伊平昌 ， 李國(guó)平

(青海省大通縣畜牧獸醫(yī)站 ， 青海西寧810100)

青海大通牛新孢子蟲(chóng)病血清學(xué)調(diào)查

伊平昌 ， 李國(guó)平

(青海省大通縣畜牧獸醫(yī)站 ， 青海西寧810100)

新孢子蟲(chóng)病(Neosporosis)是由犬新孢子蟲(chóng)(Neosporacaninum)寄生于宿主細(xì)胞內(nèi)引起犬、牛等多種動(dòng)物共患的一種原生寄生蟲(chóng)病，對(duì)牛的危害最明顯，給養(yǎng)牛業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。新孢子蟲(chóng)主要寄生于中樞神經(jīng)系統(tǒng)、肌肉、肝臟、腦及其他內(nèi)臟組織中，家畜感染新孢子蟲(chóng)后主要表現(xiàn)為腦炎、肝炎、持續(xù)性肺炎等，懷孕母畜則多出現(xiàn)流產(chǎn)、產(chǎn)弱胎、死胎和木乃伊胎等，新生仔畜則多表現(xiàn)為四肢運(yùn)動(dòng)障礙和神經(jīng)系統(tǒng)疾病[1]。犬、狼、山狗和紅狐等犬科動(dòng)物是新孢子蟲(chóng)的終末宿主[2]。新孢子蟲(chóng)的中間宿主種類較多，可感染牛、羊、禽類、靈長(zhǎng)類及多種野生哺乳動(dòng)物等；新孢子蟲(chóng)有兩種感染途徑即垂直傳播和水平傳播，牛在誤食了被新孢子蟲(chóng)卵囊污染的食物后感染，通過(guò)垂直傳播迅速在該牛群中散播，感染可持續(xù)多年[3]。截至目前，還沒(méi)有十分有效防治新孢子蟲(chóng)病的藥物或疫苗[4]。新孢子蟲(chóng)病流行于世界各地，廣泛存在于挪威、澳大利亞、新西蘭、中國(guó)等50多個(gè)國(guó)家。我國(guó)對(duì)該病研究起步較晚，自2003年劉群等[5]首次從奶牛血清中檢出新孢子蟲(chóng)陽(yáng)性抗體，隨后在全國(guó)多地相繼檢出了羊、奶牛等動(dòng)物感染新孢子蟲(chóng)病的報(bào)道。對(duì)新孢子蟲(chóng)病作出早期診斷，及時(shí)隔離淘汰患病家畜是有效的防制措施。

目前，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)應(yīng)用較廣泛，主要用于血清和初乳中抗犬新孢子蟲(chóng)IgG抗體的檢測(cè)，常用的ELISA抗原有Nc SAG1、Nc GRA7、Nc GRA2等[6]。有關(guān)于青海省動(dòng)物感染新孢子蟲(chóng)方面的報(bào)道甚少，尤其是大通縣地區(qū)牛感染新孢子蟲(chóng)病方面仍為空白。鑒此，筆者于2016年1月對(duì)大通縣4個(gè)不同地區(qū)的200份牛血清樣品和1個(gè)牛場(chǎng)的100份牛血清樣品進(jìn)行了新孢子蟲(chóng)抗體ELISA檢測(cè)、診斷，獲得了大通縣地區(qū)有關(guān)牛新孢子蟲(chóng)病感染現(xiàn)狀的實(shí)際數(shù)據(jù)，為進(jìn)一步掌握大通縣地區(qū)牛新孢子蟲(chóng)病的綜合防控提供了科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 血清樣品 2016年1月分別隨機(jī)采自大通縣4個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)200份血樣(其中向化鄉(xiāng)50份，青林鄉(xiāng)50份，青山鄉(xiāng)50份，崗沖鄉(xiāng)50份)和1個(gè)牛場(chǎng)的100份血樣，共計(jì)300份血清樣品。經(jīng)牛尾靜脈采血，擺成斜面，低溫保存送回實(shí)驗(yàn)室，室溫放置過(guò)夜或37 ℃靜置0.5～1 h后，以3 000 r/min離心10 min，分離血清，置-20 ℃冷凍保存，備用。

