劉 洪 劉海玲 彭文劍 肖緯宇

(湛江市第二人民醫(yī)院腫瘤科，廣東 湛江 524012)

自噬基因Beclin1和微管相關(guān)蛋白輕鏈3與胃癌的關(guān)系研究*

劉 洪 劉海玲 彭文劍 肖緯宇

(湛江市第二人民醫(yī)院腫瘤科，廣東 湛江 524012)

目的 研究胃部非癌組織、胃部癌旁組織與胃部癌組織中自噬基因Beclin1和微管相關(guān)蛋白輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3, MAPLC3)基因的表達(dá)含量，確定Beclin1和MAPLC3表達(dá)含量與胃癌之間的聯(lián)系。方法 使用實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(Real-Time reverse transcription polymerase chain reaction, Real-Time RT-PCR)檢測(cè)胃部非癌組織、胃部癌旁組織與胃部癌組織中Beclin1以及MAPLC3基因的 mRNA表達(dá)含量。使用蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)方法檢測(cè)胃部非癌組織、胃部癌旁組織與胃部癌組織中Beclin1以及MAPLC3基因的蛋白表達(dá)含量。結(jié)果 與胃部非癌組織相比，胃部癌旁組織Beclin1以及MAPLC3的mRNA含量顯著降低(P<0.01)，胃部癌組織中Beclin1以及MAPLC3的mRNA含量也顯著降低(P<0.01)；與胃部癌旁組織相比，胃部癌組織中Beclin1以及MAPLC3的mRNA含量也顯著降低(P<0.05)。與胃部非癌組織相比，胃部癌旁組織Beclin1以及MAPLC3的蛋白含量顯著降低(P<0.05)，胃部癌組織中Beclin1以及MAPLC3的蛋白含量也顯著降低(P<0.01)；與胃部癌旁組織相比，胃部癌組織中Beclin1以及MAPLC3的蛋白含量也顯著降低(P<0.05)。結(jié)論 自噬相關(guān)基因Beclin1以及MAPLC3的mRNA和蛋白水平在胃癌組織中表達(dá)降低，這提示自噬相關(guān)基因與胃癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。

自噬基因；Beclin1；微管相關(guān)蛋白輕鏈3；胃癌

自噬機(jī)制是細(xì)胞進(jìn)行物質(zhì)代謝的一種重要方式，其廣泛存在于單細(xì)胞生物以及多細(xì)胞的動(dòng)、植物中，有效組成機(jī)體的降解和再循環(huán)系統(tǒng)。當(dāng)自噬調(diào)控機(jī)制出現(xiàn)失常時(shí)可以引發(fā)多種疾病，包括惡性腫瘤、自身免疫病、肌細(xì)胞功能失調(diào)以及衰老等病癥[1]。自噬與腫瘤之間的關(guān)系研究成為現(xiàn)如今比較熱門的研究方向，自噬與腫瘤之間的關(guān)系研究存在不盡相同的觀點(diǎn)[2-3]。Beclin1和微管相關(guān)蛋白輕鏈3 (MAPLC3)這2種基因參與編碼自噬相關(guān)的蛋白，在自噬過(guò)程中發(fā)揮重要作用[4]。本研究通過(guò)檢測(cè)胃部非癌組織、胃部癌旁組織以及胃部癌組織中Beclin1和MAPLC3含量來(lái)確定自噬與胃癌之間的聯(lián)系，對(duì)研究結(jié)果進(jìn)行探究。

1 資料與方法

1.1 患者資料以及標(biāo)本采集 我院2015年3月至2016年8月收治的5例胃癌患者，所有患者均經(jīng)過(guò)病理學(xué)檢查得以確診，5例患者手術(shù)前均為接受過(guò)化療或者放療治療。選取5例患者的胃癌組織、距腫瘤邊緣2 cm左右的癌旁組織以及距腫瘤邊緣超過(guò)5 cm的非癌組織。手術(shù)切除的組織標(biāo)本迅速適應(yīng)冰生理鹽水洗凈，然后迅速放入EP管中并及時(shí)儲(chǔ)存于液氮中備用。

