程雪嬌 ， 辛 良 ， 范慶增, ， 武沛澤 ， 王宏鈞 ， 薛寶君 ， 陳 健 ， 王曉榮 ， 范 開 ， 常建宇

(1.天津市中升挑戰(zhàn)生物科技有限公司 ， 天津西青300380 ；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院 ， 北京海淀100193)

恩諾沙星對肉仔雞脛骨發(fā)育的影響

程雪嬌 ， 辛 良2， 范慶增1,2， 武沛澤2， 王宏鈞2， 薛寶君1， 陳 健2， 王曉榮2， 范 開2， 常建宇2

(1.天津市中升挑戰(zhàn)生物科技有限公司 ， 天津西青300380 ；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院 ， 北京海淀100193)

為了探究氟喹諾酮類藥物恩諾沙星對禽類脛骨發(fā)育的影響， 以恩諾沙星為研究對象， 選取雄性肉雞雞雛， 隨機(jī)分成5組， 分別為空白組、 10 mg/kg體重組、 30 mg/kg體重組、 60 mg/kg體重組、 100 mg/kg體重組， 每組36只， 于1日齡和7日齡進(jìn)行相應(yīng)的給藥處理， 在7、 14、 21、 28、 35、 42 d每組隨機(jī)抽取6只肉雞，稱取脛骨鮮重， 量取脛骨長度， 骨密度儀測量脛骨密度， 脛骨干重， 茂福爐550 ℃高溫灰化后得灰分含量， 紫外分光光度法測脛骨磷含量， EDTA鈣滴定法測脛骨鈣含量， 評價(jià)脛骨發(fā)育情況。 結(jié)果表明，至出欄前恩諾沙星對于肉仔雞脛骨發(fā)育的影響各組之間差異不顯著。

恩諾沙星 ； 肉仔雞 ； 脛骨發(fā)育

恩諾沙星是國家指定的動物專用氟喹諾酮類藥物，可用于哺乳動物、家禽及水產(chǎn)動物，我國使用初期，即20世紀(jì)末有報(bào)道過7起恩諾沙星的家禽中毒事故[1-7]，其中5例是肉雛雞中毒，1例是雛番鴨中毒，1例是青年雞中毒，肌肉給藥和口服給藥方式均有，絕大部分是由于給藥劑量過大引起的急性中毒。恩諾沙星對肉仔雞脛骨發(fā)育的影響的相關(guān)研究，尚未見有過報(bào)道。

氟喹諾酮類藥物的關(guān)節(jié)軟骨毒性已經(jīng)在許多哺乳動物中證實(shí)[8]，并且存在著種屬特異性，年齡和劑量相關(guān)性。而隨著恩諾沙星使用范圍的擴(kuò)大，在家禽上的使用也越來越多，本試驗(yàn)從脛骨發(fā)育角度出發(fā)，闡述恩諾沙星對肉仔雞骨骼發(fā)育的影響。

1 試驗(yàn)材料

-20 ℃冰箱，-80 ℃冰箱，電子分析天平，電熱恒溫培養(yǎng)箱，電陶爐，遠(yuǎn)紅外輻射干燥箱，茂福爐，紫外分光光度計(jì)，生理鹽水，甲醛，濃硝酸，濃鹽酸，冰乙酸，鹽酸羥胺，三乙醇胺，乙二胺，20%恩諾沙星注射液，1日齡雞雛，雛雞飼料，育成雞飼料

2 試驗(yàn)步驟

2.1 采取單因子隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì) 將5組的雛雞按照下表對應(yīng)的給藥劑量進(jìn)行給藥。其中肌肉注射的低(A)、中(B)、高(C)、超高(D)劑量組分別于1日齡和7日齡按相應(yīng)劑量肌肉注射給藥1次，空白對照組于1日齡和7日齡肌肉注射生理鹽水1次，每次0.5 mL/只。

表1 分組設(shè)計(jì)

注：肌肉注射的部位是雛雞的左腿

2.2 脛骨取樣 每組分別在第7、14、21、28、35、42天隨機(jī)抓取6只，分離雞只左側(cè)脛骨，生理鹽水清洗后擦干，稱重，量取脛骨長度。然后將每只雞的脛骨單獨(dú)封存后置于-20 ℃存儲。根據(jù)測得的脛骨長度、脛骨鮮重與對應(yīng)肉仔雞的體重分別計(jì)算脛骨重量占肉仔雞體重的相對重量以及脛骨鮮重對脛骨長度的單位重量。

