麥旦提, 楊 嬋, 薛 蕓, 王 彥, 閻 超

(上海交通大學藥學院, 上海 200210)

研究論文

基于花生四烯酸代謝通路研究水飛薊素對脂多糖誘導炎癥模型影響

麥旦提, 楊 嬋, 薛 蕓, 王 彥*, 閻 超*

(上海交通大學藥學院, 上海 200210)

以脂多糖類似物(KLA)誘導的RAW264.7細胞為研究對象,采用代謝組學研究手段,研究水飛薊素對脂多糖誘導炎癥模型中花生四烯酸代謝通路的影響。以超高效液相色譜-三重四極桿質譜聯用為平臺,對不同濃度水飛薊素作用下KLA誘導RAW264.7炎癥細胞分泌的類二十烷酸代謝物進行定量分析,通過考察主成分分析(PCA)、正交偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA)的VIP值和Kruskal-Wallis秩和檢驗結果顯著性差異(P)值篩選代謝標記物。建立了59種類二十烷酸(含15種同位素內標)在5 min內實現快速分離的液相色譜-質譜聯用方法;確定了細胞存活率在58%～80%的水飛薊素濃度為50～150 μmol/L;篩選出數據處理結果同時滿足變異權重參數(VIP)值>1且結果P值<0.05的類二十烷酸代謝標記物12-OxoLeukotriene B4(12-OxoLTB4);通過分析柱狀圖和炎癥信號通路,確定水飛薊素借助其抗氧自由基特性發(fā)揮抗炎作用,通過抑制脂氧合酶-5 (5-LOX)的活性及阻斷5-LOX代謝通路中產生氧自由基的脂質過氧化反應來減少氧自由基及過氧化物的形成。綜上所述,所建立的方法能快速準確地定量分析多種類二十烷酸,并從代謝組學角度解釋了水飛薊素的抗炎機制。

超高效液相色譜-串聯質譜;類二十烷酸;同位素內標;水飛薊素;代謝組學;炎癥

炎癥是人類多種疾病中最常見的一種病理過程,在機體的任何部位和任何組織均有可能發(fā)生,而花生四烯酸代謝網絡是產生炎癥介質的主要網絡。類二十烷酸(eicosanoids),也稱類花生酸,是一大類由二十碳的多不飽和脂肪酸氧化產生的具有生物活性的物質。類二十烷酸是體內重要的炎癥因子,參與機體免疫及炎癥反應過程,并在許多疾病的病理生理過程中起著重要的作用。

中藥因其具有抗炎效果好、不良反應少、來源豐富等優(yōu)勢,在抗炎藥物的開發(fā)中越來越受到人們的重視。水飛薊(SilybummarianumL. Gaertn.)原產于南歐、北非[1],在歐洲是一種民間草藥,用于肝膽疾病的治療,并已成為世界各國使用的保肝植物藥。水飛薊素(silymarin, Sily)是從水飛薊種子中提取的一種黃酮木脂素類化合物,是一種淡黃色粉末狀物質,主要活性成分有水飛薊賓(silybin)、異水飛薊(isosilybin)、水飛薊寧(silydianin)、水飛薊亭(silychristin)。其中,以水飛薊賓含量最高,活性也最強,具有保肝利膽、抗脂質過氧化、清除自由基、抗輻射、抗腫瘤、降血脂和抗胃潰瘍等藥理學效應[2]。此外水飛薊素還具有抗炎和免疫調節(jié)作用。Fiebrich和Koch[3]報道了水飛薊素的抗炎作用源于其抗氧自由基的作用,另外還有研究[4]采用動物實驗證明了水飛薊素可以通過抑制脂氧合酶-5 (5-LOX)通路的過氧化酶的活性發(fā)揮抗炎作用。

類二十烷酸的分析方法有酶免疫分析法、液相色譜分析法、色譜-質譜聯用分析法等。三重四極桿質譜儀是類二十烷酸定量分析最常用的分析儀器,具有很好的靈敏度和專屬性[5]。由于類二十烷酸的結構中存在一個羧基,在質譜電離過程中易帶負電,因此,在液相色譜-質譜的聯用分析中,通常選用負離子模式。三重四極桿質譜具有強大的定量能力,其多反應監(jiān)測(multiple reaction monitoring, MRM)的采集模式通過選擇性地采集母離子(precursor ion)和相對應的特征子離子(product ion),可以對共流出的不同種類的類二十烷酸和同分異構的類二十烷酸進行選擇性檢測[6]。故本次實驗采用超高效液相色譜-三重四極桿質譜(UPLC-MS/MS)測定類二十烷酸。