1.2 主要儀器 LED-3型超凈工作臺(tái)，購(gòu)自蘇州凈化設(shè)備有限公司；PHS-3B型精密PH計(jì)、FA2014N型電子天平，購(gòu)自上海精密科學(xué)儀器有限公司；85-2A型雙向恒溫磁力攪拌器，購(gòu)自金壇市醫(yī)療儀器廠；TGL18M型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，購(gòu)自長(zhǎng)沙易達(dá)儀器有限公司；AUCMA低溫保存箱、BCD-202K型冰箱，購(gòu)自澳柯瑪股份有限公司；722N型可見(jiàn)分光光度計(jì)，購(gòu)自上海菁華科技儀器有限公司；IMARK型酶標(biāo)儀，購(gòu)自Bio-Rad Laboratories, Inc, Japan；DNX-9620型電腦洗板機(jī)，購(gòu)自北京普朗新科技有限公司；精宏電熱恒溫培養(yǎng)箱，購(gòu)自上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；SPX-250B型生化培養(yǎng)箱，購(gòu)自金壇市白塔金昌實(shí)驗(yàn)儀器廠。

1.3 主要試劑 牛新孢子蟲(chóng)抗體(Neosporiasis Ab)酶聯(lián)免疫分析試劑盒(生產(chǎn)批號(hào)：2015010D05)，購(gòu)自上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司，美國(guó)TSZ進(jìn)口分裝。

1.4 主要操作步驟 按嚴(yán)格牛新孢子蟲(chóng)抗體酶聯(lián)免疫分析檢測(cè)試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，具體步驟省略。

1.5 計(jì)算和判定標(biāo)準(zhǔn) 試驗(yàn)有效性：陽(yáng)性對(duì)照孔平均值≥1.00，陰性對(duì)照平均值≤0.10；臨界值(CUT OFF)計(jì)算：臨界值=陰性對(duì)照孔平均值+0.15；陰性判定：樣品OD值<臨界值(CUT OFF)者為牛新孢子蟲(chóng)抗體(Neosporiasis Ab)陰性；陽(yáng)性判定：樣品OD值≥臨界值(CUT OFF)者為牛新孢子蟲(chóng)抗體(Neosporiasis Ab)陽(yáng)性。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析 利用Microsoft Excel 2003軟件，對(duì)不同地區(qū)、品種和年齡的樣本進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，當(dāng)P<0.05時(shí)差異顯著，P<0.01時(shí)差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 本次調(diào)查應(yīng)用ELISA方法，對(duì)大通縣向化、青山、青林、崗沖4個(gè)不同地區(qū)和1個(gè)牛場(chǎng)的300份牛血清樣品進(jìn)行牛新孢子蟲(chóng)病血清學(xué)檢測(cè)。檢測(cè)中陽(yáng)性判定均值為1.372，陰性判定均值為0.084，試驗(yàn)成立。根據(jù)臨界值作陰、陽(yáng)性判定，結(jié)果表明，在大通縣地區(qū)300份牛血清樣品中共檢出18份陽(yáng)性血清，平均陽(yáng)性率為6%；大通縣向化、青山、青林、崗沖地區(qū)和某牛場(chǎng)牛新孢子蟲(chóng)陽(yáng)性率分別為8%、12%、14%、2%和0%，大通縣向化、青山、青林和崗沖地區(qū)均為牛新孢子蟲(chóng)病的流行地區(qū)，其中青山和青林地區(qū)流行較嚴(yán)重，某牛場(chǎng)的100份牛血清樣品均未檢測(cè)出陽(yáng)性，見(jiàn)表1。

表1 大通縣地區(qū)新孢子蟲(chóng)感染情況

2.2 不同品種牛血清樣本新孢子蟲(chóng)病感染情況調(diào)查 本次試驗(yàn)對(duì)300份血清樣本進(jìn)行了新孢子蟲(chóng)抗體檢測(cè)，并將不同的品種黃牛、奶牛和牦牛區(qū)分檢測(cè)，見(jiàn)表2。結(jié)果表明，黃牛的陽(yáng)性率為11.96%，奶牛的陽(yáng)性率為3.47%，牦牛的陽(yáng)性率為2.86%，不同品種牛間都易感，牛新孢子蟲(chóng)感染率最高的是黃牛，其次是奶牛、牦牛。

表2 大通縣地區(qū)不同品種牛新孢子蟲(chóng)感染情況

2.3 不同年齡段間牛血清樣本新孢子蟲(chóng)病感染情況調(diào)查 不同年齡段間的牛新孢子蟲(chóng)病檢測(cè)結(jié)果，見(jiàn)表3。其中0～2歲的陽(yáng)性率為3.06%，3～5歲陽(yáng)性率為9.38%，6歲以上陽(yáng)性率為6.52%，說(shuō)明年齡越高易感性就越大，3歲以上年齡段牛比2歲以內(nèi)牛感染率高4.37%。

