葛優(yōu)優(yōu)劉曉瑜竇桂銘馬玉超

（1. 北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100083；2. 北京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，北京 100083）

內(nèi)生鏈霉菌SSD49的抑菌活性和防病促生效果

葛優(yōu)優(yōu)1劉曉瑜1竇桂銘2馬玉超1

（1. 北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100083；2. 北京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，北京 100083）

內(nèi)生鏈霉菌SSD49分離自羊角拗的根部，對楊樹潰瘍病病原真菌具有很強的抑菌活性。為了研究該菌對各種病原菌的抑菌活性，促進植物生長的特征和作為生防菌劑的潛力，進行了平板對峙、組織培養(yǎng)和溫室盆栽實驗。結(jié)果顯示，SSD49能夠抑制板栗疫病菌、大豆核盤菌、辣椒疫霉、蘋果輪紋病病原菌、楊樹潰瘍病細菌型病原菌、以及耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和白假絲酵母等多種植物病原菌和人類機會致病菌，并產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶和31.56 mg/L的吲哚乙酸；接種SSD49孢子液的毛白楊組培苗、大豆、番茄和辣椒的株高、根長和地上部分干重及根干重分別提高了16.98%-41.82%、19.00%-55.85%、4.58%-70.87%和15.25%-126.06%；對大豆菌核病的防治效果達到88.24%。以上研究結(jié)果證明內(nèi)生鏈霉菌SSD49在農(nóng)林業(yè)的生物防治中具有潛在的應(yīng)用價值，生防、促生機理有待進一步深入研究。

植物內(nèi)生菌；內(nèi)生鏈霉菌；抑菌活性；生物防治；植物促生

植物內(nèi)生菌能夠從根皮層穿越內(nèi)皮屏障進入到健康植物的各個組織中，依賴于宿主植物為其提供生長必需的能量和營養(yǎng)，同時通過自身的代謝產(chǎn)物或借助于信號傳導(dǎo)作用影響植物的生長、發(fā)育、抵抗生物及非生物脅迫等［1］。植物內(nèi)生菌，尤其是鏈霉菌產(chǎn)生抗生素［2］和細胞壁降解酶［3］等生物活性物質(zhì)來抑制植物病原菌的生長，并誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性［4］。而且，內(nèi)生菌通過產(chǎn)生植物激素（生長素、赤霉素、細胞分裂素或乙烯等）［5］和鐵載體［6］等營養(yǎng)物質(zhì)或通過生物固氮［7］和解磷作用［8］等促進植物生長。因此，植物內(nèi)生菌及其產(chǎn)生的天然活性物質(zhì)在植物促生和生物防治方面有巨大的應(yīng)用潛力。

鏈霉菌是天然產(chǎn)物，尤其是抗生素的杰出生產(chǎn)者，為人類的健康做出了卓越的貢獻。最近的研究報道表明內(nèi)生鏈霉菌在協(xié)同植物生長方面具有重要的作用［9］。Lin等［10］從紅豆杉中分離獲得內(nèi)生鏈霉菌En-1，該菌產(chǎn)IAA，并且能夠促進擬南芥的生長。植物內(nèi)生鏈霉菌也可以促進水稻［11］、高粱［12］、小麥［13］、番茄［14］等農(nóng)作物的生長。Rakotoniriana等［15］從長春花莖部首次分離出一株輪生的內(nèi)生鏈霉菌，產(chǎn)生多烯大環(huán)內(nèi)脂抗生素，能夠抑制許多植物病原菌，尤其是盤長孢狀刺盤孢和核盤菌。分離自藥用植物的具有產(chǎn)幾丁質(zhì)酶和溶磷能力的內(nèi)生鏈霉菌，不僅顯著增加了鷹嘴豆生物量（1.2-2倍），還能有效預(yù)防齊整小核菌引起的鷹嘴豆莖腐病［16］。

