于澤奇 衣泰龍 涂悅 楊小颯 江繼鵬 董曉煜 張賽 程世翔

RIP3介導(dǎo)的壞死性凋亡在HT-22細(xì)胞牽張損傷模型中的作用

于澤奇1衣泰龍1涂悅1楊小颯1江繼鵬1董曉煜2張賽1程世翔1

目的探討受體相互作用蛋白3（RIP3）介導(dǎo)的壞死性凋亡在HT-22細(xì)胞牽張損傷模型中的作用及其機(jī)制。方法將HT-22細(xì)胞接種在Bioflex培養(yǎng)板，采用細(xì)胞損傷控制儀（CIC），設(shè)定損傷參數(shù)（閥門壓力30 PSI、氣體脈沖壓力3.5～4.5 PSI、氣體脈沖時(shí)間50 ms），建立HT-22細(xì)胞牽張損傷模型。分別采用數(shù)字全息顯微鏡（DHM）、乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒、流式細(xì)胞術(shù)、western blot法檢測(cè)牽張損傷后6 h Ctrl組、CIC組、GSK’872組間細(xì)胞形態(tài)差異，LDH濃度變化，細(xì)胞周期分布，RIP3/受體相互作用蛋白1（RIP1）/混合系列蛋白激酶樣結(jié)構(gòu)域（MLKL）、Akt/p-Akt/mTOR/p-mTOR、Caspase-8/X連鎖凋亡抑制蛋白（XIAP）蛋白表達(dá)變化。結(jié)果與CIC組相比，應(yīng)用GSK’872后細(xì)胞平均數(shù)量[（244.67±11.68）vs（190.67±15.28），t=4.865，P＜0.01]、細(xì)胞平均面積[（260.14±16.81）μm2vs（175.91±15.00）μm2，t=6.476，P＜0.01]有所增加，細(xì)胞平均厚度有所減小[（6.12±0.47）μm vs（8.04±0.48）μm，t=4.942，P＜0.01]；LDH濃度有所下降[（222.74±11.06）ng/l vs（275.93±12.26）ng/l，t=5.581，P＜0.01]；細(xì)胞周期有所恢復(fù)[Sub-G1：（0.33±0.15）%vs（6.51±0.63）%，t=16.530，P＜0.01；G0/G1：（46.67±2.96）%vs（33.04±7.07）%，t=3.085，P＜0.05]；能夠降低 RIP3[（0.73±0.04）vs（1.09± 0.09），t=6.239，P＜0.01]、RIP1[（0.75±0.05）vs（0.91±0.05），t=4.211，P＜0.05]、MLKL[（0.56±0.03）vs（0.70± 0.04），t=4.785，P＜0.01]、Akt[（0.49±0.05）vs（0.77±0.05），t=6.763，P＜0.01]、p-Akt[（0.88±0.05）vs（1.06± 0.05），t=4.509，P＜0.05]、mTOR[（0.81±0.02）vs（0.90±0.05），t=2.813，P＜0.05]、p-mTOR[（0.65±0.05）vs（1.00±0.05），t=8.413，P＜0.01]、XIAP[（0.50±0.05）vs（0.73±0.05），t=5.814，P＜0.01]蛋白表達(dá)，并可促進(jìn) Caspase-8蛋白表達(dá)持續(xù)升高[（0.96±0.05）vs（0.75±0.05），t=5.351，P＜0.01]，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論RIP3介導(dǎo)的壞死性凋亡在HT-22細(xì)胞牽張損傷模型中起到重要作用，應(yīng)用GSK’872可減輕HT-22細(xì)胞牽張損傷的程度，提示RIP3有可能成為將來(lái)臨床上治療顱腦創(chuàng)傷新的靶點(diǎn)。