表3 不同年齡間牛新孢子蟲(chóng)感染情況

2.4 大通縣不同地區(qū)牛新孢子蟲(chóng)病感染對(duì)比情況 大通縣向化、青山、青林和崗沖四個(gè)地區(qū)新孢子蟲(chóng)感染情況對(duì)比，見(jiàn)圖1。如圖1所示，青林和青山地區(qū)牛新孢子蟲(chóng)病感染之間差異不顯著(P>0.05)，青林、青山與崗沖之間差異顯著(P<0.05)。青林、青山、向化與崗沖之間牛新孢子蟲(chóng)感染率存在顯著差異(P<0.05)。

圖1 大通縣不同地區(qū)牛新孢子蟲(chóng)病感染情況對(duì)比

3 小結(jié)與討論

3.1 自1988年Dubey等[7]發(fā)現(xiàn)新孢子蟲(chóng)病以來(lái)，科學(xué)家們對(duì)牛新孢子蟲(chóng)病的研究方法取得了很大的進(jìn)展，如檢測(cè)抗原、抗體的免疫學(xué)診斷方法ELISA、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、間接熒光抗體試驗(yàn)與免疫組織檢測(cè)等很多方法。近年來(lái)，檢測(cè)牛新孢子蟲(chóng)病的方法很多，但操作方法復(fù)雜，不適合臨床應(yīng)用，而ELISA方法，操作簡(jiǎn)便、快速，且特異性和敏感性都較高，廣泛應(yīng)用于牛新孢子蟲(chóng)病檢測(cè)[8]。本次試驗(yàn)應(yīng)用美國(guó)TSZ進(jìn)口分裝的牛新孢子蟲(chóng)抗體(Neosporiasis Ab)酶聯(lián)免疫分析試劑盒對(duì)采集的300頭份牛血清樣品進(jìn)行牛新孢子蟲(chóng)病檢測(cè)，結(jié)果檢出了18份陽(yáng)性血清樣品，平均陽(yáng)性總檢出率為6%(18/300)。檢測(cè)結(jié)果初步說(shuō)明，在大通縣檢測(cè)的四個(gè)不同地區(qū)存在牛感染新孢子蟲(chóng)病的情況，且陽(yáng)性率也略有不同，而在牛場(chǎng)未檢出陽(yáng)性，調(diào)查初步掌握了大通縣地區(qū)牛新孢子蟲(chóng)病的感染情況。

3.2 在對(duì)大通縣向化、青山、青林、崗沖四個(gè)不同地區(qū)和某牛場(chǎng)的300份血清樣本進(jìn)行牛新孢子蟲(chóng)病抗體調(diào)査研究中，向化、青山、青林、崗沖四個(gè)地區(qū)均是牛新孢子蟲(chóng)的感染地區(qū)，其中青山和青林地區(qū)感染較為嚴(yán)重，崗沖地區(qū)感染率最低，這可能與地理環(huán)境、飼養(yǎng)管理方式有關(guān)。試驗(yàn)中向化、青山、青林屬于腦山地區(qū)以放牧為主，崗沖位于淺山地區(qū)飼養(yǎng)管理以夏季放牧和冬季舍飼為主，腦山地區(qū)陽(yáng)性率高于淺山地區(qū)，說(shuō)明放牧飼養(yǎng)牛對(duì)新孢子蟲(chóng)病更易感；牛場(chǎng)飼養(yǎng)方式主要為圈飼，飼養(yǎng)管理較正規(guī)，未檢出陽(yáng)性。在不同品種間牛新孢子蟲(chóng)病調(diào)查顯示，黃牛陽(yáng)性率髙于牦牛陽(yáng)性率，說(shuō)明牦牛的抗病能力高于黃牛的抗病能力。在不同年齡的牛血清中6歲以上的陽(yáng)性率高于0～2歲的陽(yáng)性率，說(shuō)明成年牛更易感染此病。調(diào)查中發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性率較高的地區(qū)有犬存在，因犬既是新孢子蟲(chóng)的中間宿主也是終末宿主，造成牛感染新孢子蟲(chóng)病的機(jī)率就大，易感性增加。

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2016-05-19

伊平昌(1979-)，男(蒙古族)，獸醫(yī)師，博士，主要從事動(dòng)物疾病診斷和防控工作，E-mail：yipingchang_111@126.com

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0529-6005(2017)05-0057-02