陳淑敏，劉怡,李淑娜，何姝儀，許予馨，張文玲

(1.中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系，長(zhǎng)沙410013；2.珠海市婦幼保健院檢驗(yàn)科，廣東珠海 519000)

·研究生園地·

全反式維甲酸對(duì)人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞增殖及APLNR基因表達(dá)的影響*

陳淑敏1，劉怡1,李淑娜2，何姝儀1，許予馨1，張文玲1

(1.中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系，長(zhǎng)沙410013；2.珠海市婦幼保健院檢驗(yàn)科，廣東珠海 519000)

目的 探討全反式維甲酸(ATRA)對(duì)人肺腺癌細(xì)胞系A(chǔ)549細(xì)胞增殖及APLNR(apelin receptor)基因表達(dá)的影響。方法 采用四甲基偶氮唑藍(lán) (methyl thiazolyl tetrazolium，MTT) 比色法檢測(cè)ATRA對(duì)體外培養(yǎng)的A549細(xì)胞增殖的抑制情況，光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)改變，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期及凋亡，western blot檢測(cè)APLNR蛋白、cyclin D1及p16蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果 經(jīng)ATRA作用后，A549 細(xì)胞增殖受到明顯抑制且抑制程度呈劑量及時(shí)間依賴性(P均<0.01);其細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，細(xì)胞周期被阻滯于G0/G1期且細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.01)；western blot結(jié)果顯示,隨著ATRA濃度的升高，APLNR蛋白及cyclin D1蛋白的表達(dá)水平降低，而p16蛋白的表達(dá)水平升高(P均<0.01)。 結(jié)論 ATRA可抑制A549細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡，且能下調(diào)APLNR基因的表達(dá)。

全反式維甲酸；肺癌A549細(xì)胞；增殖；凋亡；APLNR

自維甲酸衍生物全反式維甲酸(All-trans-retinoic acid，ATRA) 首次被用于急性早幼粒細(xì)胞白血病的臨床治療，為ATRA治療惡性腫瘤提供了成功的范例后，關(guān)于 ATRA與腫瘤細(xì)胞間的研究逐年增多[1]。研究顯示，ATRA對(duì)肝癌細(xì)胞[2]、肺癌細(xì)胞[3]、乳腺癌細(xì)胞[4]、膠質(zhì)干細(xì)胞[5]等實(shí)體腫瘤細(xì)胞也具有增殖抑制作用。APLNR(apelin receptor)基因又稱APJ基因或AGTRL1基因，在促進(jìn)細(xì)胞增殖和新生血管形成的過程中發(fā)揮著重要的作用,研究發(fā)現(xiàn),其過表達(dá)與某些腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[6]。有關(guān)ATRA對(duì)體外培養(yǎng)的肺癌細(xì)胞增殖的作用及與APLNR表達(dá)的關(guān)系在國(guó)內(nèi)尚未見報(bào)道。本研究以人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549為研究對(duì)象，用ATRA進(jìn)行處理，觀察A549細(xì)胞增殖、凋亡及APLNR蛋白表達(dá)的變化，以期為臨床合理實(shí)施化學(xué)治療提供新的依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料 A549細(xì)胞系來源于中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系實(shí)驗(yàn)中心；RPMI-1640 培養(yǎng)基、胎牛血清(美國(guó)Gibco公司)；ATRA、MTT(美國(guó)Sigma公司)；全蛋白質(zhì)提取試劑盒、BCA蛋白質(zhì)提取試劑盒(南京凱基公司)；兔單克隆抗體GAPDH、cyclinD1、p16(英國(guó)Abcam公司)；兔抗人APLNR多克隆抗體(美國(guó)Proteintech公司)；辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔 IgG (北京中杉金橋公司)；ECL化學(xué)發(fā)光液(美國(guó)Advansta WesternBright公司)；CKX41型倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；流式細(xì)胞儀(美國(guó)Coulter公司)；化學(xué)發(fā)光凝膠成像分析儀(美國(guó)Bio-Rad公司)

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 用含10%胎牛血清(FBS)的 RPMI-1640培養(yǎng)液，在37 ℃、5% CO2、飽和濕度的條件下進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。細(xì)胞融合度達(dá)80%～90%時(shí)傳代，實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞均處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