顱腦創(chuàng)傷； 牽張損傷； 壞死性凋亡； 受體相互作用蛋白3； GSK’872； HT-22細(xì)胞

顱腦創(chuàng)傷（traumatic brain injury，TBI）是臨床上常見(jiàn)預(yù)后兇險(xiǎn)的危重病，其高致死率和致殘率給患者家庭和社會(huì)帶來(lái)沉重的負(fù)擔(dān)，現(xiàn)已成為全球較嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題[1,2]。降低顱腦創(chuàng)傷死亡率、致殘率以及提高患者的生存質(zhì)量是目前神經(jīng)外科領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[3]。近年來(lái)，壞死性凋亡在多種疾病中的作用越來(lái)越受關(guān)注，比如細(xì)菌感染，胰腺炎，動(dòng)脈粥樣硬化，腦、心肌、腸道炎癥等[4-9]。壞死性凋亡的發(fā)生、調(diào)節(jié)、誘導(dǎo)及阻斷機(jī)制是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，涉及多種分子的表達(dá)及調(diào)控。其中受體相互作用蛋白3（receptor-interacting protein 3，RIP3）是調(diào)控細(xì)胞壞死性凋亡的關(guān)鍵分子，可磷酸化混合系列蛋白激酶樣結(jié)構(gòu)域（mixed lineage kinase domain like，MLKL），并最終導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性改變，甚至細(xì)胞膜破裂[10,11]。但RIP3介導(dǎo)的壞死性凋亡與顱腦創(chuàng)傷之間的詳細(xì)機(jī)制仍未完全清楚，因此本實(shí)驗(yàn)采用細(xì)胞損傷控制儀（cell injury controller，CIC）建立細(xì)胞牽張損傷模型，以模擬臨床上顱腦創(chuàng)傷的發(fā)生，從而進(jìn)一步探討RIP3介導(dǎo)的壞死性凋亡在顱腦創(chuàng)傷中的作用及其機(jī)制。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

小鼠海馬神經(jīng)元HT-22細(xì)胞購(gòu)自上?；鄯f生物科技有限公司，用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基于培養(yǎng)箱（5%CO2，37℃）中常規(guī)培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分組：Ctrl組（不予處理），CIC組（HT-22細(xì)胞CIC牽張損傷后，更換普通DMEM高糖培養(yǎng)基），GSK’872組 （HT-22細(xì)胞CIC牽張損傷后，更換含GSK’872濃度為3μmol/l的DMEM高糖培養(yǎng)基）。

二、儀器與試劑

CO2恒溫三氣培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo），細(xì)胞損傷儀 （美國(guó)Custom Design&Fabrication Ltd.），Bioflex細(xì)胞培養(yǎng)板（美國(guó)Flexcell），數(shù)字全息顯微鏡（digital holographic microscopy，DHM）（HoloMonitorTMM4，瑞典 Phiab），酶標(biāo)儀 （美國(guó) Thermo），乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）試劑盒（北京普利萊基因技術(shù)有限公司），流式細(xì)胞儀（FACSCallibur，美國(guó)BD），碘化丙啶（propidium iodide，PI）、Annexin V（美國(guó) Life），垂直電泳槽（美國(guó) Bio-Rad），半干轉(zhuǎn)膜儀（美國(guó)Bio-Rad），化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng) （AI600，美國(guó)GE），ECL顯色試劑盒（美國(guó)GE），兔抗小鼠RIP3、RIP1、MLKL、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR、X連鎖凋亡抑制蛋白 (X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）一抗（美國(guó)Abcam），羊抗小鼠Caspase-8一抗（美國(guó)Santa Cruz），辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG抗體（美國(guó)KPL），辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記兔抗羊IgG抗體（美國(guó)KPL），BCA蛋白定量試劑盒 （北京康為公司），GSK’872（美國(guó)Millipore）。

三、建立CIC致HT-22細(xì)胞牽張損傷模型

將HT-22細(xì)胞以3×105/ml密度接種于Bioflex硅膠培養(yǎng)板中，待細(xì)胞匯合度達(dá)到85%以上時(shí)，將CIC細(xì)胞損傷儀輸出端與Bioflex培養(yǎng)板緊密相連，設(shè)定參數(shù)如下：閥門壓力為30 PSI，氣體脈沖壓力為3.5～4.5 PSI，氣體脈沖時(shí)間為50 ms。在CIC損傷后6 h進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，對(duì)照組不予處理。

四、DHM形態(tài)學(xué)觀察

用DHM隨機(jī)選取HT-22細(xì)胞某一視野，拍攝細(xì)胞損傷各組間的形態(tài)學(xué)變化，并使用HoloStudio 1.8軟件計(jì)算細(xì)胞平均數(shù)量、平均面積和平均厚度，取3次結(jié)果的平均值作為測(cè)定結(jié)果。