脂質組學的概念于2003年首次被提出,它作為代謝組學的一個分支對所有脂類物質進行系統研究[7,8]。脂肪酸是脂質的一個重要組成部分,脂肪酸及其氧化代謝物(類二十烷酸)參與生命體內的多種生理調節(jié)過程。而組學作為一種系統的研究方法,能直接反映體內生物化學過程和狀態(tài)變化[9],因此,針對炎癥的研究,從組學角度對脂肪酸及其氧化代謝產物類二十烷酸進行研究,能直接反映并且更準確地解釋抗炎成分在炎癥中的作用機制,有助于對炎癥發(fā)生、發(fā)展、治愈的認識。目前還沒有從代謝組學的角度去解釋和驗證水飛薊素抗炎作用的研究。本研究基于超高效液相色譜-三重四極桿質譜平臺,優(yōu)化質譜參數,建立了針對59種花生四烯酸代表性代謝物的定量分析方法;以Kdo2-Lipid A誘導下的RAW264.7細胞炎癥模型為研究對象,優(yōu)化中藥活性作用炎癥模型濃度,并采用目標組學方法,研究水飛薊素影響脂多糖誘導炎癥模型細胞中類二十烷酸的代謝變化,闡述水飛薊素活性成分的抗炎活性作用機制。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

超高效液相色譜-三重四極桿質譜系統(ACQUITYTMUPLC,美國沃特世公司;SCIEX Triple QuadTM5500 System,美國愛博才思公司),低速離心機(上海安亭科學儀器廠), REACTI-THERM III氮氣吹干儀(賽默飛世爾科技有限公司), SHB-III循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿有限公司), SPE真空抽濾裝置(德國CNW科技公司),倒置顯微鏡(奧林巴斯有限公司), CO2培養(yǎng)箱(賽默飛世爾科技有限公司), Costar六孔板培養(yǎng)皿和100 mm×20 mm培養(yǎng)皿(康寧公司),Strata-X固相萃取柱(美國菲羅門科學儀器有限公司)。

44種類二十烷酸及15種氘代類二十烷酸標準品均購自美國艾美捷公司,色譜級甲醇和乙腈購自德國默克化工,色譜級異丙醇、無水乙醇和乙酸購自德國CNW科技公司。水飛薊素購自上海源葉生物科技有限公司(純度≥80%, 批號65666-07-1)。胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、Gibco無酚紅細胞培養(yǎng)基(Dulbecco’s Modified Eagle Medium, DMEM)、雙抗(青霉素-鏈霉素)、磷酸鹽緩沖液(PBS)購自賽默飛世爾科技有限公司,RAW264.7細胞購自中國科學院上海細胞庫。

1.2 建立脂多糖類似物(KLA)誘導的炎癥模型及水飛薊素干預RAW264.7細胞的濃度篩選

使用含10%(v/v)FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基,在37 ℃、5%(v/v) CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)RAW264.7細胞。將處于對數生長期的細胞轉入96孔板中,使每孔中的細胞數為1×104,待細胞貼壁后,分為正常組、炎癥組、藥物處理組5組,每組設置5個復孔。藥物處理組加入不同濃度的含藥培養(yǎng)基使其總體積達到100 μL,正常組和炎癥組加入等體積空白培養(yǎng)基,1 h后,除正常組外,其他組均加入KLA致炎,終質量濃度為100 ng/mL,加藥組的水飛薊素終濃度分別為20、50、100、150、200 μmol/L。經過藥物刺激24 h后,再在每孔中加入20 μL 5 mg/mL的四甲基偶氮唑鹽(MTT)的PBS溶液,繼續(xù)置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h。培養(yǎng)結束后,用2 mL的針頭小心棄去孔板中的上清液,再在每孔中加入150 μL二甲基亞砜(dimethylsulfoxide, DMSO)充分振蕩,溶解沉積在細胞中的藍紫色結晶甲瓚(formazan),使用多功能酶標儀測定490 nm處的光密度(吸光度,OD值)。

