漆酶的來源及固定化漆酶載體研究進(jìn)展

鄧寒梅 邵可 梁家豪 陳燁同 閻光緒

（中國石油大學(xué)（北京）北京市油氣污染防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 重質(zhì)油國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102249）

漆酶的來源及固定化漆酶載體研究進(jìn)展

鄧寒梅 邵可 梁家豪 陳燁同 閻光緒

（中國石油大學(xué)（北京）北京市油氣污染防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 重質(zhì)油國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102249）

漆酶是一種多酚氧化酶，可催化氧化多種難降解有機(jī)污染物，在環(huán)境污染防治領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景?？偨Y(jié)了植物漆酶、動(dòng)物漆酶以及微生物漆酶的研究現(xiàn)狀，詳細(xì)討論了漆酶固定化載體的研究進(jìn)展，進(jìn)一步指出了目前漆酶研究存在的問題，并提出未來的研究方向，旨在為漆酶的開發(fā)與應(yīng)用研究提供參考。

漆酶固定化；漆酶；載體；固定化

漆酶是一種含有多個(gè)銅離子的多酚氧化酶，可催化氧化多種難降解有機(jī)污染物，包括氯酚類污染物、多環(huán)芳烴、染料、氯仿、苯系物及其衍生物、三硝基甲苯（Trinitrotoluene，TNT）及其他污染物，在水污染的防治與控制中具有良好的應(yīng)用前景［1］。且漆酶催化底物廣泛，貯存要求低，氧化底物不產(chǎn)生二次污染等優(yōu)勢，自漆酶發(fā)現(xiàn)以來，漆酶的開發(fā)與研究一直是國內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)。

漆酶來源廣泛，可存在于高等植物、細(xì)菌、真菌和昆蟲中，不同物種中漆酶的含量、催化部位的結(jié)構(gòu)和酶學(xué)性質(zhì)差異較大，篩選高漆酶活性的動(dòng)植物和微生物一直是漆酶研究的重點(diǎn)［2-4］。由于游離態(tài)的漆酶對(duì)外部環(huán)境敏感、穩(wěn)定性差和重復(fù)利用率低，一些學(xué)者提出了漆酶固定化的方法，大大改善了漆酶在催化過程中易失活的問題，提高了漆酶的利用率。合適的載體是漆酶固定化的關(guān)鍵，廉價(jià)高效的載體可以提高漆酶固定化的效率和酶活的穩(wěn)定性。近年來，隨著漆酶固定化研究以及材料等相關(guān)研究領(lǐng)域的快速發(fā)展，越來越多高效的固定化載體被發(fā)現(xiàn)，極大地推動(dòng)了固定化漆酶的工業(yè)化應(yīng)用。

本文根據(jù)國內(nèi)外最近研究進(jìn)展，總結(jié)了漆酶的來源及漆酶固定化載體研究進(jìn)展，指出了目前漆酶研究存在的問題，并提出未來的研究方向，旨在為漆酶的開發(fā)與應(yīng)用研究提供參考。

1 漆酶的來源

1.1 動(dòng)植物漆酶

漆酶來源廣泛，存在于一些高等植物、細(xì)菌、真菌和昆蟲體內(nèi)。按漆酶的來源可分為植物漆酶、動(dòng)物漆酶和微生物漆酶3類，其中植物漆酶發(fā)現(xiàn)最早，但高等植物的漆酶的研究相對(duì)較少。目前，已發(fā)現(xiàn)漆酶的植物有日本漆樹、歐亞槭樹、擬南芥、水稻、松樹、黃楊、棉花、芒果和香蕉等［5，6］。相比其他兩類漆酶，對(duì)動(dòng)物漆酶的研究報(bào)道最少，存在漆酶的動(dòng)物（昆蟲）有豬、煙草天蛾、綠頭蒼蠅、蚊子及雙翅目的遷移類蝗蟲等。然而，一些學(xué)者指出動(dòng)物漆酶可能是某種多酚氧化酶，并不屬于嚴(yán)格意義上的漆酶，關(guān)于動(dòng)物漆酶性質(zhì)的確定還需要進(jìn)一步的研究。

1.2 微生物漆酶

動(dòng)植物漆酶一般生長周期長，同時(shí)還受地理、氣候和季節(jié)等因素的限制，不適于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。微生物生長周期短，繁殖快，且易于提取與純化，微生物漆酶是工業(yè)漆酶的重要來源。微生物漆酶可分為真菌漆酶和細(xì)菌漆酶，其中真菌漆酶的研究較多。據(jù)統(tǒng)計(jì)，截至目前，已發(fā)現(xiàn)的產(chǎn)漆酶真菌超過1 000種，分離提純的真菌漆酶超過100多種［7］。真菌漆酶的研究主要以擔(dān)子菌、脈孢菌、子囊菌、曲霉和柄孢殼菌等為主，其中以高等擔(dān)子菌中的白腐真菌被認(rèn)為是主要的真菌漆酶生產(chǎn)者和研究對(duì)象，由于白腐真菌漆酶屬于胞外酶，更易于分離和提純［8］。表1總結(jié)了典型產(chǎn)漆酶真菌的種類和特性。