1.2.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期且生長(zhǎng)狀態(tài)良好的A549細(xì)胞用2.5 g/L胰蛋白酶室溫消化1～2 min。用完全培養(yǎng)基(RPMI-1640+10% FBS)調(diào)節(jié)細(xì)胞懸液濃度。以 5×103/孔接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，分別設(shè)置對(duì)照組(僅含細(xì)胞、培養(yǎng)基以及無水乙醇)、空白組(只加入培養(yǎng)基)及實(shí)驗(yàn)組(濃度分別為3、9、27、81、243 μmol/L ATRA), 每組各設(shè)6個(gè)復(fù)孔。在37 ℃、5% CO2、飽和濕度的條件下培養(yǎng)18 h，更換為完全培養(yǎng)基或含ATRA的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng) 1、2、3、4、5、6 d，每d各取1塊96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，在同一時(shí)間內(nèi)加入 MTT (5 g/L ) 20 μL，在5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，加入150 μL DMSO，恒溫低速振搖20 min，于酶聯(lián)儀490 nm處檢測(cè)A490 nm值。根據(jù)公式：細(xì)胞存活率(%)=(實(shí)驗(yàn)組A490 nm值-空白組A490 nm值)/ (對(duì)照組A490 nm值-空白組A490 nm值)×100%計(jì)算，并繪制生長(zhǎng)曲線，利用藥物濃度及細(xì)胞抑制率(細(xì)胞抑制率=1-細(xì)胞存活率)計(jì)算出半抑制濃度 (IC50)值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 光學(xué)顯微鏡觀察ATRA對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響 用無水乙醇配制10-2mol/L ATRA貯存液，置-20 ℃避光保存，使用前用培養(yǎng)液配制成所需濃度。取上述A549細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度，接種至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔接種2 mL(即5×104/孔)，設(shè)置實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，其中實(shí)驗(yàn)組以30 μmol/L ATRA(10-2mol/L ATRA貯存液溶于完全培養(yǎng)基)處理，對(duì)照組不加藥物(與實(shí)驗(yàn)組相同體積的無水乙醇溶于完全培養(yǎng)基)處理，于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的條件下培養(yǎng)4 d, 倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期及凋亡率 以5×104/孔的細(xì)胞密度接種對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，設(shè)置實(shí)驗(yàn)組(分別用30、50 μmol/L ATRA處理)與對(duì)照組(不加ATRA)。于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng) 4 d，后收集實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞于離心管中， 1 000 r/min離心5 min,棄上清， PBS重懸細(xì)胞，1 000 r/min離心 5 min,重復(fù)2次，75%冰乙醇重懸細(xì)胞，4 ℃固定過夜。將固定完成的細(xì)胞懸液1 000 r/min離心5 min, 棄上清，PBS重懸細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，棄上清以除去固定液。向細(xì)胞中加入100 μL RNA酶，37 ℃水浴30 min以完全除去RNA酶，加入溴化丙錠(PI)染色液混勻，37 ℃避光30 min，輕彈離心管，使用流式細(xì)胞儀及Cell Quest軟件對(duì)待檢細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞周期檢測(cè)，每次分析1×106個(gè)細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.2.5 western blot檢測(cè)細(xì)胞周期蛋白及APLNR蛋白表達(dá)情況 取上述A549細(xì)胞(5×104/孔)接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng) 4 d后收集。設(shè)置實(shí)驗(yàn)組(采用10、30、50 μmol/L ATRA處理)與對(duì)照組(不加ATRA)。根據(jù)全蛋白質(zhì)提取試劑盒和BCA蛋白質(zhì)提取試劑盒說明書操作提取上述A549 細(xì)胞的總蛋白質(zhì)并進(jìn)行定量。按照40 μg總蛋白質(zhì)上樣，經(jīng)12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(濃縮膠80 V/30 min、分離膠120 V/90 min)，冰水浴中100 V、60 min 條件下電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。37 ℃、50 g/L脫脂牛奶 (TBST配制)封閉2 h，分別加入兔單克隆抗體cyclinD1(1∶10 000稀釋)、兔單克隆抗體p16 (1∶2 000稀釋)、兔抗人多克隆抗體APLNR (1∶800稀釋) 、兔單克隆抗體GAPDH(1∶10 000稀釋)4 ℃過夜。TBST洗滌3次，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶5 000稀釋) 37 ℃溫育1 h，TBST洗滌3次，經(jīng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)顯色，于化學(xué)發(fā)光凝膠成像分析儀上成像，Image J圖像處理軟件對(duì)條帶灰度值進(jìn)行分析。公式：目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 MTT法檢測(cè)ATRA對(duì)肺癌細(xì)胞增殖的影響 經(jīng)ATRA處理后，A549細(xì)胞增殖受到明顯抑制, 與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=413.36，P<0.01)，且抑制程度呈時(shí)間和濃度依賴性(圖1),其半抑制濃度(IC50)為31.47 μmol/L。