1.3 水飛薊素干預下的KLA誘導RAW264.7細胞中類二十烷酸的代謝分析

將處于對數生長期的細胞轉入六孔板中,使每孔中的細胞數為5×105,待細胞貼壁后,分為正常組、炎癥組、低濃度藥物處理組、中濃度藥物處理組、高濃度藥物處理組,每組設置3個復孔。藥物處理組加入不同濃度的含藥培養(yǎng)基使其總體積達到2 mL,正常組和炎癥組加入等體積空白培養(yǎng)基,放置在5% CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),1 h后,除正常組外,其他組均加入KLA致炎,使終質量濃度為100 ng/mL,正常組加入等量磷酸鹽緩沖液,此時加藥組中水飛薊素的終濃度為50、100和150 μmol/L。將以上各組樣品放置在5% CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.4 細胞培養(yǎng)基中類二十烷酸的提取方法

藥物作用結束后,吸取細胞培養(yǎng)基,以800 r/min低速離心5 min,以去除培養(yǎng)基中的細胞殘骸。吸取上清液,加入100 μL 0.1 ng/μL氘代類二十烷酸標準溶液,渦旋混勻后進行固相萃取。RAW264.7細胞用磷酸鹽緩沖液清洗兩遍,吹打,進行細胞計數。

固相萃取:分別使用3 mL甲醇和3 mL水對Strata-X固相萃取柱進行清洗和預平衡。上樣后,加入2 mL 10%(v/v)的甲醇水溶液進行洗滌,以去除雜質,最后,使用1 mL甲醇對固相萃取柱上的類二十烷酸進行洗脫。收集洗脫液,氮氣吹干,并用100 μL流動相A相復溶后進行UPLC-MS/MS分析。

1.5 UPLC-MS/MS條件

UPLC條件 ACQUITY UPLC BEH Shield RP18柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm);流動相A相為乙腈-水-乙酸(60∶40∶0.02, v/v/v),流動相B相為乙腈-異丙醇(50∶50, v/v);柱溫40 ℃;流速0.4 mL/min。洗脫梯度:0～0.7 min, 0.1%B～20%B; 0.7～4.0 min, 20%B～55%B; 4.0～4.5 min, 55%B～99%B; 4.5～5.0 min, 99%B。進樣量10 μL。

質譜條件 電噴霧離子源(ESI);負離子模式掃描;MRM模式監(jiān)測;氣簾氣(CUR)壓力、霧化氣(GS1)壓力和輔助氣(GS2)壓力分別為172.4、310.3和310.3 kPa,離子源電壓為-4.5 kV,離子源溫度為550 ℃,射入電壓(EP)為-10 V,碰撞室射出電壓(CXP)為-20 V。

1.6 類二十烷酸混合標準溶液的配制

取適量類二十烷酸標準品配制為2.5 ng/μL類二十烷酸的混合標準儲備液。取不同量混合標準儲備液，加入不同體積無水乙醇稀釋到60 μL,類二十烷酸質量梯度分別為0.005、0.015、0.025、0.035、0.05、0.15、0.25、0.35、0.5、1.5、2.5、3.5、5.0 ng,并分別加入10 μL 0.1 ng/μL的氘代類二十烷酸混合標準溶液作為內標。

1.7 定量分析方法

類二十烷酸定量分析方法采用內標法,并使用氘代類二十烷酸標準品作為內標。以類二十烷酸標準品與其對應的氘代內標的峰面積比值和類二十烷酸標準品含量進行線性回歸,得到線性回歸方程,用于后續(xù)樣品中類二十烷酸濃度的計算。定量下限為標準曲線的最低點,在本研究建立的類二十烷酸定量分析方法中,定量下限應使信噪比(S/N)大于7[10]。

1.8 數據處理

將UPLC-MS/MS分析獲得的原始數據通過Analyst 1.6.2軟件進行峰識別和峰面積積分,并進行手動積分校正,得到類二十烷酸及其氘代內標的峰面積比值,再利用標準曲線計算得到不同藥物濃度處理組、炎癥組和正常組的RAW264.7細胞培養(yǎng)基中類二十烷酸的含量。

將新數據表導入SIMCA-P 13.0 (Umetrics, Sweden)進行多元統計變量分析。新數據進行主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA)。在OPLS-DA分析中,花生四烯酸代謝產物含量的變異權重參數(VIP)>1的變量對不同實驗組的分離有影響。此外,通過SPSS軟件(版本IBM 20.0)的Kruskal-Wallis秩和檢驗來確定代謝物差異在單因素分析水平上是否存在顯著性差異(P<0.05)。由VIP>1和P<0.05獲得不同實驗組類二十烷酸的代謝標記物。

