施樹，蔣厚陽，羅章

(1.重慶旅游職業(yè)學(xué)院，重慶409000；2.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶北碚400700；3.西藏大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，西藏林芝860000)

西藏不同地區(qū)黑木耳多樣性分析

施樹1，蔣厚陽2，羅章3*

(1.重慶旅游職業(yè)學(xué)院，重慶409000；2.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶北碚400700；3.西藏大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，西藏林芝860000)

運(yùn)用酯酶同工酶酶譜分析和ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對3株西藏野生黑木耳親緣性和遺傳多樣性進(jìn)行分析。運(yùn)用丙烯酰胺蛋白電泳技術(shù)對野生黑木耳中酯酶同工酶進(jìn)行電泳；運(yùn)用PCR-ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對野生黑木耳DNA進(jìn)行隨機(jī)擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳。用Ntsys 2.10e和PopGen32軟件對電泳結(jié)果進(jìn)行聚類和遺傳分析。結(jié)果表明：3株野生黑木耳中察隅和魯郎地區(qū)樣品的親緣性關(guān)系較近，樣品間遺傳分化指數(shù)高。結(jié)論：本實(shí)驗為西藏地區(qū)野生黑木耳品種分類、資源保護(hù)和新品種培育提供了初步依據(jù)。

西藏；野生黑木耳；酯酶同工酶；ISSR

西藏位于我國西南邊陲，平均海拔在4000m以上，是青藏高原的主體部分?？諝庀”　鈮旱?、含氧量少、輻射強(qiáng)、日照時間上、日溫差大、全年分為明顯的干季和雨季。這些氣候條件賦予了西藏地區(qū)獨(dú)特的作物資源。黑木耳在真菌學(xué)上的分類屬擔(dān)子菌綱，木耳目，木耳科[1]，是人們餐桌上的常見食物，具有豐富的營養(yǎng)。目前還沒有人對西藏地區(qū)野生黑木耳在基因型上進(jìn)行研究，運(yùn)用分子標(biāo)記技術(shù)對物種親緣關(guān)系和遺傳多樣性進(jìn)行分析，可以為雜交育種培養(yǎng)新品種提供依據(jù)，從而培育出高營養(yǎng)的優(yōu)勢黑木耳菌株。

同工酶電泳技術(shù)在生物進(jìn)化研究中得到廣泛地應(yīng)用，在分子發(fā)生、進(jìn)化、分析標(biāo)記和遺傳上的研究也越來越重要，主要應(yīng)用于物種鑒定、酶譜鑒定、遺傳育種分子標(biāo)記、群體差異統(tǒng)計等[2-3]。ISSR標(biāo)記技術(shù)由Zietkiewicz等創(chuàng)建，是一種建立在PCR反應(yīng)基礎(chǔ)上的DNA分子標(biāo)記[4]。廣泛地應(yīng)用于物種鑒定[5]、基因定位[6]、遺傳作圖[7]、遺傳多樣性[8]等研究。該技術(shù)不需要知道檢測物質(zhì)的基因組序列，操作簡單，成本低，靈敏度高[9]。

本研究將酯酶同工酶酶譜分析和ISSR分子標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用于西藏野生黑木耳的基因型研究中，通過丙烯酰胺蛋白電泳對酯酶同工酶酶譜分析，從4種隨機(jī)引物種選擇最佳引物，對野生黑木耳DNA進(jìn)行隨機(jī)擴(kuò)增，通過瓊脂糖電泳進(jìn)行檢測。用Ntsys 2.10e，PopGen32軟件對電泳圖譜進(jìn)行分析，以探討西藏不同地區(qū)黑木耳之間的親緣關(guān)系，為今后建立野生黑木耳資源庫，培育新品種打下基礎(chǔ)，同時也探討酯酶同工酶酶譜分析和ISSR分子標(biāo)記技術(shù)在黑木耳的分類鑒定方面的應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 供試菌株。供試野生黑木耳分別采自西藏亞東、魯朗和察隅3個地區(qū)，菌株的編號為A-C。