五、LDH濃度的測(cè)定

分別于細(xì)胞牽張損傷6 h吸取Ctrl組、CIC組、GSK’872組細(xì)胞培養(yǎng)上清液各10μl，加入到96孔板中，再將底物緩沖液與11.3 mmol/l氧化型輔酶Ⅰ以5∶1的比例混勻，每孔加入60μl混合液，37℃水浴15 min。加入50μl 2，4-二硝基苯肼溶液，與樣本充分混合，37℃水浴15 min。最后加入150μl終止試劑（0.6 mmol/l NaOH），室溫條件下，靜置3～5 min，酶標(biāo)儀440 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各樣品釋放的LDH濃度。

六、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期

收集細(xì)胞牽張損傷后 6 h Ctrl、CIC、GSK’872組細(xì)胞，離心5 min（1 200 r/min），掉倒上清，加入預(yù)冷磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）4 ml，反復(fù)吹打，再以1 200 r/min離心5 min，掉倒上清，反復(fù)沖洗3次，用75%冰乙醇固定細(xì)胞，于-20℃冰箱中過(guò)液。次日，將固定好的細(xì)胞用預(yù)冷PBS洗滌3次，再用500μl PBS將細(xì)胞重懸后加入PI和RNase（終濃度分別為50、100μg/ml），于37℃條件下避光孵育30 min，最后用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

七、Western blot

收集細(xì)胞牽張損傷后 6 h Ctrl、CIC、GSK’872組細(xì)胞，用RIPA蛋白裂解液裂解，收集上清液。采用BCA法測(cè)定蛋白濃度，根據(jù)各組蛋白濃度取等量蛋白進(jìn)行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（電壓120 V），待目的條帶分離出來(lái)，停止電泳。再用半干轉(zhuǎn)膜儀將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜（nitrocellulose filter membrane，NC）上（電壓15 V），待轉(zhuǎn)膜后將NC膜取出，蛋白面朝上，加入含5%脫脂奶粉的TBST封閉1 h。再分別加入RIP3、RIP1、 MLKL、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR、Caspase-8、XIAP一抗 （稀釋比例均為1∶1 000），4℃孵育過(guò)夜。次日TBST洗膜3次，每次10 min，加入相應(yīng)二抗（稀釋比例均為1∶10 000），室溫孵育1 h，再TBST洗膜3次，每次10 min。將ECL發(fā)光液A和B等體積混合，滴在NC膜上，用GE化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)進(jìn)行圖像采集，GAPDH為內(nèi)參，使用ScnImage軟件對(duì)灰度值進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

八、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用Graphpad Prism 6.0和SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較行非配對(duì)樣本t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、細(xì)胞牽張損傷后各組HT-22細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化

光鏡觀察結(jié)果顯示，Ctrl組細(xì)胞貼壁良好，結(jié)構(gòu)正常呈梭形，生長(zhǎng)密集并形成稠密的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)狀分布；細(xì)胞牽張損傷后6 h，可見(jiàn)CIC組細(xì)胞皺縮，并出現(xiàn)脫落、漂浮現(xiàn)象。而應(yīng)用GSK’872后，細(xì)胞形態(tài)較CIC組有所恢復(fù)，細(xì)胞形態(tài)較好，部分細(xì)胞重新伸展，詳見(jiàn)圖1。

DHM觀察結(jié)果顯示，與Ctrl組相比，細(xì)胞牽張損傷后細(xì)胞平均數(shù)量顯著降低 [（190.67±15.28）vs（389.67±15.28），t=15.960，P＜0.01]，細(xì)胞平均面積顯著變小[（175.91±15.00）μm2vs（394.99±21.20）μm2，t=14.612，P＜0.01]，細(xì)胞平均厚度顯著升高 [（8.04± 0.48）μm vs（4.24±0.67）μm，t=8.006，P＜0.01]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而應(yīng)用GSK’872后，細(xì)胞平均數(shù)量（244.67±11.68，t=4.865，P＜0.01）、 細(xì)胞平均面積[（260.14±16.81）μm2，t=6.476，P＜0.01]、細(xì)胞平均厚度[（6.12±0.47）μm，t=4.942，P＜0.01]較CIC組均有所恢復(fù)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，詳見(jiàn)圖2A～2D。

