王智榮，崔春，趙謀明

(華南理工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣州 510640)

HPLC-ELSD測(cè)定草石蠶低聚糖含量的研究

王智榮，崔春*，趙謀明

(華南理工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣州 510640)

建立了高效液相色譜法(HPLC-ELSD)測(cè)定草石蠶中低聚糖含量的方法。采用蒸發(fā)光檢測(cè)器(ELSD)，色譜柱為Waters XBridge Amide色譜柱(4.6 mm×250 mm，3.5 μm)，流動(dòng)相為乙腈(A)-水(B)，分別添加0.2%(V/V)三乙胺，梯度洗脫(A%為70%→45%→70%→70%，相應(yīng)時(shí)間周期為0 min→16 min→16.01 min→20 min)，流速1.0 mL/min，柱溫35 ℃。結(jié)果表明：蔗糖、棉籽糖、水蘇糖在0.1～3.0 g/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)不小于0.9986；相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.49%～1.67%(n=5)；平均回收率分別為97.78%,97.99%,97.85%。干基草石蠶中蔗糖、棉籽糖、水蘇糖含量分別為(6.38±0.10)%,(2.72±0.08)%,(43.38±0.25)%。

草石蠶；低聚糖；高效液相色譜；蒸發(fā)光檢測(cè)器

草石蠶(StachyssieboldiiMiq.)，又稱(chēng)地蠶、螺絲菜、寶塔菜、甘露子、地牯牛草、土蟲(chóng)草、石蠶，屬于唇形科多年生草本植物[1]。研究表明[2]：草石蠶營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富，每1 kg草石蠶中含蛋白質(zhì)55 g、脂肪3 g、碳水化合物203 g，還含有多種礦物質(zhì)、維生素和膽堿等。草石蠶的根莖中以低聚糖為主，尤其含有大量的水蘇糖，幾乎不含淀粉和單糖[3]。

水蘇糖(Stachyose)是天然存在的一種功能性低聚四糖，具有穩(wěn)定性高、低甜度、低熱量的特點(diǎn)，能夠明顯促進(jìn)胃腸道內(nèi)雙歧桿菌、乳酸桿菌等有益菌群的增殖，迅速改善人體消化道內(nèi)環(huán)境，調(diào)節(jié)微生物菌群平衡，被譽(yù)為“天然超強(qiáng)雙歧因子”[4-6]。

檢測(cè)低聚糖的方法有高效液相色譜法、薄層色譜法和氣相色譜法[7,8]。其中，薄層色譜法具有消耗成本低、分析速度快、檢測(cè)時(shí)間短的優(yōu)點(diǎn)，但是利用薄層色譜法做低聚糖的定量有較大的誤差，而且只能在負(fù)荷量很小的條件下才能達(dá)到滿意的分析結(jié)果；而采用氣相色譜法，需要將樣品制備成易于揮發(fā)并且對(duì)熱足夠穩(wěn)定的衍生物以后才能進(jìn)行測(cè)定。相比之下，高效液相色譜法則可以直接對(duì)提取得到的低聚糖進(jìn)行檢測(cè)分析，具有無(wú)需衍生、分離效能高、無(wú)干擾等優(yōu)點(diǎn)，而且還可以減少檢測(cè)過(guò)程中樣品糖分的損失。但目前使用高效液相色譜法檢測(cè)低聚糖的報(bào)道中，多以示差檢測(cè)器測(cè)定，其靈敏度低，系統(tǒng)平衡時(shí)間長(zhǎng)，所需標(biāo)準(zhǔn)品量大，受外界條件影響較大[9,10]。本研究采用蒸發(fā)光檢測(cè)器(ELSD)對(duì)草石蠶低聚糖進(jìn)行分析，建立了草石蠶低聚糖的HPLC-ELSD檢測(cè)方法，該方法操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

Agilent-1200系列高效液相色譜儀；Alltech 2000ES 蒸發(fā)光散射檢測(cè)器 美國(guó)格瑞斯公司；Waters XBridge Amide色譜柱(4.6 mm×250 mm，3.5 μm)；DS-8510超聲波發(fā)生器 上海生析超聲儀器有限公司；Milli-Q 超純水制備器 美國(guó)Millipore公司。

1.2 試劑

水蘇糖、棉籽糖(純度98.0%，Sigma公司)；葡萄糖、蔗糖(純度99.0%，Aladdin公司)；乙腈(色譜純，RCI Labscan Limited 公司)；草石蠶根莖購(gòu)于甘肅鎮(zhèn)原縣，曬干粉碎；水為Millipore制備的超純水；所有溶劑和樣品溶液均用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾；其他試劑均為分析純。