1.1.2 試劑。磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、蔗糖、溴酚藍(lán) 重慶滴水化學(xué)藥品責(zé)任有限公司；Acrylamide、Bis-acrylamide、過硫酸銨、Glycine TEMED、乙酸-1-萘酯、乙酸-2-萘酯、固蘭RR鹽 上海生工；100bp DNA ladder、Taq酶(5U/uL)、dNTPs(10mmol/L)、10×酶緩沖液、MgCl2(25mM) 寶生物有限公司；1kb DNA ladder、EDTA Na2、Tris-base、Guanidine Thiocyanate、DEPC加拿大BBI；瓊脂糖 西班牙Agarose； Gelred核酸染料 美國BIOTIUM。引物合成 上海生工。

1.2 儀器與設(shè)備

HB031金屬恒溫加熱器 上海博彩生物技術(shù)有限公司；SIM-F140AY65型制冰機(jī) 三洋國際貿(mào)易有限公司；1-15PK小型臺式離心機(jī) 德國sigma實(shí)驗室離心機(jī)公司；Biospec-mini型島津DNA/RNA/蛋白質(zhì)分析裝置，島津制作所；S1000伯樂 1000系列高性能PCR儀，美國BIO-RAD；164-5050伯樂基礎(chǔ)電源電泳儀，美國BIO-RAD；Syngene GeneGenius 凝膠成像系統(tǒng)，基因有限公司；GL-88B渦旋混合器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司； SW-CJ-1F型單人雙面凈化工作臺。

1.3 方法

1.3.1 野生黑木耳酯酶同工酶的提取及電泳。黑木耳酯酶同工酶的提取、電泳和染色參照NY/T 1097-2006[10]中的方法。

1.3.2 野生黑木耳基因組DNA的提取。將干的黑木耳用液氮進(jìn)行充分研磨，然后參照NY/T 1730-2009[11]中的方法提取樣品中的DNA。提取的DNA保存于-20℃冰箱中。測定提取DNA的OD260，OD280及OD260/OD280數(shù)值，利用公式c= OD260×50(μg/mL) ×n(稀釋倍數(shù))[12]計算出DNA濃度，為后續(xù)實(shí)驗提供數(shù)據(jù)。

1.3.3 ISSR隨機(jī)引物的篩選和反應(yīng)條件的建立。隨機(jī)引物的篩選：通過對4條不同隨機(jī)擴(kuò)增引物(表1)進(jìn)行PCR反應(yīng)，根據(jù)條帶的多態(tài)性和亮度選擇出最適引物，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗。

表1 隨機(jī)引物編號及序列

根據(jù)參考文獻(xiàn)[13]設(shè)定PCR反應(yīng)程序為：94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s；相應(yīng)褪火溫度(表1)1：00min；72℃延伸1：30min；35個循環(huán)，然后72℃延伸10min。PCR反應(yīng)體系為：50ng模板DNA，10×Taq酶緩沖液(無Mg2+)2.5μL，2.5 mM MgCl22.5μL，10mmol/L dNTPs 0.5μL，10μmol/L引物2μL，5U/μL Taq 酶0.2μL。

1.3.4 ISSR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳分離。取10μL擴(kuò)增產(chǎn)物與2μloading buffer混勻，點(diǎn)樣于凝膠孔，用1kb DNA ladder作為分子量標(biāo)尺，電泳緩沖液為1×TAE，70V恒壓電泳60min，gelred染色后通過凝膠呈像系統(tǒng)拍照。

1.3.5 酯酶同工酶酶譜和ISSR譜帶分析

酯酶同工酶酶譜分析：酯酶同工酶相對遷移率(Rf)[14]：Rf=X2/X1，在式中X1為固定染色前凝膠中指示劑遷移距離，X2為固定染色后凝膠中酶蛋白區(qū)帶的遷移距離。根據(jù)相對遷移率的結(jié)果，特定遷移率上無條帶賦值為0，有條帶賦值為1，用NTsys2.10e制作為“0，1”文件，采用UPGMA(Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean)法進(jìn)行聚類分析，并構(gòu)建各菌株的遺傳距離聚類圖。采用PopGen32軟件分析樣品的遺傳多樣性及香農(nóng)指數(shù)等數(shù)值。