2 結果與討論

2.1 類二十烷酸的定量分析方法的建立

2.1.1 類二十烷酸

類二十烷酸可由omega-3多不飽和脂肪酸和omega-6多不飽和脂肪酸氧化生成。例如,多不飽和脂肪酸經環(huán)氧合酶(cyclooxygenase, COX)氧化可生成前列腺素(prostaglandins, PGs)和血栓烷素類(thromboxane, TXs),經LOX氧化可生成白三烯(leukotrienes, LTs),經細胞色素P450(cytochrome P450, CYP)氧化可生成羥基二十碳四烯酸類(hydroxyeicosatetraenoic acids, HETEs),經非酶途徑氧化可生成異構的前列腺素(iso-PGs)。而以上類別的類二十烷酸在生命體內發(fā)揮著重要作用,是重要的炎癥因子,在炎癥發(fā)生時,參與多種抗炎和促炎反應。

為了全面完整地闡述水飛薊素的抗炎機理,選擇了不同氧化途經、不同類別的類二十烷酸共44種,以期覆蓋較多的類二十烷酸代謝途徑。44種類二十烷酸及15種氘代類二十烷酸標準品氧化途徑等見表1。

2.1.2 內標的選擇

本實驗選擇同位素稀釋定量法[11]對類二十烷酸進行定量分析,選擇氘代類二十烷酸作為內標是類二十烷酸分析方法建立的一個關鍵部分。氘代的類二十烷酸和其對應的類二十烷酸具有相似的結構,在色譜柱上保留時間相近,但其母離子和/或子離子質荷比并不相同,是內標的最佳選擇。由于部分類二十烷酸并無商品化的氘代對照品,本研究選擇與其具有相似結構的氘代類二十烷酸作為內標。例如,11-HETE目前沒有商品化的氘代標準品,而(d8) 12-HETE的結構與11-HETE類似,因此選用(d8) 12-HETE作為11-HETE的內標。在本研究中,共選用15種氘代類二十烷酸作為44種類二十烷酸的內標。本研究所使用的類二十烷酸及其對應氘代內標見表1。

表 1 44種類二十烷酸及15種同位素內標的MRM離子對、優(yōu)化參數、氧化途徑及保留時間

表 1 (續(xù))

DP: declustering potential; CE: collision energy. LOX: lipoxygenase; COX: cyclooxygenase; CYP: cytochrome P450; NE: non-enzymatic; -: no pathway.

2.1.3 質譜參數的優(yōu)化

精密吸取適量類二十烷酸標準溶液和氘代類二十烷酸標準溶液，在MS Q1 模式下選擇母離子，在product MS2 模式下，選擇合適的碎片離子作為特征子離子，并通過優(yōu)化解簇電壓(DP)，碰撞能量(CE)，使特征子離子和母離子的響應值比約為2:1，確定了44種類二十烷酸及15種氘代類二十烷酸的母離子，特征子離子及其優(yōu)化后的DP、CE見表1。其中，一個類二十烷酸的母離子存在許多子離子，選擇的特征子離子應該能與其他共流出的類二十烷酸區(qū)分且響應值至少是母離子響應值的2倍。

由于共流出的類二十烷酸的MRM離子對(母離子和特征子離子)并不相同,而MRM離子對相同的類二十烷酸的色譜保留時間不相同(59種類二十烷酸的保留時間見表1),因此,結合編程的多反應監(jiān)測(scheduled multiple reaction monitoring, sMRM)的智能優(yōu)化和UPLC的高分離度,可以提高類二十烷酸的選擇性,可以較好地區(qū)分共流出的類二十烷酸和MRM離子對相同的類二十烷酸,實現類二十烷酸分析的高選擇性和高靈敏度。在本研究中,每一種MRM離子對保留時間的駐留時間窗口設置為30 s。