二、LDH濃度的變化

LDH主要存在于細(xì)胞內(nèi)，當(dāng)細(xì)胞膜破裂時(shí)，釋放到外周，因此測(cè)定LDH濃度可間接反映細(xì)胞損傷程度。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與Ctrl組相比，細(xì)胞牽張損傷后6 h，LDH濃度顯著升高 [（275.93±12.26）ng/l vs（51.68±7.08）ng/l，t=27.450，P＜0.01]， 而應(yīng)用GSK’872后LDH濃度有所下降[（222.74±11.06）ng/l，t=5.581，P＜0.01]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明RIP3特異性抑制劑GSK’872能在一定程度上減輕細(xì)胞損傷程度，詳見(jiàn)圖3。

圖1 光鏡觀察細(xì)胞牽張損傷后6 h Ctrl組、CIC組、GSK’872組細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化（×100）

圖2 數(shù)字全息顯微鏡觀察細(xì)胞牽張損傷后6 h Ctrl組、CIC組、GSK’872組細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化

圖3 細(xì)胞牽張損傷后6 h Ctrl組、CIC組、GSK’872組乳酸脫氫酶濃度變化

三、細(xì)胞周期變化

與Ctrl組相比，細(xì)胞牽張損傷后6 h CIC組 Sub-G1峰、G2/M峰明顯升高，同時(shí)G0/G1峰、S峰比例顯著降低，提示細(xì)胞壞死比例顯著升高。而應(yīng)用GSK’872后，可見(jiàn)細(xì)胞各周期均有所恢復(fù)，提示應(yīng)用RIP3抑制劑GSK’872能夠在一定程度上減輕細(xì)胞牽張損傷程度，詳見(jiàn)圖4、表1。

圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期

表1 細(xì)胞牽張損傷對(duì)HT-22細(xì)胞周期的影響（x±s，%）

四、Western blot結(jié)果

與Ctrl組相比，細(xì)胞牽張損傷后6 h CIC組RIP3、RIP1、MLKL表達(dá)顯著升高[RIP3：（1.09±0.09）vs（0.60±0.04），t=8.532，P＜0.01；RIP1：（0.91±0.05）vs（0.74±0.04），t=4.720，P＜0.01；MLKL：（0.70±0.04）vs（0.55±0.03），t=5.390，P＜0.01]。而應(yīng)用GSK’872后，與CIC組相比，RIP3、RIP1、MLKL表達(dá)量均有所下降，分別為 [RIP3：（0.73±0.04），t=6.239，P＜0.01；RIP1：（0.75±0.05），t=4.211，P＜0.05；MLKL：（0.56± 0.03），t=4.785，P＜0.01]，詳見(jiàn)圖5。

圖5 RIP3、RIP1、MLKL蛋白表達(dá)變化

與Ctrl組相比，細(xì)胞牽張損傷后6 h CIC組Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR表達(dá)顯著升高[Akt：（0.77±0.05）vs（0.40±0.04），t=10.140，P＜0.01；p-Akt：（1.06±0.05）vs（0.76±0.04），t=8.264，P＜0.01；mTOR：（0.90±0.05）vs（0.78±0.04），t=3.258，P＜0.05；p-mTOR：（1.00±0.05）vs（0.64±0.04），t=9.680，P＜0.01]。而應(yīng)用GSK’872后，與CIC組相比，Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR表達(dá)量均有所下降，分別為 [Akt：（0.49±0.05），t=6.763，P＜0.01；p-Akt：（0.88±0.05），t=4.509，P＜0.05；mTOR：（0.81±0.02），t=2.813，P＜0.05；p-mTOR：（0.65±0.05），t=8.413，P＜0.01]，詳見(jiàn)圖6。

圖6 Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR蛋白表達(dá)變化

與Ctrl組相比，細(xì)胞牽張損傷后6 h CIC組Caspase-8表達(dá)顯著升高[（0.75±0.05）vs（0.46±0.04），t=7.985，P＜0.01]，XIAP表達(dá)顯著下降 [（0.73±0.05）vs（0.96±0.04），t=6.255，P＜0.01]；而應(yīng)用 GSK’872后，與CIC組相比，Caspase-8表達(dá)持續(xù)升高（0.96± 0.05，t=5.351，P＜0.01），XIAP表達(dá)持續(xù)下降 （0.50± 0.05，t=5.814，P＜0.01），詳見(jiàn)圖7。