ISSR分子標(biāo)記分析：各菌株的電泳圖譜上特定位點(diǎn)無條帶的賦值為0，有條帶的賦值為1，用NTsys2.10e制作為“0，1”文件，采用UPGMA(Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean)法進(jìn)行聚類分析，并構(gòu)建各菌株的遺傳距離聚類圖。采用PopGen32軟件分析樣品的遺傳多樣性及香農(nóng)指數(shù)等數(shù)值。

2 結(jié)果與分析

2.1 酯酶同工酶電泳圖

3株西藏野生黑木耳經(jīng)過PAGE丙烯酰胺電泳后，所有菌株均擴(kuò)增出明顯的條帶，個菌株間存在明顯的差異性，擴(kuò)增出的條帶的1～4條，Rf值0.4～0.8，其中察隅和魯郎2個樣品的相似條帶較多，亞東與察隅和魯郎沒有相似條帶。圖1顯示了三株野生黑木耳的電泳圖。

注：A為電泳圖，B為模式圖

圖1 西藏野生黑木耳酯酶同工酶電泳圖

2.2 ISSR分子標(biāo)記電泳圖

3株西藏野生黑木耳菌株用P4引物擴(kuò)增后，所有菌株均擴(kuò)增出明顯的條帶，各個菌株之間也存在特異性，擴(kuò)增出的條帶數(shù)目在3～4條，所獲得的片段分子量大小在250～3000，圖2顯示了3株野生黑木耳擴(kuò)增后的電泳圖。

注：marker為寶生物有限公司100bp DNA ladder

圖2 西藏野生黑木耳ISSR擴(kuò)增圖譜

2.3 聚類分析

用NTsys2.10e軟件，對所得擴(kuò)增圖譜的條帶進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理，分別得出3株野生黑木耳酯酶同工酶和ISSR分子標(biāo)記后的遺傳相似系數(shù)矩陣，結(jié)果見表2。通過酯酶同工酶分析得到3株野生黑木耳遺傳相似系數(shù)0.20～0.80，其中魯郎和察隅之間的相似性系數(shù)最大，說明它們之間的親緣性最近。而亞東與魯郎、察隅之間的相似性較小，說明它們之間的親緣性關(guān)系較遠(yuǎn)。 通過ISSR分子標(biāo)記得到的結(jié)果與酯酶同工酶分析得到的結(jié)果相近。3株野生黑木耳遺傳相似系數(shù)0.57～0.86，魯郎與察隅之間的相似性系數(shù)較大，亞東與魯郎和察隅之間的差異較大。

表2 供試菌株間的遺傳相似系數(shù)矩陣

圖3 西藏野生黑木耳酯酶同工酶分析親緣關(guān)系聚類樹狀圖

圖4 西藏野生黑木耳ISSR分析親緣關(guān)系聚類樹狀圖

用NTsys2.10e軟件，按照UPMGA法，對供試菌株之間的遺傳相似系數(shù)矩陣進(jìn)行聚類分析，得到聚類分析圖3和圖4。由圖3可知，當(dāng)相似性系數(shù)為0.1時，3株野生黑木耳被分為了2組。第一組為亞東地區(qū)樣品，第二組包括察隅和魯郎地區(qū)樣品。由圖4可知，當(dāng)相似性系數(shù)為0.64時，3株野生黑木耳被分為了2組，分組的結(jié)果同酯酶同工酶分析結(jié)果相同。

