶性蛋白的表達情況，所以誘導溫度選擇為30℃。實驗表明，隨誘導時間增長，酶活上升到最大后逐漸穩(wěn)定，可能是誘導進入平臺期，也可能是發(fā)酵液中產(chǎn)生抑制酶表達的物質(zhì)；從節(jié)約實驗周期考慮，選取6h作為最適的誘導時間。OD600過大會產(chǎn)生菌種老化現(xiàn)象，不利于重組菌的健康生長和傳代，最終選擇OD600=0.9作為誘導時機。凍干酶粉進行酶學表征，測得酶最適pH為5，低pH能抑制酶的活性，這可能跟酶活性位點及活性口袋周圍的結(jié)構(gòu)有關。該酶的最適溫度與熱穩(wěn)定與報道的其他來源的醇腈酶較為接近，具有良好的熱穩(wěn)定性。Km和Vmax值測定，一般在底物濃度較低時進行,酶和底物的匹配程度是影響動力學參數(shù)Km和Vmax值的主要因素之一。不同酶源或不同底物的Km和Vmax值相差較大[8]。

國內(nèi)外已有許多關于HNLs的報道：不同的酶源已經(jīng)實現(xiàn)在大腸宿主和酵母宿主中表達，酶學性質(zhì)相差較大。Jennifer[9]等人從15L培養(yǎng)中，分離得到1.75Kg菌體，經(jīng)測定AtHNL粗酶活約2.300U·mg-1。Ken-ichi[29]等分離純化得到AtHNL比酶活為99.5U· mg-1。Daniel[30]等對AtHNL基因在大腸肝菌中進行表達，比酶活達到227U·mg-1。本研究通過單因素實驗法優(yōu)化工藝后，以(D)-扁桃腈為底物得到的上清液酶活最高達到29.3U·mL-1，較未優(yōu)化前提高68%，比國外水平有較大提高。另外，粗品中有本底表達的雜蛋白，也可能含有抑制酶活的物質(zhì)，經(jīng)過Ni柱親和層析純化得到純度較高的醇腈酶，比酶活可達到213.9U· mg-1，比國外水平有提高。該酶的高效表達及酶學性質(zhì)的表征，為合成手性氰醇提供了基礎，這也是下一步工作的重點。

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Efficient Expression of Hydroxynitrile Lyase from Arabidopsis Thaliana in Escherichia Coli and Analysis of Recombinant Hydroxynitrile Lyase Enzymetic Proerties

MIAO Jiang1,LIN Jinghong2,PEI Xiaolin2,et al
Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310053)

[Objective]To optimize the technology of heterologous expression of AtHNL in Escherichia coli,and investigated its enzymetic properties.[Method]Based on the bias of codon,we optimized the codon of HNL gene from Arabidopsis thaliana,and the fragment of HNL gene was amplified by PCR.Using pET-28a(+)as vector,the recombinant plamisd pET-28a(+)-HNL-At was constructed.Optimization of heterologous expression level was enhanced by single factor experiment method,the recombinant protein was purified by Ni-chelating column.Investigated the activity of AtHNL by UV.[Results]Recombinant HNL was successfully expressed in Escherichia coli by IPTG,the maximum activity of AtHNL was reached 29.3U·mL-1in the fermentation broth,promoted to 68%compared with unoptimization.Then,the protein was purified by Ni-chelating column,SDS-PAGE analysis showed that the molecular weight of the AtHNL was 30kDa.The optimal activity was determined at pH 5.0 and 30℃ was 213.9U·mg-1.[Conclusion]Recombinant HNL was expressed highefficiently in Escherichia coli,and the expression technology was simple and feasible.The properties of recombinant HNL were correct,which provided the reliable foundation to further enzymatic preparation of chiral cyanohydrins.

Arabidopsis thaliana;Hydroxynitrile lyase;Escherichia coli;expression optimization;enzymetic properties

R282.71

：A

：1005-5509（2017）05-0408-08

10.16466/j.issn1005-5509.2017.05.015

2016-12-26）

中國博士后科學基金(163936)

Fund project:China postdoctoral scientific foundation(163936)

俞冰，E-mail:zjtcmyubing@126.com