討論

圖7 Caspase-8、XIAP蛋白表達(dá)變化

顱腦創(chuàng)傷是由機(jī)械力作用而導(dǎo)致的原發(fā)性腦組織損傷，在傷后的數(shù)分鐘至數(shù)天內(nèi)出現(xiàn)顱內(nèi)壓升高、腦水腫、腦血流改變等繼發(fā)性損害，進(jìn)而加重腦組織的損害程度[12]。在繼發(fā)性腦損傷中，目前研究較多的是壞死性凋亡通路[13]。以往人們認(rèn)為壞死是在物理、化學(xué)及病原體等因素作用下所致的非程序性細(xì)胞死亡。隨著研究的深入，人們逐漸認(rèn)識(shí)到細(xì)胞壞死實(shí)際上也是有序性的，即壞死性凋亡[14]。其中RIP3是該通路的關(guān)鍵分子，具有絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性，可與 RIP1相互作用形成壞死復(fù)合體介導(dǎo)caspase非依賴性的細(xì)胞壞死。另一方面，RIP3的Ser227位點(diǎn)可通過(guò)磷酸化招募與活化其底物分子MLKL，磷酸化的MLKL募集PGAM5（線粒體中的一種蛋白）并使之磷酸化，最終作用于線粒體裂解蛋白Drp1，使其去磷酸化而激活，而后引發(fā)線粒體裂解以及活性氧的產(chǎn)生，導(dǎo)致細(xì)胞膜破裂、細(xì)胞壞死[15,16]。本實(shí)驗(yàn)中，HT-22細(xì)胞牽張損傷后，RIP3、RIP1、MLKL表達(dá)顯著上升，而應(yīng)用RIP3特異性抑制劑GSK’872，能夠顯著降低RIP3、RIP1、MLKL的表達(dá)，減輕細(xì)胞損傷程度，降低細(xì)胞死亡比例，提示RIP3特異性抑制劑GSK’872能夠在一定程度上對(duì)神經(jīng)細(xì)胞牽張損傷起到保護(hù)性作用，這為臨床上治療顱腦創(chuàng)傷提供了新的理論依據(jù)和目標(biāo)靶點(diǎn)。

Akt是抑制神經(jīng)元凋亡的一個(gè)關(guān)鍵激酶，mTOR是其下游激酶，調(diào)控蛋白的合成[17]。以往有研究指出，聯(lián)合使用Akt和mTOR的抑制劑能夠顯著降低小鼠顱腦創(chuàng)傷模型中的細(xì)胞死亡，并改善小鼠的長(zhǎng)期認(rèn)知障礙[18]。在本研究中，筆者發(fā)現(xiàn)HT-22細(xì)胞牽張損傷后，Akt和mTOR發(fā)生磷酸化，同時(shí)表達(dá)量顯著升高，而應(yīng)用RIP3特異性抑制劑GSK’872后，Akt和mTOR的表達(dá)量有所減少，提示RIP3可能參與到Akt/mTOR信號(hào)途徑中，并可對(duì)其進(jìn)行調(diào)控[17]。

Caspase-8是細(xì)胞凋亡途徑的核心分子，活化的Caspase-8會(huì)引起包括 Caspase-9在內(nèi)的下游Caspase活化，進(jìn)而導(dǎo)致凋亡的發(fā)生[19]。而XIAP是凋亡抑制劑，可抑制Caspase-8對(duì)下游Caspase活化過(guò)程中前結(jié)構(gòu)域的去除，使下游Caspase不能活化從而抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生[20]。在本研究中，當(dāng)HT-22細(xì)胞發(fā)生牽張損傷時(shí)，Caspase-8表達(dá)上調(diào)，XIAP表達(dá)減少。而值得注意的是，應(yīng)用RIP3特異性抑制劑GSK’872后，一方面在一定程度上抑制細(xì)胞壞死性凋亡的發(fā)生，另一方面，明顯地上調(diào)了Caspase-8的表達(dá)，并降低XIAP的表達(dá)，提示抑制RIP3的表達(dá)可在一定程度上抑制細(xì)胞壞死，并部分扭轉(zhuǎn)到凋亡途徑，這跟以往的研究不同[21]。