在1.5節(jié)條件下,59種類二十烷酸在5 min內達到較好的分離,且具有較優(yōu)的峰形(見圖1)。

2.1.4 方法學驗證

線性關系和定量下限 實驗結果表明,39種類二十烷酸的線性相關系數(R2)均大于0.99,說明39種類二十烷酸在該濃度范圍內的線性關系良好。除花生四烯酸和PGJ2外,類二十烷酸的定量下限均為5 pg,說明該方法具有較好的靈敏度?；ㄉ南┧岷蚉GJ2的定量下限為15 pg。這可能與花生四烯酸和PGJ2的電離效率有關。類二十烷酸的線性范圍均為0.005～5 ng,定量下限及相關系數見表2。

圖 1 59種類二十烷酸標準品的提取離子流圖Fig. 1 Extracted ion chromatograms of a mixture of 59 eicosanoid standards

CompoundLLOQ/pgR2LQC(0.15ng)RE/%RSD/%MQC(1.5ng)RE/%RSD/%HQC(5ng)RE/%RSD/%6kPGF1α50.9976-4.72210.2522-8.58438.8918-3.14334.3212TXB250.99492.22272.09660.44329.2749-2.93405.7257PGF2α50.99672.11480.7356-5.137512.06272.56384.1856PGE250.99792.15285.8916-3.03661.4102-6.79819.3557PGD250.99953.88632.76414.34370.27363.82410.223011βPGE250.99504.48870.1168-8.72668.85732.40925.858711-HETE50.99732.17612.4030-13.698810.40685.86305.629413-HDoHE50.99632.11480.3156-4.47698.2689-3.38155.2375PGJ2150.99344.56091.57234.57458.0483-3.43340.50225-isoPGF2αVI50.99851.07990.6344-11.98663.92548.69871.3130LTB450.99650.639113.66573.719514.27182.65905.9343LTE450.99921.15727.3474-9.945911.7313-5.10118.118413-HOTrE50.99865.71622.4088-0.212212.64450.07287.369615-OxoETE50.99931.90500.2446-9.06411.0013-6.43194.374212(13)-EpOME50.9965-5.65324.8192-1.31861.10021.75407.0135AA150.9995-2.31930.7857-0.00393.4808-3.17974.5341Adrenicacid50.995812.58918.1969-6.06011.16170.49157.5641EPA50.99921.75662.2409-0.88659.8930-5.24635.8692DHA50.99832.08927.1121-0.212511.7450-7.28680.0958dhkPGE250.9963-7.928612.95076.49443.69970.99469.2837dhkPGF2α50.9976-7.011511.27461.04168.3187-1.17505.5418dhkPGD250.99294.48600.21696.14107.6934-1.31183.528915dPGD250.99948.61003.2003-4.721512.1888-3.13764.314815kPGE250.99894.49130.02985.52593.7252-1.08722.351215dPGJ250.99261.42177.143914.37168.2011-6.44365.950820ohPGF2α50.99381.54583.7255-5.56595.6998-4.03413.311120ohPGE250.99980.559210.221812.16389.7347-7.26305.159119ohPGE250.969010.84521.2588-1.41406.86682.29497.137212-OxoETE50.9980-13.86691.42081.14445.97800.15540.828211(12)-EET50.9984-5.14155.76324.31172.0757-1.87706.11855-OxoETE50.9993-13.73365.6765-0.389513.7611-11.98408.90415(S)-HETE50.9992-13.92864.0172-5.02310.80600.47173.8146LTB450.99941.769512.3631-4.42995.7733-11.383910.02356tLTB450.99941.61050.3121-3.22294.6804-4.17807.117712(S)-HETE50.99911.02220.3010-8.06952.4901-7.52695.925712epiLTB450.9958-9.80451.4847-5.741711.3159-17.897011.1488

表 2 (續(xù))

準確度和精密度 在1.5節(jié)條件下,對類二十烷酸高、中、低3個水平的質控樣品進行精密度和準確度分析,結果見表2。對于低水平(0. 15 ng)和中水平(1.5 ng)質控樣品,衡量準確度的相對偏差(RE)和衡量精密度的相對標準偏差(RSD)[10]均不超過±15%;對于高水平質控樣品(5 ng),除5-OxoETE和12epiLTB4的RE外，其他類二十烷酸的RE和RSD均不超過±10%,均符合要求,這說明該方法具有良好的準確度和精密度。

圖 2 不同濃度的水飛薊素對KLA誘導炎癥細胞生存率的影響(n=5)Fig. 2 Effect of different concentrations of silymarin on KLA induced inflammation cell survival rate (n=5)