1.2 主要試劑 Beclin1(美國(guó)Santa Cruse公司)一抗為山羊抗人，一抗?jié)舛葹?∶500；MAPLC3(美國(guó)Santa Cruse公司)一抗為山羊抗人，一抗?jié)舛葹?∶500。堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗(二抗?jié)舛葹?∶1000)敷育后使用NBT/BCIP顯色液膜上顯色并掃描。掃描后使用BIO-RAD公司的Quantity One一維分析軟件進(jìn)行圖像灰度分析。

PCR引物購(gòu)自上海生工上海生工生物工程有限公司。逆轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒購(gòu)自Thermo公司。SYBR Premix Ex TaqTM II購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司(TaKaRa Code：DRR820A)。

1.3 RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄以及實(shí)時(shí)定量RT-PCR方法 選取1 mm的凍存標(biāo)本進(jìn)行剪碎并研磨，使用1 ml的invitrogen公司的Trizol溶液進(jìn)行裂解，按照invitrogen公司的產(chǎn)品說(shuō)明書使用一步法提取總RNA,然后使用分光光度計(jì)測(cè)定RNA的濃度以及純度。使用Thermo公司的試劑以及產(chǎn)品說(shuō)明書合成cDNA以備用，使用GAPDH作為內(nèi)參，引物序列為: 5′-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3′(上游),5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′(下游)。Beclin1序列為: 5′-ATCCTGGACCGTGTCACCATCCAGG-3′(上游) , 5′-GTTGAGCTGAGTGTCCAGCTGG-3′(下游)；MAP-LC3序列為: 5′-GAAGATGTCCGACTTATTCGAGAG-3′(上游), 5′-ACTCTCATACACCTCTGAGATTGG-3′(下游)。反應(yīng)體系如下：(1)在0.2 ml PCR管中加入以下試劑：5 ml total RNA，1 ml Random Primer p(dN)6(0.2 mg/ml)，5 ml Rnase-free ddH2O；(2)70°C溫浴5 min；(3) 冰浴10 s，離心后加入以下試劑：4.0 ml 5×Reaction Buffer，2.0 ml dNTP Mix(10 mmol/L)，1.0 ml Rnase inhibitor(20 U/ml)，2.0 ml AMV Reverse Transcriptase(10 U/ml)，20.0 ml Total volume；(4)37 ℃加熱塊中溫浴5 min；(5)42 ℃加熱塊中溫浴60 min；(6)70 ℃加熱塊中溫浴10 min，冰浴終止反應(yīng)；(7)逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA在-80 ℃保存。

實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)體系：反應(yīng)體系包括：2×SYBRGreen qPCR Master Mix 10 μl, 1 μl的10 μM上游引物, 1 μl的10 μM下游引物，7 μl的ddH2O, 1 μl的模板cDNA,配置成20 μl的總反應(yīng)體系。反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min(一個(gè)循環(huán))；95 ℃，15 s, 60 ℃，40 s(40個(gè)循環(huán))。