2.3 脛骨干重 取-20 ℃凍存的脛骨自然解凍至室溫(20 ℃左右)，置100 ℃干燥箱中至恒重后準(zhǔn)確稱量，記錄脛骨烘干重量。

2.4 脛骨骨密度 將-20 ℃凍存的脛骨自然解凍至室溫(20 ℃左右)，將待測樣品置于探測器下，測量點(diǎn)為前端1/3處。啟動驅(qū)動裝置使放射源與探頭同步運(yùn)動，測定儀自動記錄透過骨樣的射線量并計(jì)算出骨密度BMD，單位g/cm2。

2.5 脛骨灰分 將帶蓋坩堝置于茂福爐中，在550 ℃煅燒，取出后干燥稱重，重復(fù)放入茂福爐中煅燒，冷卻，稱重直至2次質(zhì)量之差小于0.0005 g為恒重。

2.6 脛骨骨磷含量和脛骨骨鈣含量的測定 分別利用比色法和絡(luò)合滴定法測定經(jīng)茂福爐煅燒的樣品的骨磷含量和骨鈣含量(簡寫鈣、磷含量的測定)

2.7 試驗(yàn)結(jié)果 用均值表示，且統(tǒng)計(jì)結(jié)果采用SPSS 17.0 One-Way ANOVA模塊進(jìn)行分析，Ducan法比較顯著性，同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)小寫字母不同者表示差異顯著(P<0.05)，肩標(biāo)相同字母或無字母者表示差異不顯著(P>0.05)。Graghpad Prism 5.0作統(tǒng)計(jì)圖，CAVAS X處理統(tǒng)計(jì)圖。

3 試驗(yàn)結(jié)果

3.1 恩諾沙星對肉雞脛骨單位重量的影響 肉仔雞在1周齡時的單位重量組間差異不顯著(P>0.05)，即恩諾沙星不同劑量時對1周齡肉仔脛骨重量的影響不顯著；2周齡時，單位重量組間差異顯著(P<0.05)，10 mg組、60 mg組與空白組相比差異顯著(P<0.05)；3周齡時，單位重量組間差異不顯著(P>0.05)；4周齡時，單位重量組間差異顯著(P<0.05)，10 mg組與空白組相比差異顯著(P<0.05)；5周齡時，肉仔雞的單位重量組間差異極顯著(P<0.01)，30 mg組與空白組相比單位重量差異極顯著(P<0.01)6周齡時，單位重量組間差異不顯著(P>0.05)，但10 mg組、60 mg組與空白組相比單位重量的差異顯著(P<0.05)。

3.2 恩諾沙星對肉雞相對重量的影響 肉仔雞在2、4、6周齡的相對重量組間差異均不顯著(P>0.05)；肉仔雞在1周齡時相對重量組間差異極顯著(P<0.01)，100 mg/kg體重組1周齡肉仔雞的相對重量與空白組相比差異顯著(P<0.05)；肉仔雞在3周齡時相對重量組間差異顯著(P<0.05)，60 mg/kg體重組與空白組相比差異顯著(P<0.05)；肉仔雞在5周齡時相對重量組間差異顯著P<0.05)，30 mg/kg體重組與空白組相比相對重量差異極顯著(P<0.01)。

3.3 恩諾沙星對肉雞脛骨長度的影響 肉仔雞在1周齡時的脛骨長度組間差異顯著(P<0.05)，即恩諾沙星不同劑量時對1周齡肉仔的脛骨長度影響顯著，30 mg/kg體重、100 mg/kg體重組比10 mg/kg體重、60 mg/kg體重、空白組脛骨長度顯著更長；肉仔雞在2周齡時的脛骨長度組間差異不顯著；肉仔雞在3周齡時的脛骨長度的組間差異不顯著(P>0.05)；肉仔雞在4周齡時的相對長度組間差異顯著(P<0.05)，30 mg/kg體重、60 mg/kg體重、100 mg/kg體重和空白組與10 mg/kg體重組差異顯著；肉仔雞在5周齡時的脛骨長度組間差異顯著(P<0.05)，10 mg/kg體重、30 mg/kg體重組比60 mg/kg體重、100 mg/kg體重組與空白組脛骨長度差異顯著；肉仔雞在6周齡時的脛骨長度組間差異顯著(P<0.05)。

