姜莉莉 ， 蔣培紅， 溫海燕 ， 樊兆斌

(1.菏澤學院藥物科學與技術系 ， 山東菏澤274015 ； 2.錦州醫(yī)科大學畜牧獸醫(yī)學院 ， 遼寧錦州121001)

禽網狀內皮組織增生癥病毒蛋白酶PR酵母雙雜交誘餌載體的構建及鑒定

姜莉莉1，2， 蔣培紅1， 溫海燕1， 樊兆斌1，2

(1.菏澤學院藥物科學與技術系 ， 山東菏澤274015 ； 2.錦州醫(yī)科大學畜牧獸醫(yī)學院 ， 遼寧錦州121001)

為研究禽網狀內皮組織增生癥病毒(Reticuloendotheliosisvirus, REV)蛋白酶PR與宿主細胞的相互作用，將REV PR基因克隆入酵母雙雜交誘餌載體pGBKT7，構建誘餌載體pGBK-PR，經菌落PCR 、酶切鑒定及測序驗證正確后，將重組誘餌質粒轉化酵母菌株Y2H Gold感受態(tài)，進行重組誘餌載體在酵母中的自激活活性和毒性檢測。結果表明，成功構建誘餌載體pGBK-PR，此載體在酵母細胞Y2H Gold中無自激活活性和毒性。研究結果為進一步利用酵母雙雜交技術篩選與REV 蛋白酶PR互作的宿主蛋白奠定了基礎。

禽網狀內皮組織增生癥病毒 ； PR ； 酵母雙雜交 ； 誘餌載體

禽網狀內皮組織增生癥是由禽網狀內皮組織增生癥病毒(ReticuloendotheliosisVirus, REV)引起的一種重要的腫瘤性免疫抑制病。REV感染能引起慢性腫瘤、矮小綜合征[1]。還可引起免疫器官的萎縮，引發(fā)重劇的免疫抑制，造成免疫失敗或繼發(fā)其他傳染病[2]。近年來，REV 已在全球范圍內流行[3]，在我國的流行愈發(fā)嚴重，雞群中REV的血清抗體陽性率逐漸增高，存在普遍的混合感染[4-5]，對養(yǎng)禽業(yè)危害嚴重。

REV屬反轉錄病毒科，哺乳動物C型反轉錄病毒亞科，γ逆轉錄病毒屬，為雙倍體單股正鏈 RNA 病毒[6]。REV基因組有兩個開放閱讀框，有3個主要編碼基因：衣殼蛋白基因(gag)、聚合酶基因(pol)和囊膜蛋白基因(env)，主要編碼gag、pol和env三種結構蛋白[7]。pol基因主要編碼REV的功能性蛋白，包括反轉錄酶(RT)及其衍生的蛋白酶(PR)和整合酶(IN)等。PR 的功能是水解前體蛋白以使之形成成熟蛋白。目前，對REV PR研究較少，尚未見該蛋白與宿主細胞之間相互作用的研究報道。為更好理解 PR的生物學功能，本試驗構建了REV PR酵母雙雜交誘餌載體，檢測其是否在酵母細胞中表達，為利用酵母雙雜交技術進一步開展該蛋白與其他相關蛋白的相互作用研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株、質粒、主要試劑及引物 pT-Rpol 質粒由藥物科學技術學院預防獸醫(yī)學研究室構建和保存；載體質粒pGBKT7、pGADT7，酵母菌株Y2H、X-α-Gal、Aureobasidin Minimal SD Base、Minimal SD Agar Base、Yeastmaker Carrier DNA、酵母共轉化試劑盒等，均購自 Clontech公司；CEF cDNA酵母表達文庫由本研究室構建；DDO(SD/-Leu/-Trp)、QDO(SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp)、QDO/X/A(SD/-Ade/-His/-Leu/Trp/X-α-Gal/Aureobasidin A)培養(yǎng)基按常規(guī)方法制備；EcoRI、BamHI、T4 DNA Ligase、DNA 聚合酶等，均購自寶生物工程(大連)有限公司；PR基因擴增引物由上海生工基因股份有限公司合成(見表1)。