1.4 Western blot檢測(cè) 組織樣品研磨后進(jìn)行蛋白定量，然后使用2X的蛋白裂解液 loading buffer冰上裂解蛋白，實(shí)驗(yàn)前用沸水煮5～10 min, 使用10%的SDS-PAGE電泳，20 μg的蛋白上樣量，恒壓15 V半干式電轉(zhuǎn)儀進(jìn)行電轉(zhuǎn)(使用醋酸纖維膜)。5%脫脂奶粉封閉1 h后加一抗過(guò)夜。次日使用1×TBST洗膜3次(每次10 min)，加入二抗(1∶1000)，在室溫敷育2 h。1×TBST洗膜3次后使用NBT/BCIP顯色液膜上顯色并掃描。掃描后使用BIO-RAD公司的Quantity One一維分析軟件進(jìn)行圖像灰度分析(用GAPDH作為內(nèi)參)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS18.0作統(tǒng)計(jì)學(xué)分析, RT-PCR和Western blot結(jié)果使用F檢驗(yàn)(單向方差分析),α=0.05作為顯著性檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1 胃部非癌組織、胃部癌旁組織與胃部癌組織中Beclin1的mRNA相對(duì)表達(dá)含量 與胃部非癌組織相比，胃部癌旁組織Beclin1的mRNA含量顯著降低(P<0.01)，胃部癌組織中Beclin1的mRNA含量也顯著降低(P<0.01)；與胃部癌旁組織相比，胃部癌組織中Beclin1的mRNA含量也顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

圖1 胃部非癌組織(normal)、癌旁組織(adjacent non-

2.2 胃部非癌組織、胃部癌旁組織與胃部癌組織中MAPLC3的mRNA相對(duì)表達(dá)含量 與胃部非癌組織相比，胃部癌旁組織MAPLC3的mRNA含量顯著降低(P<0.01)，胃部癌組織中MAPLC3的mRNA含量也顯著降低(P<0.01)；與胃部癌旁組織相比，胃部癌組織中MAPLC3的mRNA含量也顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)圖2。

圖2 胃部非癌組織(normal)、癌旁組織(adjacent non-

2.3 胃部非癌組織、胃部癌旁組織與胃部癌組織中Beclin1的蛋白相對(duì)表達(dá)含量 與胃部非癌組織相比，胃部癌旁組織Beclin1的蛋白含量顯著降低(P<0.05)，胃部癌組織中Beclin1的蛋白含量也顯著降低(P<0.01)；與胃部癌旁組織相比，胃部癌組織中Beclin1的蛋白含量也顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)圖3。

2.4 胃部非癌組織、癌旁組織與癌組織中MAPLC3的蛋白相對(duì)表達(dá)含量 與胃部非癌組織相比，胃部癌旁組織MAPLC3的蛋白含量顯著降低(P<0.05)，胃部癌組織中MAPLC3的蛋白含量也顯著降低(P<0.01)；與胃部癌旁組織相比，胃部癌組織中MAPLC3的蛋白含量也顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)圖4。

圖3 胃部非癌組織(normal)、癌旁組織(adjacent non-cancerous)以及癌組織(tumor)中Beclin1的蛋白表達(dá)含量

圖4 胃部非癌組織(normal)、癌旁組織(adjacent non-cancerous)以及癌組織(tumor)中MAPLC3的蛋白表達(dá)含量

3 討 論

自噬現(xiàn)象普遍存在于各種細(xì)胞，參與細(xì)胞的增殖、生長(zhǎng)以及腫瘤發(fā)生等過(guò)程。自噬可以促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)大分子的循環(huán)利用，對(duì)受損細(xì)胞器進(jìn)行清除，有效促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)[5]。自噬是細(xì)胞器以及大分子蛋白降解的重要途徑，ATG系列基因則與自噬體的形成密切相關(guān)[6]。

Beclin1是ATG6的同系物,在哺乳動(dòng)物中作為特異性基因參與自噬過(guò)程。Beclin1基因位于人類染色體17q21上,該基因與Ⅲ型PI3K結(jié)合形成復(fù)合體，復(fù)合體可以有效調(diào)節(jié)其他的ATG蛋白，調(diào)節(jié)ATG蛋白在自噬前體結(jié)構(gòu)中定位，對(duì)自噬活性進(jìn)行調(diào)節(jié)[7]。Beclin1作為抑癌基因，參與腫瘤的發(fā)生與發(fā)展，卵巢癌、乳腺癌以及前列腺癌細(xì)胞中存在Beclin1基因缺失或者突變。敲除Beclin1等位基因后小鼠自發(fā)性惡性腫瘤的發(fā)生概率顯著上升，也易受到HBV造成的損傷[8]。