3.4 恩諾沙星對肉雞脛骨相對長度的影響 肉仔雞在1周齡到4周齡時的相對長度組間差異不顯著(P>0.05)，即恩諾沙星不同劑量時對1周齡到4周齡肉仔雞的脛骨長度影響不顯著；肉仔雞在5周齡時的相對長度組間差異顯著(P<0.05)，60 mg/kg體重組與空白組相比相對長度差異顯著；肉仔雞在6周齡時的相對長度組間差異不顯著(P>0.05)。相對長度差異性相比脛骨長度而言敏感性較低，可能是藥物對脛骨長度的影響與體長的影響在計(jì)算中相互抵消所致。

3.5 恩諾沙星對肉雞脛骨骨密度的影響 不同劑量下恩諾沙星對肉仔雞脛骨密度的影響在前3周不同劑量組與空白組組間差異均不顯著(P>0.05)，但各劑量組的肉仔雞脛骨密度在前3周均大于空白組肉仔雞脛骨密度，且呈現(xiàn)出隨劑量增加而骨密度下降的趨勢；在第4周時，各劑量組之間差異顯著(P<0.05)，10 mg/kg體重組與其余各組相比均具有顯著的差異；第5周時，與第4周相似，各劑量組與空白組組間差異顯著(P<0.05)，10 mg/kg體重組與其余各組相比均具有顯著的差異(P<0.05)，其余各組之間無顯著差異；第6周時，各劑量組與空白組組間差異顯著(P<0.05)，10 mg/kg體重組與30 mg/kg體重、60 mg/kg體重及空白組相比差異顯著(P<0.05)，與100 mg/kg體重組相比差異極顯著(P<0.01)。不同劑量恩諾沙星對肉仔脛骨密度的影響從第3周開始明顯，100 mg/kg體重組在后期表現(xiàn)出了骨密度明顯低于其余劑量組及空白組。

3.6 諾沙星對肉雞脛骨灰分的影響 第1周和第2周時，各恩諾沙星劑量組以及空白組對肉仔雞脛骨灰分的影響組間差異均不顯著(P>0.05)；第3周時，各恩諾沙星劑量組及空白組對肉仔雞脛骨灰分影響組間差異顯著(P<0.05)，30 mg/kg體重組與60 mg/kg體重、100 mg/kg體重組脛骨灰分含量差異顯著(P<0.05)，空白組與60 mg/kg體重、100 mg/kg 體重組脛骨灰分含量相比差異顯著(P>0.05)；第4周，各恩諾沙星劑量組及空白組對肉仔雞脛骨灰分含量影響組間差異顯著(P<0.05)，30 mg/kg體重與100 mg/kg體重組脛骨灰分含量相比差異顯著(P<0.05)，10 mg/kg體重、60 mg/kg體重、空白組相比差異不顯著；第5周時，各劑量恩諾沙星和空白組對肉仔雞脛骨灰分含量的影響組間差異不顯著(P>0.05)，即不同劑量組恩諾沙星和與空白組間無明顯差異；第6周，不同劑量恩諾沙星及空白組對肉仔雞脛骨灰分含量組間差異顯著(P<0.05)，10 mg/kg體重組、空白組與60 mg/kg體重組相比差異顯著(P<0.05)，10 mg/kg體重組和空白組與100 mg/kg體重相比差異均顯著(P<0.05)。