相比真菌漆酶，細(xì)菌漆酶的研究相對(duì)較晚。細(xì)菌漆酶首次發(fā)現(xiàn)是由Givaudan在1993年在從水稻根圍的土壤中分離的脂固氮螺菌中發(fā)現(xiàn)的，隨后在交互單胞菌、芽孢桿菌、球形芽孢桿菌、大腸桿菌、苜蓿中華根瘤菌、野油菜黃單胞菌等中均有所發(fā)現(xiàn)。表2總結(jié)了一些典型產(chǎn)漆酶細(xì)菌的種類和特點(diǎn)。一般來說，真菌漆酶的pH適用范圍為4-6，溫度為30-50℃［16］，且真菌漆酶活性易受外部環(huán)境的影響，氯化物、疊氮化合物、氫氧化物等化合物均能抑制漆酶活性［17］。而細(xì)菌漆酶適用pH一般為堿性條件，且對(duì)外部環(huán)境不敏感，耐熱性更強(qiáng)。因此，廣泛開展細(xì)菌漆酶的研究將具有重要的意義。

表1 典型產(chǎn)漆酶真菌種類及其應(yīng)用

2 漆酶固定化載體

漆酶是一種水溶性蛋白酶，與其他游離酶一樣，穩(wěn)定性較差，且在環(huán)境中容易失活。漆酶的易失活、穩(wěn)定性差和重復(fù)利用率低等特性，限制了漆酶的工程化應(yīng)用。一般來說，漆酶的活性受pH、溫度和鹽度等多種因素的影響。另外，有研究表明，表面活性劑的添加可降低漆酶的失活率［25，26］。相比添加表面活性劑的方法，漆酶固定化可改善漆酶在催化過程中易失活的問題，提高漆酶的重復(fù)利用率，且固定化漆酶對(duì)溫度、pH以及底物濃度的變化具有更好的承受能力，對(duì)外部環(huán)境的適應(yīng)能力更強(qiáng)［27］。固定化載體的選擇直接影響漆酶固定化的效率和固定化漆酶活性的高低。一般來說，常用的漆酶固定化載體往往具有以下特點(diǎn)［28］：（1）載體表面存在與酶分子發(fā)生耦聯(lián)的活性基團(tuán)；（2）載體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，具有良好的機(jī)械強(qiáng)度和生物相容性；（3）載體廉價(jià)易得，適用于大規(guī)模工業(yè)應(yīng)用。表3總結(jié)了常用漆酶固定化載體的特點(diǎn)及適用條件。

表2 產(chǎn)漆酶細(xì)菌的種類及其應(yīng)用

表3 常用漆酶固定化載體

為了進(jìn)一步提高漆酶固定化的效果，一些研究者對(duì)載體進(jìn)行表面修飾，并取得的良好的效果。張育淇等［39］采用以氨基化表面修飾的SiO2大孔材料為載體，以戊二醛為交聯(lián)劑對(duì)漆酶進(jìn)行固定化，發(fā)現(xiàn)在最佳固定化條件下，固定化漆酶活性達(dá)111.4 U/g，且固定化漆酶pH穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性和重復(fù)使用性均得到了提高。宦慶松等［40］以二苯甲酮為光引發(fā)劑，甲基丙烯酸為接枝單體，通過紫外光引發(fā)接枝到聚丙烯上，對(duì)聚丙烯纖維進(jìn)行表面改性，并進(jìn)一步研究了固定化漆酶染料脫色的性能。染料脫色試驗(yàn)表明，以改性的聚丙烯纖維為載體固定化漆酶脫色效率和穩(wěn)定性均有所提高?？梢?，經(jīng)過載體加工修飾和改性，使載體材料表面具有更多的功能基團(tuán)，可提高載體材料的生物相容性，并大大提高固定化漆酶的性能。