2 試驗(yàn)材料與方法

2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

2.1.1 單標(biāo)儲(chǔ)備液的配制

分別準(zhǔn)確稱(chēng)取蔗糖、棉籽糖、水蘇糖標(biāo)準(zhǔn)品250 mg，用乙腈-水(體積比50∶50)溶解并定容至25 mL，配成10 g/L的甜味劑單標(biāo)儲(chǔ)備液。

2.1.2 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

將各糖類(lèi)單標(biāo)儲(chǔ)備液采用逐級(jí)稀釋的方法，采用乙腈-水(體積比50∶50)配制成濃度為0.1～3.0 g/L的系列混合標(biāo)準(zhǔn)液，所有單標(biāo)儲(chǔ)備液和混合標(biāo)準(zhǔn)液均置于冰箱0～4 ℃下保存。

2.2 樣品的制備

草石蠶根莖曬干，粉碎。精確稱(chēng)取草石蠶粉末樣品1.000 g，置于錐形瓶中，精密加入50 mL超純水，超聲處理(功率250 W，頻率35 kHz)5 min。將浸提液置于高速冷凍離心機(jī)以8000 r/min離心10 min。取上清液，稀釋至合適濃度，經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾，濾液供分析用。

2.3 色譜條件的篩選

2.3.1 流動(dòng)相的選擇

[11,12]和XBridge Amide色譜柱應(yīng)用文集，經(jīng)過(guò)反復(fù)試驗(yàn)，最終確定梯度洗脫流動(dòng)相：乙腈(A)，水(B)，分別添加0.2%(V/V)三乙胺。梯度洗脫(A%為70%→45%→70%→70%，相應(yīng)時(shí)間周期為0 min→16 min→16.01 min→20 min)。此條件下所得到的供試品色譜圖分離度均能達(dá)到要求，檢出的樣品色譜峰分離度好、峰形尖、對(duì)稱(chēng)性好，見(jiàn)圖1。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖

2.3.2 柱溫的選擇

柱溫不僅影響色譜峰保留時(shí)間的遷移，而且影響色譜的分離效果。本試驗(yàn)考察了30,35,40 ℃ 3種不同柱溫下的HPLC檢測(cè)。結(jié)果表明：當(dāng)溫度升高時(shí)，保留時(shí)間縮短并且柱效較高，但是部分峰位會(huì)產(chǎn)生相對(duì)位移與合并，所以本研究選擇在柱溫35 ℃時(shí)進(jìn)行檢測(cè)。

2.3.3 流速的選擇

參考XBridge Amide色譜柱應(yīng)用文集，隨著檢測(cè)流速的增大，色譜峰的保留時(shí)間會(huì)逐漸縮短，但是流速升高的同時(shí)色譜柱的柱壓也會(huì)隨之上升，從而間接地影響色譜柱的壽命，并且大流速時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，也會(huì)導(dǎo)致色譜柱的柱效降低，從而導(dǎo)致混合物的分離度變差，所以設(shè)定流速為1 mL/min。

2.3.4 ELSD參數(shù)的選擇

載氣壓力和漂移管溫度是ELSD檢測(cè)器的2個(gè)重要參數(shù)。不同壓力對(duì)應(yīng)不同流速，而載氣流速將會(huì)影響霧化器中液滴的形成，從而影響檢測(cè)器的信噪比。漂移管溫度影響檢測(cè)器的響應(yīng)，溫度升高，流動(dòng)相蒸發(fā)趨于完全，信噪比上升，但溫度過(guò)高，可能導(dǎo)致分析物部分汽化，信號(hào)響應(yīng)值反而變小。所以，本試驗(yàn)條件下確定漂移管溫度為95 ℃；載氣流速為2.5 L/min。

3 結(jié)果與討論

3.1 線性關(guān)系及檢出限

根據(jù)草石蠶樣品低聚糖含量的差異，對(duì)蔗糖、棉籽糖、水蘇糖做了不同線性范圍的考察。將10 g/L的低聚糖單標(biāo)溶液依次稀釋配制成3，2，1，0.5，0.2，0.1 g/L的系列混合標(biāo)準(zhǔn)液，在最佳條件下檢測(cè)，以糖類(lèi)物質(zhì)的峰面積(Y)對(duì)其質(zhì)量濃度(X，g/L)進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 蔗糖、棉籽糖和水蘇糖的線性范圍、線性關(guān)系、相關(guān)系數(shù)和檢測(cè)限