3.7 恩諾沙星對肉雞脛骨磷含量的影響(1)磷標(biāo)準(zhǔn)曲線 由圖1所得磷標(biāo)準(zhǔn)曲線圖可知，在波長為278 nm條件下，磷濃度在1-25 ug/mL濃度范圍內(nèi)線性方程為y = 0.0872x -0.006，R2=0.9999，線性關(guān)系良好。(2)脛骨磷含量 第1周時，各劑量恩諾沙星對肉雞脛骨磷含量的影響組間差異不顯著(P>0.05)；第2周時，各劑量恩諾沙星對肉雞脛骨磷含量的影響組間差異不顯著(P>0.05)；第3周時，不同劑量恩諾沙星與空白組對肉雞脛骨磷含量組間差異不顯著(P>0.05)；第4周時，空白組、10 mg/kg體重組、30 mg/kg體重組和60 mg/kg體重組與100 mg/kg體重組肉雞脛骨磷含量差異顯著(P<0.05)，空白組、10 mg/kg體重組、30 mg/kg體重組和60 mg/kg體重組肉雞脛骨磷含量兩兩之間差異不顯著(P>0.05)；第5周時，不同劑量恩諾沙星與空白組對肉雞脛骨磷含量組間差異不顯著(P>0.05)；第6周時，空白組、10 mg/kg體重組、30 mg/kg體重組和60 mg/kg體重組與100 mg/kg體重組肉雞脛骨磷含量差異顯著(P<0.05)，空白組、10 mg/kg體重組、30 mg/kg體重組和60 mg/kg體重組肉雞脛骨磷含量兩兩之間差異不顯著(P>0.05)

圖1 磷標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.8 恩諾沙星對脛骨鈣含量的影響 第1周到第4周，不同劑量恩諾沙星組與空白組肉雞脛骨鈣含量組間差異不顯著(P>0.05)；第5周和第6周時，10 mg/kg體重、30 mg/kg體重、60 mg/kg體重組以及空白對照組脛骨鈣含量比100 mg/kg體重組高，相比差異顯著(P<0.05)，10 mg/kg體重、30 mg/kg體重、60 mg/kg體重組以及空白組相比差異不顯著(P>0.05)。由上可知，脛骨鈣含量只有在恩諾沙星超高劑量使用后期才會表現(xiàn)降低。其他劑量組與空白組鈣之間脛骨鈣含量無明顯差異。

4 討論

脛骨長度與脛骨重量是評估肉仔雞脛骨生長發(fā)育的重要指標(biāo)。一般情況下，脛骨的長度與重量越大，表明脛骨生長發(fā)育越好。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，不同劑量恩諾沙星對肉仔雞脛骨長度與重量均有一定的影響，且存在著隨劑量的升高而肉雞的脛骨長度與重量呈現(xiàn)出先升高后下降的趨勢，表明一定劑量的恩諾沙星有利于肉仔雞的生長發(fā)育，而超過一定濃度后，恩諾沙星對肉仔雞不利影響開始顯現(xiàn)，但依然沒有顯著低于肉仔雞空白組脛骨的生長發(fā)育，這說明高劑量的恩諾沙星在一定程度上依然有利于肉仔雞脛骨的生長發(fā)育，但這種有利影響逐漸消失或者與其產(chǎn)生的毒副作用抵消。有文章指出，骨重占體重的百分比例是反映幼雛骨鈣磷需要的敏感指標(biāo)，也是反映骨骼發(fā)育的指標(biāo)之一。百分比高就表示幼雛的鈣磷需求滿足度高，骨骼發(fā)育程度較好，否則鈣磷含量不能達(dá)到骨骼發(fā)育的需要量，骨骼發(fā)育受到限制。本試驗(yàn)結(jié)果表明，脛骨相對重量和單位長度兩項(xiàng)指標(biāo)對肉仔雞發(fā)育及鈣磷沉降的指示性不明顯，這可能是肉仔雞在脛骨長度和重量發(fā)生變化的同時，體重與體長也發(fā)生了趨勢下的變化，從而導(dǎo)致相對指標(biāo)的變化。而相比之下，單獨(dú)比較不同劑量下肉仔雞不同時期的體重變化和日增重我們可以發(fā)現(xiàn)，30 mg/kg體重劑量組的增長與空白對照組的增長趨勢具有一致性且其增長率要大于空白組的增長率。而其余劑量組的肉仔雞體重及日增重的6周變化趨勢比較紊亂，無明顯指示性意義。

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2016-08-09

程雪嬌(1981-)，女，工程師，碩士，主要從事獸藥的研發(fā)及申報(bào)工作，E-mail：tzchengxuejiao@qq.com

范開，E-mail：dirtyfan@sina.com；常建宇，E-mail：changjianyu@cau.edu.cn

S859.79+6

B

0529-6005(2017)05-0107-03