納米磁性復(fù)合載體是近年來發(fā)展的新型固定化酶載體，通過在傳統(tǒng)載體的基礎(chǔ)上，引入磁性金屬或者金屬化氧，使其具有磁響應(yīng)性能，在外加磁場的作用下，可實(shí)現(xiàn)漆酶的快速分離和回收，從而降低反應(yīng)成本［41］。納米磁性復(fù)合材料不僅具有大孔體積和比表面積，而且且孔徑及形貌單一可控，是一種理想的漆酶固定化載體，在漆酶固定化方面具有良好的應(yīng)用前景。自納米磁性復(fù)合材料提出以來，就受到國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。黃俊等［42］制備了（CuTAPc-）-Fe3O4納米復(fù)合粒子，并對(duì)漆酶固定化性能進(jìn)行了研究，研究表明，采用（CuTAPc-）-Fe3O4納米復(fù)合粒子固定漆酶的固定化率可達(dá)78.3%，且提高了固定化漆酶的貯存穩(wěn)定性與操作穩(wěn)定性。同樣的，趙敏等［43］采用以五氯化磷修飾的磁性海藻酸鈉微粒對(duì)漆酶固定，發(fā)現(xiàn)固定化漆酶最適pH范圍更寬，熱穩(wěn)定性和貯存性均得到了提高。研究，如添加誘導(dǎo)物，降低阻遏物濃度及基因突變等，對(duì)推動(dòng)漆酶的工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用具有重要意義。

（1）現(xiàn)今，漆酶主要通過生物制取方式獲得，為滿足工業(yè)化需求，這就必須要有充足的原材料，因此尋求高效產(chǎn)漆酶的動(dòng)植物和篩選可大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)漆酶的微生物，降低漆酶生產(chǎn)成本，將一直是漆酶研究的重點(diǎn)。此外，廣泛開展提高漆酶產(chǎn)量的

（2）進(jìn)一步開發(fā)高效的漆酶固定化技術(shù)，優(yōu)選出高效、穩(wěn)定的漆酶固定化載體，同時(shí)，通過對(duì)現(xiàn)有載體進(jìn)行修飾和改性，提高載體的固定化性能將是未來漆酶固定化研究的一個(gè)重要方向。

（3）研究漆酶與其他污水處理工藝的相互協(xié)同作用，優(yōu)化漆酶的反應(yīng)條件，進(jìn)一步提高污水處理效果。此外，加大研究漆酶降解有機(jī)污染物的降解機(jī)理，進(jìn)一步擴(kuò)寬漆酶在水污染防治中的應(yīng)用。

（4）細(xì)菌漆酶可實(shí)現(xiàn)大規(guī)模、低成本的工業(yè)化生產(chǎn)，同時(shí)細(xì)菌漆酶具有良好的穩(wěn)定性及其環(huán)境適應(yīng)性，開展對(duì)細(xì)菌漆酶的廣泛研究具有重要的意義。利用基因工程對(duì)微生物進(jìn)行異源表達(dá)，改善漆酶性質(zhì)，進(jìn)一步擴(kuò)寬漆酶的適用范圍將是未來研究的一個(gè)重要方向。

3 展望

漆酶是一種多酚氧化酶，可催化氧化多種難降解有機(jī)污染物，在環(huán)境污染防治領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景。但由于其來源有限，價(jià)格昂貴，且穩(wěn)定性差，在環(huán)境中易失活等特點(diǎn)，限制了其大規(guī)模的應(yīng)用。通過對(duì)漆酶固定化，可有效提高漆酶的穩(wěn)定性和重復(fù)利用性，降低運(yùn)行成本。

目前，我國關(guān)于漆酶應(yīng)用于環(huán)境污染防治方面的研究仍處于實(shí)驗(yàn)室研究階段，工程應(yīng)用的報(bào)道較少，還需進(jìn)一步研究：

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（責(zé)任編輯 李楠）

Source of Laccase and Research Progress on Carriers for Laccase Immobilization

DENG Han-mei SHAO Ke LIANG Jia-hao CHEN Ye-tong YAN Guang-xu
（State Key Laboratory of Heavy Oil Processing，Beijing Key Laboratory of Oil & Gas Pollution Control，China University of Petroleum（Beijing），Beijing 102249）

Laccase is a polyphenol oxidase that can catalyze oxidation of many refractory organic pollutants，which has solid application foreground in the field of pollution prevention and control. This paper describes the research advances on plant laccase，animal laccase and microbial laccase，mainly discusses the progress on the research of carriers for immobilized laccase. Furthermore，it presents the remaining problems and future directions on the research of laccase for offering the reference to the development and application of laccase.

laccase immobilization；laccase；carrier；immobilization

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016-0892

2016-12-15

鄧寒梅，女，碩士研究生，研究方向：水污染的防治及其資源化；E-mail：deng_hanmeimei@163.com

閻光緒，男，教授，研究方向：“三廢”治理與資源化、給排水系統(tǒng)優(yōu)化、污染生態(tài)評(píng)價(jià)及修復(fù)；E-mail：yangx0919@163.com