MAPLC3是ATG8基因的同源物，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中廣泛存在，在前自噬泡以及自噬泡膜表面顯著表達(dá)，在自噬體的形成過(guò)程中發(fā)揮重要作用，可以作為自噬體的特異性標(biāo)記蛋白[9]。MAPLC3在自噬泡形成過(guò)程中參與了由Atg家族組成的兩條泛素樣蛋白的修飾與加工過(guò)程。自噬泡形成后MAPLC3繼續(xù)與自噬泡膜表面結(jié)合并發(fā)揮重要作用[10]。

自噬相關(guān)基因在腫瘤的不同發(fā)展階段表達(dá)含量不盡相同，不同的研究者的研究結(jié)果并不完全一致。本研究通過(guò)檢測(cè)胃部非癌組織、胃部癌旁組織與胃部癌組織中自噬相關(guān)基因Beclin1和MAPLC3的表達(dá)，確定自噬相關(guān)基因Beclin1和MAPLC的mRNA和蛋白的表達(dá)情況。Beclin1和MAPLC3的mRNA和蛋白的表達(dá)含量在胃癌組織中顯著下降，這一研究結(jié)果提示肺癌組織、細(xì)胞中自噬現(xiàn)象顯著下降。這一研究結(jié)果也與自噬可以抑制腫瘤發(fā)生、發(fā)展研究結(jié)果相同，阻斷自噬則會(huì)導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生與發(fā)展，而惡性腫瘤中的自噬相關(guān)基因出現(xiàn)單染色體缺失,表達(dá)含量出現(xiàn)顯著降低。自噬可以有效調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化物的含量，有效保持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，促進(jìn)蛋白代謝紊亂狀態(tài)有效恢復(fù)，有效抑制腫瘤的發(fā)展。此外，自噬可以降低氧化應(yīng)激,降低致瘤性突變的發(fā)生。此外，PI3K以及mTOR等信號(hào)通路與自噬的抑制與發(fā)生密切相關(guān)，mTOR信號(hào)通路中的很多抑癌基因(TSC2、PTEN以及p53)等可以有效促進(jìn)細(xì)胞自噬[11]。

我們的研究結(jié)果與這些報(bào)道結(jié)果一致?？梢哉J(rèn)為，自噬相關(guān)基因Beclin1以及MAPLC3的mRNA和蛋白水平在胃癌組織中表達(dá)降低,這提示自噬相關(guān)基因與胃癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。

[1] 李冉,李磊,劉江,等. Beclin 1與LC3蛋白在腮腺多形性腺瘤及腮腺癌在多形性腺瘤中的表達(dá)和意義[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2012,13(13):1293-1296.

[2] 張晶,舒麗莎,張林西.自噬通路中mTOR和Beclin1與腫瘤關(guān)系的研究進(jìn)展[J].河北醫(yī)藥,2016,18(12):2837-2840+2844.

[3] 唐楊烽,韓林,徐激斌,等. A型主動(dòng)脈夾層組織Beclin1及微管相關(guān)蛋白1輕鏈3的表達(dá)及意義[J].第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2013,9(19):946-948.

[4] 劉斌,唐靜,袁敏,等.血管性癡呆大鼠海馬CA1區(qū)自噬及微管相關(guān)蛋白1輕鏈3的表達(dá)[J].第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2013,9(13):940-945.

[5] 張娟,趙曼曼,李冉,等.微管相關(guān)蛋白1輕鏈3及Beclin-1在硅沉著病大鼠肺泡巨噬細(xì)胞中的表達(dá)[J].解剖學(xué)報(bào),2014,5(7):646-651.

[6] 劉金霞,馬原源,劉斌,等.微管相關(guān)蛋白1輕鏈3Ⅱ與微管相關(guān)蛋白2在血管性癡呆大鼠海馬CA1區(qū)的表達(dá)[J].中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐,2015,5(31):497-500.