注：*，不同濃度ATRA處理組與對(duì)照組比較，P<0.01。

圖1 A549細(xì)胞經(jīng)不同濃度ATRA處理后的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

2.2 ATRA對(duì)A549細(xì)胞形態(tài)的影響 光學(xué)顯微鏡下觀察可見A549細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，細(xì)胞生長(zhǎng)密集，而經(jīng)ATRA處理后的細(xì)胞變得細(xì)長(zhǎng)，兩端形成長(zhǎng)尖狀突起，且細(xì)胞密度相對(duì)對(duì)照組明顯減少。見圖2。

注：A，A549對(duì)照組；B，30 μmol/L ATRA處理組。

圖2 ATRA對(duì)A549細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響(×400)

2.3 ATRA對(duì)A549細(xì)胞周期的影響 對(duì)A549細(xì)胞進(jìn)行不同濃度的ATRA誘導(dǎo)處理后，其細(xì)胞周期明顯受到阻滯，G1期比例明顯升高，S、G2期比例下降(表1)，且藥物濃度在接近 IC50值(30 μmol/L)的作用最為明顯。

表1 不同濃度ATRA誘導(dǎo)A549 細(xì)胞后對(duì)細(xì)胞周期的影響

注：*，與對(duì)照組相比，P<0.01。

2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)ATRA對(duì) A549細(xì)胞凋亡的影響 對(duì)A549細(xì)胞進(jìn)行不同濃度的ATRA誘導(dǎo)處理后，其細(xì)胞凋亡率均有不同程度的升高，且藥物濃度在接近IC50值(30 μmol/L)的作用最為明顯。30、50 μmol/L誘導(dǎo)組在ATRA 誘導(dǎo)第4天時(shí)的細(xì)胞凋亡率分別為6.09%和3.21%，30 μmol/L誘導(dǎo)組與對(duì)照組(1.84%)相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=12.23,P<0.05),但50 μmol/L誘導(dǎo)組與對(duì)照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.01,P=0.1)。

2.5 western blot檢測(cè)ATRA對(duì)細(xì)胞周期蛋白及APLNR蛋白表達(dá)的影響 結(jié)果表明，隨著 ARTA濃度的升高，p16蛋白質(zhì)的表達(dá)水平逐漸升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。APLNR蛋白和cyclin D1蛋白的表達(dá)逐漸降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見圖3、表2。

圖3 western blot檢測(cè)不同濃度ATRA誘導(dǎo)A549細(xì)胞周期蛋白及APLNR蛋白的表達(dá)

表2 不同濃度ATRA誘導(dǎo)A549 細(xì)胞周期蛋白及APLNR蛋白的表達(dá)水平

注:*，與對(duì)照組相比，P<0.01。

3 討論

APLNR基因編碼的APLNR蛋白于1993年被發(fā)現(xiàn)，其多數(shù)情況下被稱為APJ受體。研究發(fā)現(xiàn)，以Apelin為配體，APJ為受體的Apelin-APJ系統(tǒng)在細(xì)胞增殖以及新生血管形成的過程中具有促進(jìn)作用[7]。Apelin-APJ 系統(tǒng)與肺癌的發(fā)生及預(yù)后具有密切的相關(guān)性。Yang等[8]針對(duì) APJ 受體進(jìn)行人免疫組織化學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，肺腺癌組織中的APJ表達(dá)量明顯高于臨近支氣管粘膜下組織中的表達(dá)量。進(jìn)一步分析后發(fā)現(xiàn)，Apelin-13可通過促進(jìn)細(xì)胞外調(diào)解蛋白激酶的磷酸化促使細(xì)胞周期蛋白 cyclinD1表達(dá)量增加，推動(dòng)細(xì)胞周期從G0/G1期向S期發(fā)展，從而促進(jìn)肺癌 A549細(xì)胞增殖。此外，Lv等[9]通過對(duì)A549細(xì)胞進(jìn)行損傷修復(fù)實(shí)驗(yàn)和干擾實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Apelin-APJ系統(tǒng)可誘導(dǎo)肺癌A549細(xì)胞發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移。以上研究提示，Apelin-APJ系統(tǒng)參與了肺癌的發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移等過程。

近年來，ATRA 抑制各類實(shí)體腫瘤增殖、誘導(dǎo)其分化的報(bào)道層出不窮。本研究以MTT法檢測(cè)ATRA對(duì)肺癌細(xì)胞增殖的影響，發(fā)現(xiàn)ATRA可抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞分化，且對(duì)肺癌細(xì)胞增殖的抑制程度是呈時(shí)間和劑量依賴的。