綜上所述，RIP3介導(dǎo)的壞死性凋亡在HT-22細(xì)胞牽張損傷模型中起到重要作用，通過(guò)應(yīng)用GSK’872阻斷RIP3的表達(dá)可對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞牽張損傷起到一定的保護(hù)性作用。但臨床上顱腦創(chuàng)傷與RIP3介導(dǎo)的壞死性凋亡之間的關(guān)系究竟如何，還有待進(jìn)一步研究，這將為臨床上治療顱腦創(chuàng)傷提供新的研究方向和目標(biāo)靶點(diǎn)。

[1] 涂悅,楊細(xì)平,商崇智.醒腦靜對(duì)顱腦創(chuàng)傷的保護(hù)作用[J].中國(guó)應(yīng)用生理學(xué)雜志,2014,30(3)：230-232,236.

[2] Xu J,Liao W,Gu D,et al.Neural ganglioside GD2 identifies a subpopulation of mesenchymal stem cells in umbilical cord[J]. Cell Physiol Biochem,2009,23(4-6)：415-424.

[3] Lim ST,Esfahani K,Avdoshina V,et al.Exogenous gangliosides increase the release of brain-derived neurotrophic factor[J]. Neuropharmacology,2011,60(7-8)：1160-1167.

[4] Bleriot C,Lecuit M.The interplay between regulated necrosis and bacterial infection[J].Cell Mol Life Sci,2016,73(11-12)：2369-2378.

[5] Takemoto K,Hatano E,Iwaisako K,et al.Necrostatin-1 protects against reactive oxygen species (ROS)-induced hepatotoxicity in acetaminophen-induced acute liver failure[J].FEBS Open Bio, 2014,4：777-787.

[6] Karunakaran D,Geoffrion M,Wei L,et al.Targeting macrophage necroptosis for therapeutic and diagnostic interventions in atherosclerosis[J].Sci Adv,2016,2(7)：e1600224.

[7] Xu Y,Wang J,Song X,et al.RIP3 induces ischemic neuronal DNA degradation and programmed necrosis in rat via AIF[J].Sci Rep,2016,6：29362.

[8] Kitur K,Wachtel S,Brown A,et al.Necroptosis promotes staphylococcus aureus clearance by inhibiting excessive inflammatory signaling[J].Cell Rep,2016,16(8)：2219-2230.

[9] Bozec D,Iuga AC,Roda G,et al.Critical function of the necroptosis adaptor RIPK3 in protecting from intestinal tumorigenesis[J].Oncotarget,2016,7(29)：46384-46400.

[10] Xu B,Xu M,Tian Y,et al.Matrine induces RIP3-dependent necroptosis in cholangiocarcinoma cells[J].Cell Death Discov, 2017,3：16096.

[11] Kim SK,Yun M,Seo G,et al.Palmitate induces RIP1/RIP3-dependent necrosis via MLKL-mediated pore formation in the plasma membrane of RAW 264.7 cells[J].Biochem Biophys Res Commun,2017,482(2)：359-365.

[12] Hackenberg K,Unterberg A.Traumatic brain injury[J]. Nervenarzt,2016,87(2)：203-214;quiz 215-216.

[13] Liu T,Zhao DX,Cui H,et al.Therapeutic hypothermia attenuates tissue damage and cytokine expression after traumatic brain injury by inhibiting necroptosis in the rat[J].Sci Rep, 2016,6：24547.

[14] Edinger AL,Thompson CB.Death by design：apoptosis,necrosis and autophagy[J].Curr Opin Cell Biol,2004,16(6)：663-669.

[15] Chen W,Zhou Z,Li L,et al.Diverse sequence determinants control human and mouse receptor interacting protein 3(RIP3) and mixed lineage kinase domain-like (MLKL)interaction in necroptotic signaling[J].J Biol Chem,2013,288(23)：16247-16261.

[16] Wang Z,Jiang H,Chen S,et al.The mitochondrial phosphatase PGAM5 functions at the convergence point of multiple necrotic death pathways[J].Cell,2012,148(1-2)：228-243.

[17] Liu Q,Qiu J,Liang M,et al.Akt and mTOR mediate programmed necrosis in neurons[J].Cell Death Dis,2014,5：e1084.

[18] Park J,Zhang J,Qiu J,et al.Combination therapy targeting Akt and mammalian target of rapamycin improves functional outcome after controlled cortical impact in mice[J].J Cereb Blood Flow Metab,2012,32(2)：330-340.