[7] 張建凱,張小平,褚迎欣.自噬基因微管相關(guān)蛋白1輕鏈3、Beclin 1在饑餓大鼠心肌中的表達(dá)及意義[J].疑難病雜志,2015,7(14):719-722+771.

[8] 丁艷菊,陸爽,吳君,等.藍(lán)莓對(duì)肝纖維化大鼠肝組織自噬相關(guān)蛋白LC3和Beclin1表達(dá)的影響[J].世界華人消化雜志,2016,9(6):1321-1330.

[9] 俞雪鋒,蔣曦,王國(guó)康,等.阿魏酸對(duì)脊髓損傷大鼠微管相關(guān)蛋白輕鏈3、Beclin1、Bcl-2和Bax表達(dá)的影響[J].中國(guó)藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志,2016,7(14):714-722.

[10] Zhang Z, Tian H, Miao Y,et al.Functional results of microvascular reconstruction after hemiglossectomy: free anterolateral thigh flap versus free forearm flap[J]. Biochemistry (Mosc)， 2016,81(6):574-582.

[11] Rodriguez M, Kaushik A, Lapierre J,et al. Electro-Magnetic Nano-Particle Bound Beclin1 siRNA Crosses the Blood-Brain Barrier to Attenuate the Inflammatory Effects of HIV-1 Infection in Vitro[J].J Neuroimmune Pharmacol，2016,15(5):351-355.

The study on the relationship of Beclin1 and microtubule associated protein light chain 3 with gastric cancer

LIU Hong LIU Hai-ling PENG Wen-jian XIAO Wei-yu

(Center of Oncology, the Second People's Hospital of Zhanjiang, Zhanjiang, Guangdong 524012, China)

Objective: To study the non stomach cancer tissue, autophagy gene Beclin1 and microtubule stomach tissues and gastric cancer associated protein light chain 3 (microtubule-associated protein 1 light chain 3, MAPLC3) expression levels of genes, and determine Beclin1 and MAPLC3 expression between gastric cancer and content contact. Methods: The real-time reverse transcription polymerase (Real-Time reverse transcription poly chain reaction Merase chain reaction, Real-Time RT-PCR) was used to detect gastric non cancer tissues, Beclin1 stomach tissues and the stomach cancer tissue and MAPLC3 gene mRNA expression content. Using Western blotting (Western blot) method was used for detection of gastric non cancer tissue the expression of Beclin1 of gastric tissues and gastric cancer tissues, MAPLC3 protein content. Results: Compared with non stomach cancer, the mRNA contents of stomach cancer tissues and Beclin1 MAPLC3 were significantly decreased (P<0.01), stomach carcinoma Beclin1 and MAPLC3 content of mRNA was lower (P<0.01); and stomach carcinoma, stomach carcinoma Beclin1 and MAPLC3 content of mRNA was lower (P<0.05). Compared with the non stomach cancer tissue, stomach cancer adjacent tissue Beclin1 and MAPLC3 protein content was significantly reduced (P<0.05), gastric carcinoma Beclin1 and MAPLC3 protein content also decreased significantly (P<0.01); Compared to noncancerous tissues, gastric carcinoma Beclin1 and MAPLC3 protein content also decreased significantly (P<0.05). Conclusion: The autophagy related gene Beclin1 and MAPLC3 mRNA and protein expression decrease in gastric cancer tissues, suggesting that autophagy related genes are closely related with gastric carcinogenesis and development.

autophagy gene; Beclin1; microtubule associated protein light chain 3; gastric cancer

劉洪，男，主治醫(yī)師，主要從事腫瘤內(nèi)科化療工作。

R735.2

A

1004-7115(2017)05-0484-04

10.3969/j.issn.1004-7115.2017.05.002

2016-12-03)