2.2 水飛薊素作用KLA誘導RAW264.7炎癥模型濃度范圍的篩選

為尋找合適的抗炎活性成分對KLA誘導RAW264.7炎癥模型作用的加藥濃度,本研究采用MTT考察了不同濃度的水飛薊素對RAW264.7細胞存活率的影響。圖2為不同濃度水飛薊素對KLA誘導炎癥細胞生存率的影響,觀察可知初選的5個濃度水平下細胞存活率曲線都處在高存活率范圍且曲線平滑,故水飛薊素后續(xù)實驗所需的藥物濃度范圍可以直接從預實驗設置的濃度中選擇,最終確定水飛薊素使細胞存活率為58%～80%的濃度為50、100和150 μmol/L。另外,根據MTT比色實驗結果,也可推測水飛薊素對炎癥細胞作用溫和,且具有一定的保護作用,所以即使其濃度升高,細胞存活率也沒有明顯下降,這也從側面說明了水飛薊素的抗炎活性。

2.3 不同濃度水飛薊素干預下的KLA誘導RAW264.7細胞中類二十烷酸的代謝分析

因為本研究所測定的是KLA作用24 h后的RAW264.7細胞培養(yǎng)基中的類二十烷酸,PGs及其下游代謝產物是AA在炎癥中的重要代謝物,根據Buczynski等[12]的研究,PGs及其下游代謝產物在KLA刺激24 h后的細胞內含量極低,絕大部分分泌至細胞培養(yǎng)基中,故本研究主要對RAW264.7細胞培養(yǎng)基中的類二十烷酸進行相關分析研究。

基于UPLC-MS/MS分析方法,得到水飛薊素處理組、炎癥組和正常組的RAW264.7細胞中類二十烷酸濃度的多元統計變量分析結果,圖3a、3b為PCA-X及OPLS-DA的結果,200次響應排序檢驗結果(response permutation testing, RPT)圖略。

圖3a分別顯示了水飛薊素5組樣本的UPLC-MS/MS數據經過PCA降維后的得分圖。說明每類分組中組內樣本的類二十烷酸的水平比較相近。為了進一步消除非疾病因素及其他潛在隨機誤差帶來的影響,故對PCA-X得分圖進行正交濾噪處理,獲取OPLS-DA得分圖(圖3b),這樣可對各個實驗進行最優(yōu)化區(qū)分,凸顯其差異性,模型驗證特異性與敏感性較高[13]。從圖3中可以清楚地看到水飛薊素的炎癥組、低濃度藥物處理組、中濃度藥物處理組、高濃度藥物處理組、正常組得到了更好的分離,并且可以觀察到隨著炎癥組、低濃度藥物處理組、中濃度藥物處理組、高濃度藥物處理組、正常組的變化,整體有向右遷移的趨勢。另外,各個模型都具有較好的預測能力及總體變化解釋能力。同時,200次排序響應的結果顯示:R2(CUM)=(0.0,0.533)，Q2(CUM)=(0.0,-0.192),均小于原始值,且Q2(CUM)回歸直線與Y軸截距<0,進一步驗證各模型是有效、可信的。

圖 5 炎癥狀態(tài)以及水飛薊素干預后AA的LOX代謝通路變化Fig. 5 Changes of arachidonic acid metabolic LOX pathways between inflammation and treated by silymarin 5-HPETE: 5-hydroperoxy-eicosatetraenoic acid.

圖 3 不同濃度水飛薊素干預下的多元統計變量分析結果Fig. 3 Multivariate statistical variables analysis results under different concentrations of silymarin (Sily) intervention a. principle component analysis (PCA)-X model; b. orthogonal partial least squares-discriminant analysis (OPLS-DA) model.

選擇OPLS-DA分析中VIP大于1的差異變量,并結合單維統計分析(秩和檢驗),將VIP>1且P< 0.05的代謝物作為炎癥組、藥物處理組、正常組的代謝標記物,得到一種類二十烷酸代謝標記物12-OxoLTB4。從花生四烯酸的代謝通路來看,代謝標記物12-OxoLTB4可以歸于5-LOX通路,可以結合代謝通路及差異代謝物12-OxoLTB4解釋水飛薊素的抗炎機制。