抑制細(xì)胞增殖主要是通過細(xì)胞周期阻滯來完成。細(xì)胞周期蛋白是一類呈細(xì)胞周期特異性或時(shí)相性表達(dá)、積累與分解的蛋白質(zhì)，它與周期素依賴性激酶共同影響細(xì)胞周期的運(yùn)行[10]。cyclin D1蛋白由CCND1基因編碼而成，其是G1期細(xì)胞進(jìn)入S期，從而順利進(jìn)行細(xì)胞增殖的關(guān)鍵蛋白。p16蛋白由p16基因編碼而成，只存在于細(xì)胞核內(nèi)。Martin等[11]研究證實(shí)，p16蛋白主要作用于細(xì)胞分裂周期的關(guān)鍵酶CDK4，從而抑制細(xì)胞增殖。而p16可與cyclin D1競(jìng)爭(zhēng)性地與CDK4結(jié)合，阻止細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期，對(duì)細(xì)胞的增殖與分裂起到了負(fù)向調(diào)控的作用[12]。本研究結(jié)果表明，經(jīng)不同濃度ATRA處理A549細(xì)胞后，其細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，細(xì)胞周期被阻滯于G0/G1期。western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，隨著ATRA濃度的升高，cyclin D1和APLNR蛋白的表達(dá)量逐漸減少，但p16蛋白的表達(dá)量逐漸升高。表明ATRA可通過下調(diào)APLNR蛋白的表達(dá)抑制細(xì)胞周期蛋白cyclinD1的表達(dá)，阻滯細(xì)胞周期從G0/G1期向S期發(fā)展，抑制A549細(xì)胞增殖，促使與cyclin D1競(jìng)爭(zhēng)的p16蛋白表達(dá)水平升高。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，ATRA可通過下調(diào)APLNR的表達(dá)，將A549細(xì)胞周期阻滯于 G0/G1期從而抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞分化、促進(jìn)細(xì)胞凋亡。提示ATRA可作為增強(qiáng)肺癌化療效果的有效輔助藥物。然而,關(guān)于ATRA下調(diào)肺癌細(xì)胞APLNR表達(dá)的機(jī)制和作用位點(diǎn)，依細(xì)胞類型不同而情況各異。此外,有關(guān)ATRA在肺癌組織中的藥理學(xué)研究報(bào)道亦少見,真正合理地將 ATRA應(yīng)用于肺癌的綜合治療還需進(jìn)一步的深入研究。

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(本文編輯：許曉蒙)

Effect of all-trans-retinoic acid on proliferation of human lung adenocarcinoma cell line A549 and expression ofAPLNRgene

CHENShu-min1,LIUYi1,LIShu-na2,HEShu-yi1,XUYu-xin1,ZHANGWen-ling1

(1.DepartmentofLaboratoryMedicine,XiangyaSchoolofMedicine,CentralSouthUniversity,Changsha410013,Hunan; 2.DepartmentofLaboratoryMedicine,ZhuhaiMaternalandChildHealthCareHospital,Zhuhai519000,Guangdong,China)

Objective To explore the effects of all-trans-retinoic acid (ATRA) on the proliferation of human lung adenocarcinoma cell line A549 and the expression ofAPLNR(apelin receptor) gene. Methods The inhibition of proliferation of human lung adenocarcinoma cell lines A549 cultured in vitro with or without ATRA was measured by MTT (methyl thiazolyl tetrazolium, MTT) method. The morphological changes in the cells were observed by light microscopy. The cell cycle and apoptosis were analyzed by flow cytometry. The levels of APLNR, cyclin D1 and p16 proteins were detected by western blot. Results After treatment of ATRA, the proliferation of A549 cells was obviously inhibited in dose-and time-independent manner (P<0.01). The cell morphology was significantly changed. The cycle of A549 cells was blocked at G0/G1phase and the apoptosis rate was increased. With the increasing concentration of ATRA, the expressions of cyclin D1 and APLNR were down-regulated but the expression of p16 was up-regulated (P<0.01). Conclusion ATRA could inhibit the proliferation of A549 cells by retardant cell cycle of A549 cells at G0/G1phase and inducing the apoptosis, and down-regulate the expression ofAPLNRgene.

all-trans-retinoic acid；lung adenocarcinoma cell lineA549；proliferation；apoptosis；APLNR

10.13602/j.cnki.jcls.2017.05.16

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(81672688)；研究生自主探索創(chuàng)新項(xiàng)目(2017zzts845)。

陳淑敏，1991年生，女，碩士研究生；主要從事腫瘤相關(guān)研究。

張文玲，教授，E-mail: zhangwenling73@126.com。

R730.43

A

2017-02-04)