[19] Liu L,Yim H,Choi JH,et al.ATM kinase promotes both caspase-8 and caspase-9 activation during TNF-α-induced apoptosis of HeLa cells[J].FEBS Lett,2014,588(6)：929-935.

[20] Kaufmann T,Strasser A,Jost PJ.Fas death receptor signalling：roles of Bid and XIAP[J].Cell Death Differ,2012,19(1)：42-50.

[21] Kaiser WJ,Sridharan H,Huang C,et al.Toll-like receptor 3-mediated necrosis via TRIF,RIP3,and MLKL[J].J Biol Chem, 2013,288(43)：31268-31279.

（本文編輯：張麗）

于澤奇,衣泰龍,涂悅,等.RIP3介導(dǎo)的壞死性凋亡在HT-22細(xì)胞牽張損傷模型中的作用[J/CD].中華神經(jīng)創(chuàng)傷外科電子雜志,2017,3(3)：159-165.

·消息·

第十二屆中國(guó)醫(yī)師協(xié)會(huì)神經(jīng)外科醫(yī)師年會(huì)

12th Annual Meeting of Chinese Congress of Neurological Surgeons

尊敬的全國(guó)神經(jīng)外科同仁：

中國(guó)醫(yī)師協(xié)會(huì)神經(jīng)外科醫(yī)師分會(huì)從建立之日起，就把維護(hù)醫(yī)師的合法權(quán)益和推進(jìn)我國(guó)?？漆t(yī)師培訓(xùn)作為首要責(zé)任，也把全國(guó)神經(jīng)外科醫(yī)師群體真正地團(tuán)結(jié)成為一個(gè)大家庭。一年一度的全國(guó)代表大會(huì)成了全國(guó)神經(jīng)外科醫(yī)師共同的節(jié)日！2017年6月23-25日，我們將在武漢歐亞會(huì)展國(guó)際酒店迎來(lái)第十二屆全國(guó)年會(huì)！

在凸顯中國(guó)醫(yī)師協(xié)會(huì)神經(jīng)外科醫(yī)師分會(huì)“維權(quán)，自律，教育，交流”的宗旨下，此次大會(huì)將呈現(xiàn)給全國(guó)代表豐富多彩的內(nèi)容。形式上，有會(huì)前多個(gè)亞專科實(shí)戰(zhàn)解剖和操作學(xué)習(xí)班，大會(huì)邀請(qǐng)全國(guó)知名專家作精彩的大會(huì)報(bào)告，開設(shè)多個(gè)神經(jīng)外科亞?？品謺?huì)場(chǎng)，以及青年醫(yī)生演講比賽。在內(nèi)容上，除了學(xué)術(shù)交流，還有政策解讀，共識(shí)探討，人文思考，歷史回顧等。希望廣大的代表踴躍投稿參會(huì)作報(bào)告！

會(huì)議舉辦地湖北武漢，九省通衢，交通便利。既可食武昌魚，亦可萬(wàn)里長(zhǎng)江橫渡，還可一登黃鶴樓，極目楚天舒！湖北不僅有神秘恩施，雄偉三峽，巍峨武當(dāng)?shù)让啦粍偈盏淖匀伙L(fēng)光，同時(shí)人文薈萃，她是巴楚文化的發(fā)源地、禪宗文化的祖庭地、首義文化的承載地……屆時(shí)您將有機(jī)會(huì)領(lǐng)略獨(dú)具魅力的荊楚大地！

主辦單位：中國(guó)醫(yī)師協(xié)會(huì)

中國(guó)醫(yī)師協(xié)會(huì)神經(jīng)外科醫(yī)師分會(huì)

承辦單位：華中科技大學(xué)武漢協(xié)和醫(yī)院

協(xié)辦單位：首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院

劉承基中國(guó)神經(jīng)外科醫(yī)師基金

北京市王忠誠(chéng)醫(yī)學(xué)基金會(huì)

會(huì)議主席：凌鋒

執(zhí)行主席：趙洪洋

詳情點(diǎn)擊大會(huì)官網(wǎng)：http：//ccns.cmdamt.org/2017/index

中國(guó)醫(yī)師協(xié)會(huì)神經(jīng)外科醫(yī)師分會(huì)