2.4 水飛薊素關鍵差異代謝物的生物學意義闡釋

為了更加方便地表示代謝標記物的含量變化,水飛薊素影響下代謝標記物12-OxoLTB4的柱狀圖見圖4。代謝物12-OxoLTB4在炎癥組的含量高于其他組,在加藥組Silymarin-50 μmol/L組、Silymarin-100 μmol/L組和Silymarin-150 μmol/L組中的含量逐漸降低。

圖 4 12-OxoLTB4在水飛薊素干預下不同組別間的質量濃度變化(n=3)Fig. 4 Mass concentration changes of 12-OxoLTB4between different groups under silymarin intervention (n=3)

為了更直觀地表現炎癥狀態(tài)下及水飛薊素干預下LOX代謝通路的變化,繪制了水飛薊素對LOX代謝通路的影響,見圖5。從代謝差異物12-OxoLTB4的柱狀圖分析中得知,處于炎癥狀態(tài)時,代謝物12-OxoLTB4的含量升高。原因可從5-LOX代謝通路解釋。首先,圖5展示了AA在5-LOX通路上的代謝過程,在5-LOX的雙加氧作用下,AA可被催化氧化為5-羥過氧化二十碳四烯酸(5-hydroperoxy-eicosatetraenoic acid, 5-HPETE),隨后轉化成5-HETE或進一步被氧化形成不穩(wěn)定的環(huán)氧化物白三烯A4(leukotriene A4, LTA4),然后LTA4可以轉化成LTB4, LTB4再轉化為12-OxoLTB4。5-LOX在細胞靜息狀態(tài)時表達很少,而受到外部刺激時被活化[14], 從而促進環(huán)氧化物LTA4的合成,12-OxoLTB4為LTs的下游代謝產物,所以這可能是12-OxoLTB4的含量在炎癥時升高的原因。

另外,在炎癥發(fā)生時,會產生活性氧自由基,這些氧自由基不僅能增加血管的通透性,而且會攻擊生物膜磷脂中的多聚不飽和脂肪酸,引起脂質過氧化,造成生物膜損傷[15]。AA在5-LOX的作用下,通過雙加氧作用,產生性質較活潑的脂質過氧化自由基和脂質過氧化物。脂質過氧化物可進一步代謝為白三烯、羥基脂肪酸、脂氧素等具有生物活性的物質。這些物質在炎癥過程中起重要作用[16]。

水飛薊素為抗氧自由基活性物質,其抗脂質過氧化的作用已經被實驗證實,故可以認為其抗炎作用源于抗氧自由基[17]。Gupta等[4]研究證實水飛薊素可以通過抑制5-LOX的活性發(fā)揮抗炎及抗關節(jié)炎作用;文獻[4]還提到Baumann等認為水飛薊素可以在AA的LOX代謝通路的許多步驟中發(fā)揮清除自由基的功能,故可以總結如下:水飛薊素通過抑制5-LOX酶的活性及阻斷5-LOX代謝通路中產生氧自由基的脂質過氧化反應來減少氧自由基及過氧化物的形成,從而發(fā)揮抗炎作用,因此其抗炎作用源于其抗氧自由基性質。

3 結論

本實驗建立了59種類二十烷酸在5 min內實現快速分離的LC-MS/MS方法,并利用該定量分析方法和多變量數據分析手段,研究了不同濃度水飛薊素干預下KLA誘導的RAW264.7細胞炎癥模型的代謝組學,得到一種類二十烷酸標記物12-OxoLTB4;通過柱狀圖分析,結合炎癥信號通路,確定水飛薊素借助其抗氧自由基特性發(fā)揮抗炎作用。本實驗從組學角度對脂肪酸及其氧化代謝產物進行研究,能更準確地解釋其在疾病中的作用機制,有助于疾病的診斷和治療。

[1] Dong Y, Kong C Y. Chinese Traditional Patent Medicine, 2010, 32(7): 1225

董巖, 孔春燕. 中成藥, 2010, 32(7): 1225

[2] Liu H L. Chinese Journal of Ethnomedicine and Ethnopharmacy, 2008, 17(7): 23

劉洪玲. 中國民族民間醫(yī)藥, 2008, 17(7): 23

[3] Fiebrich F, Koch H. Experientia, 1979, 35(12): 1548

[4] Gupta O P, Sing S, Bani S, et al. Phytomedicine, 2000, 7(1): 21

[5] Yang C, Mai D T, Pan Z M, et al. Chinese Journal of Chromatography, 2016, 34(5): 449