表1 PR基因擴增引物

1.2 PR基因的擴增 根據(jù)pGBKT7載體的多克隆位點，設計擴增REV PR的引物RPRU/RPRL(上下游分別引入EcoRI和BamHI、酶切位點)，以pT-Rpol為模板進行PCR擴增。PCR反應體系：5×PrimeSTAR Buffer (Mg2+Plus)10 μL，dNTP Mixture (each 2.5 mmol/L) 4 μL，上、下游引物各1 μL，模板1 μL，PrimeSTAR?HS DNA Polymerase 0.5 μL，加ddH2O至50 μL。PCR反應條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR反應結束后在反應體系加入rTaq0.5 μL，72 ℃延伸10 min，使PCR產物末端加A，并進行膠回收。

1.3 PR誘餌載體的構建 用EcoRI、BamHI對回收純化的PR PCR產物和載體pGBKT7分別進行雙酶切處理。酶切體系：10×H Buffer 5 μL，PR PCR產物10 μL(pGBKT7 5 μL)，EcoRI、SalI各2.5 μL，加ddH2O至50 μL；37 ℃水浴2 h。酶切產物回收后進行連接反應，連接體系：T4 DNA連接酶1 μL，10×T4 Buffer 1 μL，PR回收產物6 μL，pGBKT7回收產物2 μL，16 ℃連接過夜。轉化大腸桿菌DH5α，提取質粒。重組質粒經雙酶切鑒定正確后，送華大基因生物工程技術服務有限公司進行測序，將正確插入RPR基因的誘餌載體命名為pGBK-PR。

1.4 誘餌載體自激活活性和毒性檢測 復蘇酵母菌Y2H Gold，按照YeastmakerTMYeast Transformation System 2(Clontech)操作規(guī)程，利用醋酸鋰法，制備Y2H Gold酵母感受態(tài)細胞。分別將誘餌載體pGBK-PR與空捕獲載體pGADT7轉化Y2H酵母感受態(tài)細胞。將待轉化質粒1 μL(100 ng/μL)、Yeastmaker Carrier DNA 5 μL(10 μg/μL)、新鮮制備的50% PEG/LiAc 500 μL和50 μL酵母感受態(tài)細胞加入1.5 mL無菌EP管，混勻。30 ℃水浴30 min，每隔10 min輕振混勻；加入20 μL DMSO，混勻，42 ℃水浴15 min，每隔5 min輕振混勻；12 000 r/min離心10 s，棄上清，沉淀用100 μL 0.9%NaCl重懸，取100 μL重懸菌液涂于SD/-Trp(SDO) 固體培養(yǎng)板上，30 ℃倒置培養(yǎng)3～5 d，觀察2 個平板酵母菌菌落生長的大小、數(shù)量、形態(tài)、顏色等有無差異，進行誘餌質粒pGBK-PR的毒性檢測。將上述已轉化好的pGBK-PR菌液各100 μL，分別涂于SD/-Trp(SDO)、SD/-Trp /X-α-Gal(SDO/X) 和SD/-Trp /X-α-Gal /AbA (SDO/X/A) 固體培養(yǎng)板上， 30 ℃倒置培養(yǎng)3～5 d，觀察各個平板酵母菌菌落生長的大小、數(shù)量、形態(tài)、顏色，進行誘餌質粒pGBK-PR的自激活活性檢測。同時設陽性對照組：pGBKT7-53 / pGADT7-T共轉化組，和陰性對照組：pGBKT7-Lam/pGADT7-T共轉化組。

2 結果

2.1 PR基因擴增及序列分析 PCR反應產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，在接近750 bp處可見清晰條帶，大小與預期相符(圖1)。測序結果顯示，擴增的PR基因為648 bp。

2.2 誘餌載體的構建 重組誘餌質粒pGBK-PR轉化大腸桿菌感受態(tài)DH5α，經EcoRI、BamHI雙酶切，經1%瓊脂糖凝膠電泳，在7.3 kb和700 bp附近，均出現(xiàn)目的條帶(圖2)。與空載體片段7.3 kb和預期插入片段648 bp大小相近，將重組質粒送華大基因生物工程技術有限公司測序，比對結果顯示插入片段正確，表明重組質粒pGBK-PR構建正確。