Effects of necroptosis induced by RIP3 in stretch injury model of HT-22 cells

Yu Zeqi1,Yi Tailong1,Tu Yue1,Yang Xiaosa1,Jiang Jipeng1,Dong Xiaoyu2Zhang Sai1,Cheng Shixiang1.1Neurology and Neurosurgery Hospital,Affiliated Hospital of Logistics College of Chinese People’s Armed Police Force(PAP),Tianjin 300162,China;2Medical Unit of Three Detachment of Beijing Armed Police Corps, Beijing 100621,China

Cheng Shixiang,Email:shixiangcheng@vip.126.com

Objective To investigate the effects of necroptosis induced by receptor-interacting protein 3 (RIP3）on stretch injury model of HT-22 cells and its mechanisms.MethodsHT-22 cell lines were seeded with Bioflex cell plate,and stretch injuries with 30 psi for the regulator with a 50 msec pulse resulting in 3.5～4.5 peak injury pressure by cell injury controllerⅡ(CIC)instrument.The morphological changes of HT-22 cells were assessed by digital holographic microscopy(DHM),the degree of injury was detected by lactate dehydrogenase(LDH)assay,the cell cycle was detected withFlow cytometry and the expression of RIP3/RIP1/mixed lineage kinase domain like(MLKL),Akt/p-Akt/ mTOR/p-mTOR and Caspase-8/X-linked inhibitor of apoptosis protein(XIAP)were detected by Western Blot assay at 6 h post-CCI among Ctrl,CIC and GSK’872 groups.ResultsCompared with the CIC group,cells treated with GSK’872 exhibited an increase in number[(244.67±11.68)vs(190.67±15.28), t=4.865,P＜0.01]and area [(260.14±16.81)μm2vs(175.91±15.00)μm2,t=6.476,P＜0.01],however,a reduction in thickness[(6.12±0.47)μm vs(8.04±0.48)μm,t=4.942,P＜0.01]with DHM.In the presence of GSK’872,the leakage of LDH was sharply decreased compared with the CIC group [(222.74±11.06) ng/l vs(275.93±12.26)ng/l,t=5.581,P＜0.01].What’s more,GSK’872 could convert the alteration of cell cycle and cell death[Sub-G1：(0.33±0.15)%vs(6.51±0.63)%,t=16.530,P＜0.01;G0/G1(46.67±2.96)%vs (33.04±7.07)%,t=3.085,P＜0.05]compared to the CIC group.Furthermore,GSK’872 treatment could significantly decrease the levels of RIP3[(0.73±0.04)vs(1.09±0.09),t=6.239,P＜0.01],RIP1[(0.75±0.05)vs (0.91±0.05),t=4.211,P＜0.05],MLKL[(0.56±0.03)vs(0.70±0.04),t=4.785,P＜0.01],Akt[(0.49±0.05) vs(0.77±0.05),t=6.763,P＜0.01],p-Akt[(0.88±0.05)vs(1.06±0.05),t=4.509,P＜0.05],mTOR[(0.81± 0.02)vs(0.90±0.05),t=2.813,P＜0.05],p-mTOR[(0.65±0.05)vs(1.00±0.05),t=8.413,P＜0.01],XIAP[(0.50± 0.05)vs(0.73±0.05),t=5.814,P＜0.01],but increase the level of Caspase-8[(0.96±0.05)vs(0.75±0.05),t= 5.351,P＜0.01]compared with CIC group.ConclusionNecroptosis induced by RIP3 may play an important role in stretch injury model of HT-22 cells,what’s more,GSK’872 could reduce the degree of injury after CIC,which reveals that RIP3 may be a new targetfor clinicaltreatmentof TBIin the future.

Traumatic brain injury; Stretch injury; Necroptosis; Receptor-interacting protein 3;GSK’872;HT-22 cells

2017-05-05）

10.3877/cma.j.issn.2095-9141.2017.03.008

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31200809）；武警部隊(duì)后勤科研項(xiàng)目（WJHQ2012-20）；軍隊(duì)技術(shù)產(chǎn)品研究重大項(xiàng)目（AWS15J001）；天津市科技計(jì)劃項(xiàng)目（15ZXLCSY00040）

300162 天津，武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院腦科醫(yī)院1；100621 北京，北京武警總隊(duì)三支隊(duì)衛(wèi)生隊(duì)2

程世翔，Email：shixiangcheng@vip.126.com