楊嬋, 麥旦提, 潘喆敏, 等. 色譜, 2016, 34(5): 449

[6] Masoodi M, Nicolaou A. Rapid Commun Mass Spectrom, 2006, 20(20): 3023

[7] Zehethofer N, Pinto D M. Anal Chim Acta, 2008, 627(1): 62

[8] Han X, Gross R W. J Lipid Res, 2003, 44(6): 1071

[9] US Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Center for Drug Evaluation and Research (CDER), Center for Veterinary Medicine (CVM). Federal Register, 2001, 66(4): 206

[10] Hang T J. Pharmaceutical Analysis. 8th ed. Beijing: People’s Medical Publishing House, 2011

杭太俊. 藥物分析. 8版. 北京: 人民衛(wèi)生出版社, 2011

[11] Dumlao D S, Buczynski M W, Norris P C, et al. Biochimica et Biophysica Acta, 2011, 1811(11): 724

[12] Buczynski M W, Stephens D L, Bowers-Gentry R C, et al. J Biol Chem, 2007, 282(31): 22834

[13] Yu Y, Cao Y, Chen Y M, et al. Chinese Journal of Chromatography, 2010, 28(7): 644

俞穎, 曹毅, 陳益民, 等. 色譜, 2010, 28(7): 644

[14] Lee J W, Mok H J, Lee D Y, et al. Int J Mol Sci, 2016, 17(4): 508

[15] Nie B, Yu C H, Wang F F, et al. Lishizhen Medicine and Materia Medica Research, 2008, 19(1): 65

聶犇, 余陳歡, 王芳芳, 等. 時珍國醫(yī)國藥, 2008, 19(1): 65

[16] Funk C D, Chen X S. Am J Respir Crit Care Med, 2000, 161: S120

[17] Wang F. [PhD Dissertation]. Hangzhou: Zhejiang University, 2006

汪峰. [博士學位論文]. 杭州: 浙江大學, 2006

Shanghai Science and Technology Commission Scientific Research Project (Nos. 15142200200, 16142200300); China Postdoctoral Science Fund (No. 2015M581628); Shanghai Introduction of Technology Absorption and Innovation (No. XC-ZXSJ-02-2016-11).

Investigation on silymarin impact on lipopolysaccharide induced inflammation model based on arachidonic acid metabolism pathway

MAI Danti, YANG Chan, XUE Yun, WANG Yan*, YAN Chao*

(SchoolofPharmacy,ShanghaiJiaoTongUniversity,Shanghai200210,China)

The objective of this research is to investigate the suppressive effect of silymarin on vitro cell culture model of inflammatory macrophage RAW264.7 induced by Kdo2-Lipid A, and explore its mechanism based on cell metabonomics. Ultra-high performance liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS) method was used in the cell metabonomic assay to quantitative analysis of metabolites related to eicosanoids pathway. Then chemometric approaches such as principal component analysis were used to process the metabolic data. Within the established method, a total of 59 eicosanoids standards (containing 15 deuterated internal standards) were simultaneously separated in a single 5 min run, and the analytical method is proved to be rapid, sensitive and accurate. Whereafter, the metabolites with VIP>1 andPvalue<0.05 were considered as biomarkers. 12-OxoLeukotriene B4(12-OxoLTB4) was eventually identified as metabolic biomarkers of silymarin treatment group in this research, and according to the related inflammatory pathways, we speculated silymarin has anti-inflammatory activities by inhibiting the 5-lipoxygenase (5-LOX) activity and blocking lipid peroxidation in 5-LOX metabolic pathways to reduce the formation of peroxides and oxygen free radicals. This study provide a novel approach to the mechanism research on the silymarin treatment on RAW264.7 cells based on cell metabonomics.

ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS); eicosanoids; deuterated internal standards; silymarin; metabonomics; inflammatory

10.3724/SP.J.1123.2017.01026

2017-01-20

上海市科委科研計劃項目(15142200200,16142200300);中國博士后科學基金(2015M581628);上海市引進技術的吸收與創(chuàng)新專項(XC-ZXSJ-02-2016-11).

O658

A

1000-8713(2017)06-0578-09

* 通訊聯系人.Tel:(021)34204833,E-mail:chaoyan@unimicrotech.com(閻超);Tel:(021)34205673,E-mail:wangyan11@sjtu.edu.cn(王彥).