2.3 誘餌載體自激活作用和毒性檢測 圖3為pGBK-PR誘餌載體和pGBKT7空載體在SDO、SDO/X、SDO/X/A三種平板上的生長狀況以及陰陽性對照生長情況。由圖3可以看出，陽性對照組(pGADT7-53 / pGADT7-T共轉組)在SDO/X/A平板上菌落顏色變藍；陰性對照組(pGADT7-Lam / pGADT7-T共轉組)在SDO/X/A平板上無菌落生長，說明陰陽性對照組成立。pGBKT7 空載體轉化菌在SDO/X平板上生長正常，菌落顏色為白色，在SDO/X/A平板上無菌落生長。pGBK-PR轉化菌在SDO/X平板上可見與pGBKT7空載體轉化菌類似的白色菌落，酵母生長狀況良好，菌落數(shù)量和大小與pGBKT7空載體轉化相比無明顯差異，說明構建的誘餌載體pGBK-PR對酵母菌株無毒性作用。pGBK-PR轉化菌在SDO和SDO/X平板上生長正常，菌落顏色為白色，在SDO/X/A平板上無菌落生長，說明誘餌載體pGBK-PR無自激活活性。因此，構建的誘餌載體pGBK-PR可以用于下一步文庫的篩選試驗。

圖1 PR基因擴增

圖2 誘餌載體pGBK-PR雙酶切鑒定

圖3 pGBK-PR誘餌質粒自激活活性與毒性檢測

3 討論

酵母雙雜交技術是一種經典的蛋白互作研究技術，外源蛋白能在真核酵母細胞內表達，并通過不同的營養(yǎng)條件篩選相互作用的蛋白。作為研究病毒與宿主相互作用的常用方法之一，酵母雙雜交技術既可檢測已知蛋白之間的相互作用，又能篩選與已知蛋白相互作用的未知蛋白，可用于蛋白文庫中篩選與已知蛋白相互作用的蛋白[8-9]。且該系統(tǒng)可捕捉活細胞內蛋白之間微弱的、瞬時的作用信號，適用于高通量篩選相互作用蛋白[10]。

REV病毒粒子有3種酶蛋白：反轉錄酶(RT)、蛋白酶(PR)和整合酶(IN)。REV的PR來自Gag-Pro蛋白前體，類似于其他逆轉錄病毒，REV編碼的蛋白酶(PR)，能專一地切割病毒的多聚蛋白，使之形成成熟蛋白和復制所需要的酶，在病毒的復制過程中發(fā)揮重要作用[11]。此外，逆轉錄病毒PR也可以催化包括細胞骨架蛋白和細胞支架相關蛋白在內的宿主細胞蛋白的水解作用[12]。

PR與逆轉錄病毒的生命周期和感染的過程密切相關，本試驗擴增REV 蛋白酶PR基因，將其定向克隆到酵母雙雜交誘餌pGBKT7載體上，成功構建pGBK-PR酵母誘餌載體，以期通過酵母雙雜交技術進一步研究REV PR蛋白功能。將構建的誘餌載體pGBK-PR轉化Y2H Gold 酵母感受態(tài)細胞，涂布SDO和SDO/X培養(yǎng)基，發(fā)現(xiàn)pGBK-PR轉化菌在兩種培養(yǎng)基上長出白色菌落，生長狀況良好，與pGBKT7空載體轉化組相比，菌落數(shù)量、大小無明顯差異，說明構建的誘餌載體pGBK-PR對酵母菌株無毒性作用。且pGBK-PR轉化菌在SDO/X/A培養(yǎng)基上無菌落生長，說明誘餌載體pGBK-PR無自激活活性。本試驗構建的誘餌載體pGBK-PR可應用于酵母雙雜交篩選，為進一步研究與REV蛋白酶PR相互作用的宿主蛋白奠定了基礎。

[1] Bohls R L, Linares J A, Gross S L,etal. Phylogenetic analyses indicate little variation among reticuloendotheliosis viruses infecting avian species, including the endangered Attwater's prairie chicken[J]. Virus Res,2006,119: 187-194.