由表1可知，蔗糖、棉籽糖、水蘇糖在0.1～3.0 g/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)不小于0.9986，檢出限均不大于0.01 g/L(以極限噪音3倍的方法計(jì)算)。

3.2 精密度試驗(yàn)

取蔗糖標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.2600 g/L)、棉籽糖標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.1100 g/L)和水蘇糖標(biāo)準(zhǔn)溶液(2.2500 g/L)，重復(fù)進(jìn)樣5次，測(cè)定峰面積，結(jié)果見(jiàn)表2。各組分峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.49%～1.67%，表明儀器精密度良好。

表2 蔗糖、棉籽糖和水蘇糖含量測(cè)定的精密度

3.3 回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

取已知含量的草石蠶樣品提取液5份，稀釋至合適濃度。準(zhǔn)確量取10 mL樣品提取稀釋液，精密加入蔗糖、棉籽糖和水蘇糖對(duì)照品，制備成加樣回收供試品溶液。在色譜最佳條件下檢測(cè)，測(cè)定各糖類(lèi)物質(zhì)的含量，按下式計(jì)算回收率，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 蔗糖、棉籽糖和水蘇糖加標(biāo)回收率(n=5)

續(xù) 表

3.4 樣品測(cè)定

將草石蠶提取液稀釋至合適濃度，在上述色譜條件下進(jìn)樣10 μL，平行5次。將測(cè)得的峰面積代入線性回歸方程，計(jì)算各糖類(lèi)的含量，測(cè)得結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 樣品中蔗糖、棉籽糖和水蘇糖含量(n=5)

在本文色譜條件下，草石蠶樣品中的低聚糖能夠有效分離，且峰型較好，見(jiàn)圖2。

圖2 樣品的色譜圖

4 結(jié)論

本研究首次報(bào)道了利用Waters XBridge Amide色譜柱測(cè)定草石蠶中低聚糖含量，通過(guò)優(yōu)化色譜條件，建立了高效液相色譜-蒸發(fā)光檢測(cè)測(cè)定草石蠶中低聚糖含量的方法。該方法靈敏度高、重現(xiàn)性和回收率好，能準(zhǔn)確、快速檢測(cè)出草石蠶的蔗糖、棉籽糖、水蘇糖含量。蔗糖、棉籽糖、水蘇糖在0.1～3.0 g/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)不小于0.9986；相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.49%～1.67%(n=5)；平均回收率分別為97.78%，97.99%，97.85%。干基草石蠶根莖中蔗糖、棉籽糖、水蘇糖含量分別為(6.38±0.10)%，(2.72±0.08)%，(43.38±0.25)%。

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Research on Determination of Oligosaccharide inStachyssieboldiiMiq. by HPLC-ELSD

WANG Zhi-rong， CUI Chun*， ZHAO Mou-ming

(School of Food Science and Engineering, South China University of Technology, Guangzhou 510640, China)

Establish a HPLC-ELSD method for the determination of oligosaccharide inStachyssieboldiiMiq..The sample is separated on a Waters XBridge Amide column(4.6 mm×250 mm,3.5 μm)at 35 ℃ by ELSD and eluted with acetonitrile(A)-aqueous(B) solution added 0.2%(V/V)triethylamine respectively,gradient elution(A% is 70%→45%→70%→70%, the corresponding time period is 0 min→16 min→16.01 min→20 min)at a flow rate of 1.0 mL/min.The results show that there is a good linear range for sucrose,raffinose and stachyose in the quality concentration range of 0.1～3.0 g/L with a correlation coefficient no less than 0.9986,the relative standard deviations are 1.49%～1.67%(n=5),and the average recoveries are 97.78%,97.99% and 97.85% respectively.The sucrose,raffinose and stachyose inStachyssieboldiiMiq. are (6.38±0.10)%,(2.72±0.08)% and (43.38±0.25)% respectively.

StachyssieboldiiMiq.;oligosaccharide;HPLC;ELSD

2016-12-25 *通訊作者

國(guó)家863項(xiàng)目(2014AA093602)；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專(zhuān)項(xiàng)(2014220053)

王智榮(1990-)，男，湖南萊陽(yáng)人，碩士，研究方向：食品生物技術(shù)；

崔春(1978-)，男，湖北洪湖人，教授，博士，研究方向：食品生物技術(shù)。

TS207.3

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.06.024

1000-9973(2017)06-0114-04