2.4 遺傳多樣性分析

采用PopGen32軟件分析供試野生黑木耳的遺傳多樣性和香濃指數(shù)等數(shù)值。由表3分析可以看出，酯酶同工酶酶譜分析和ISSR分子標(biāo)記分析所得到的遺傳多樣性指數(shù)和香濃指數(shù)都較高，說明西藏野生黑木耳具有很高的遺傳分化價值，可以通過雜交育種培育黑木耳新品種。同時也可以看到樣品間的多態(tài)性位點(diǎn)百分率同樣具有很高的數(shù)值，這些都表明西藏野生黑木耳間有很高的遺傳分化潛力。

表3 西藏野生黑木耳遺傳多樣性的統(tǒng)計

3 討論

西藏地區(qū)具有由于其獨(dú)特的氣候和地理條件，具有獨(dú)特的作物資源。黑木耳做為日常飲食中的常見食物，具有很高的研究價值，對其親緣性和遺傳性進(jìn)行分析，對當(dāng)?shù)嘏嘤谀径缕贩N具有很大的借鑒作用。

目前還沒有對于西藏地區(qū)野生黑木耳進(jìn)行分子水平方面研究的報道，所以將酯酶同工酶酶譜分析和ISSR分子標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用于西藏野生黑木耳親緣性和遺傳性分析具有非常重要的意義。國內(nèi)外很多學(xué)者已經(jīng)將酯酶同工酶酶譜分析和ISSR分子標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用于食用菌分析中。Wang等[15]人運(yùn)用RAPD和ISSR技術(shù)對中國的杏鮑菇基因多樣性進(jìn)行研究。Du等[16]人運(yùn)用ISSR技術(shù)對中國野生毛木耳菌群基因多樣性進(jìn)行了研究。Zhang等[17]人研究了培養(yǎng)時間對于黑木耳酯酶同工酶酶譜的影響。趙勇[18]等人將酯酶同工酶和RAPD技術(shù)應(yīng)用于香菇雜交優(yōu)勢研究中。

本研究探討了酯酶同工酶酶譜分析和ISSR分子標(biāo)記技術(shù)在西藏野生黑木耳親緣性和遺傳性中的應(yīng)用。用NTsys 2.10e軟件計算出了3株野生黑木耳之間的遺傳相似系數(shù)矩陣，并用UPMGA法作聚類分析圖，用PopGen32軟件計算出了3株野生黑木耳之間的遺傳多樣性數(shù)據(jù)。綜合酯酶同工酶和ISSR分子標(biāo)記分析，察隅和魯郎2個地區(qū)的樣品親緣性關(guān)系較近，3個地區(qū)的樣品具有很高的遺傳分化指數(shù)，為培養(yǎng)新型黑木耳雜交品種提供了理論基礎(chǔ)。

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Analysis of Genetic Diversity and Relationship of Black Fungus from Different Regions of Tibet

Shi Shu1,Jiang Houyang2,Luo Zhang3*

(1. Chongqing Vocational Institute of Tourism,Qianjiang, 409000;2. Southwest University,Beibei, Chongqing 400700;3. Agriculture and Animal Husbandry College of Tibet University,Linzhi, Tibet 860000)

Analysis genetic diversity and relationship of black fungus from different regions of Tibet by method of esterase isozyme enzyme spectrum and ISSR molecular markers. Using acrylamide protein electrophoresis technology on esterase isozyme of wild black fungus for electrophoresis; take a random amplificatioon of wild fungus by PCR-ISSR molecular marker techonlogy. Conduct product electrophoresis in agarose gel. Clustering and inheritance were analyzed by Ntsys 2.10 and PopGen32 software. Result shows: Samples of Lulang and Chayu have a closer relationship among wild fungus, there is a high genetic differentiation index among samples. This study provides a preliminary basis for species classification and hybrid of wild fungus of Tibet.

Tibet; Black fungus; Esterase isozyme; ISSR

2017-03-07

西藏自治區(qū)自然基金資助項目

施樹(1978-)，男，講師，主要從事食品化學(xué)與營養(yǎng)學(xué)研究，E-mail:shishu1978@163.com；*通訊作者：羅章(1965-)，男，教授，從事農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏研究。

S646.6

A

DOI.:10.13268/j.cnki.fbsic.2017.03.004