[2] Moore K M, Davis J R, Sato T,etal. Reticuloendotheliosis virus (REV) long terminal repeats incorporated in the genomes of commercial fowl poxvirus vaccines and pigeon poxviruses without indication of the presence of infectious REV[J]. Avian Dis,2000, 44:827-841.

[3] Guillermo Z, Sunny C, Taylor B,etal. Enzootic Reticuloendotheliosis in the Endangered Attwater’s and Greater Prairie Chickens[J]. Avian Dis,2006, 50: 520-525.

[4] 崔治中,孟珊珊,姜世金,等. 我國白羽肉用型雞群中CAV、REV和REOV感染狀況的血清學調查[J]. 畜牧獸醫(yī)學報， 2006,37(2): 152-157.

[5] 秦立廷,高玉龍,潘偉,等.我國部分地區(qū)蛋雞群ALV-J及與REV、MDV、CAV混合感染檢測[J]. 中國預防獸醫(yī)學報， 2010,32(2): 90-93.

[6] Coffin J M. Structure of the retroviral genome. RNA tumor viruses. Molecular Biology of Tumor Viruses. Cold Spring Harbor Laboratory[J]. Cold Spring Harbor, 1982, NY: 261-368.

[7] Barbosa T, Zavala G, Cheng S,etal. Full genome sequence and some biological properties of reticuloendotheliosis virus strain APC-566 isolated from endangered Attwater's prairie chickens[J]. Virus Res,2007,124(1-2):68-77.

[8] Yu Y, Li Y, Zhang Y. Yeast Two-Hybrid Screening for Proteins that Interact with the Extracellular Domain of Amyloid Precursor Protein[J]. Neurosci Bull,2016,32(2):171-176.

[9] Zhao T, Huang X, Xia Y. Human heart cell proteins interacting with a C-terminally truncated 2A protein of coxsackie B3 virus: identification by the yeast two-hybrid system[J].Virus Genes, 2016,52(2):172-178.

[10] Yu H, Braun P, Yildirim M A,etal. High-quality binary protein interaction map of the yeast interactome network [J]. Science, 2008, 322(5898): 104-110.

[11] Weaver T A, Talbot K J , Panganiban A T.Spleen necrosis virus gag polyprotein is necessary for particle assembly and release but not for proteolytic processing[J].J Virol, 1990,64 :2642-2652.

[12] Shoeman R L, Honer B, Stoller T J,etal. Human immunodeficiency virus type 1 protease cleaves the intermediate filament proteins vimentin, desmin, and glial fibrillary acidic protein[J]. Proc Natl Acad Sci U.S.A,1990 ,87(16):6336-6340.

Construction and Identification of the Bait Vector ofReticuloendotheliosisvirusPR using Yeast Two-hybrid System

JIANG Li-li1,2， JIANG Pei-hong1， WEN Hai-yan1， FAN Zhao-bin1,2

(1.Drug Bioscience and Technology Department, Heze University, Heze 274015, China; 2.Institute of animal husbandry veterinary, Jinzhou Medical University, Jinzhou 121001, China)

To investigate the interaction betweenReticuloendotheliosisvirus(REV) PR and the host cells, PR cDNA was amplified and subcloned into the bait vector pGBKT7 of yeast two-hybrid system, and the recombinant bait vector pGBK-PR was constructed. After verifying by PCR amplification, enzymatic detection and sequencing validation, the yeast bait plasmid was transformed into Yeast strain Y2H Gold competent cells. Then the self-activation and toxicity of the bait vector were tested using the Matchmaker Gold Yeast Two-Hybrid System. Results showed that the bait vector pGBK-PR was successfully constructed with no self-activation and toxicity to Y2H Gold yeast cells. This study laid the foundation for further researches on the effect and mechanism of the interaction betweenREVPR and its host cells.

Reticuloendotheliosisvirus; PR ; yeast two-hybrid ; bait vector

FAN Zhao-bin

2016-07-19

家禽產業(yè)技術體系北京市創(chuàng)新團隊項目(BAIC04-2017)

趙世穎(1988-)，女，工程師，碩士，從事實驗動物飼養(yǎng)管理工作，E-mail：syzhao@genetics.ac.cn

張國中，E-mail：zhanggz@cau.edu.cn

S854.43

A

0529-6005(2017)05-0027-03