在前期研究工作中，我們從藥用植物羊角拗（Strophanthus divaricatus）的根部獲得了內(nèi)生菌SSD49，該菌對楊樹潰瘍病病原真菌（Botryosphaeria dothidea）具有較強的抑制活性。本研究主要對該菌的分類地位、抑菌譜、促進植物生長和生防潛力進行深入研究，旨在為開發(fā)環(huán)保型生防菌劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株和病原菌 供試菌株：內(nèi)生鏈霉菌SSD49，分離自藥用植物羊角拗（S. divaricatus）的根部組織。病原菌：耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus T1959）來自北京大學(xué)第三醫(yī)院，白假絲酵母（Candida albicans ATCC 10231）購于中科院微生物研究所菌種保藏中心，蘋果輪紋病病原菌（Dothiorella gregaria）、兩種楊樹潰瘍病病原真菌（Botryosphaeria dothidea CFCC 7926/7897）和歐美楊細菌性潰瘍病病原菌（Lonsdalea quercina subsp. populi）由北京林業(yè)大學(xué)賀偉教授饋贈，板栗疫病菌（Cryphonectria parasitica）、大豆核盤菌（Sclerotinia sclerotiorum）和辣椒疫霉（Phytophthora capsici）由中國農(nóng)科院李世東教授饋贈。

1.1.2 培養(yǎng)基 ISP2培養(yǎng)基［17］：酵母提取物4 g，麥芽提取物10 g，葡萄糖4 g，瓊脂18 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.2-7.4；PDA培養(yǎng)基：土豆200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水 1 000 mL，pH自然；幾丁質(zhì)培養(yǎng)基［18］：膠體幾丁質(zhì)20-25 g，酵母粉1.5 g，硫酸銨1.5 g，磷酸氫二鉀0.7 g，磷酸二氫鉀0.3 g，七水合硫酸鎂0.5 g，七水合硫酸亞鐵0.01 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0；ISP1培養(yǎng)基：胰酪蛋白胨5 g，酵母浸粉3 g，pH 7.2。

1.1.3 主要試劑 革蘭氏陽性菌基因組DNA提取試劑盒購自Bio-tek OMEGA，PCR擴增相關(guān)試劑購自大連寶生物工程有限公司，引物由 Invitrogen公司合成，測序服務(wù)由生工生物工程（上海）股份有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1 菌株鑒定 利用OMEGA革蘭氏陽性菌基因組DNA提取試劑盒提取內(nèi)生菌的基因組，以基因組DNA為模板，利用細菌通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'） 和 1492R（5'-TTAAGGTGATCCAGCCGCA-3'）PCR擴 增16S rRNA基因［19］。PCR擴增條件為：變性 94℃ 4 min；94℃ 1 min，55℃ 1 min和72℃ 2 min，循環(huán)30次；72℃ 10 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后送測序。測序結(jié)果經(jīng)DNAMAN軟件拼接后，提交到http://eztaxon-e.ezbiocloud.net/進行序列比對［20］，隨后運用MEGA 6.0軟件，采用鄰接法（Neighbour Joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.2 抑菌活性廣譜性分析 以蘋果輪紋病病原菌、大豆核盤菌、板栗疫病菌、辣椒疫霉和楊樹潰瘍病病原真菌作為指示菌，利用平板對峙法進行內(nèi)生菌SSD49的抑菌活性廣譜性分析，即在每個PDA平板左側(cè)分別接種一種病原菌，右側(cè)接種SSD49，二者對峙距離約5 cm，以只接種病原菌的平板作為對照，每種病原菌重復(fù)3次，28℃恒溫倒置培養(yǎng)7 d后觀察抑菌圈的有無及大小。

在ISP2固體培養(yǎng)基平板的左側(cè)縱向劃線接種SSD49，28℃恒溫培養(yǎng)2 d，待菌體產(chǎn)生孢子時，在平板的右側(cè)從上至下分別橫向劃線接種耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、白假絲酵母和歐美楊細菌性潰瘍病病原菌，劃線要盡量接近SSD49，28℃恒溫培養(yǎng)2 d后，觀察并記錄抑菌效果。

1.2.3 幾丁質(zhì)酶活性的檢測 將SSD49菌株接種到幾丁質(zhì)培養(yǎng)基，28℃恒溫培養(yǎng)1-2周，觀察是否有透明圈的出現(xiàn)，有透明圈則表明該菌株有幾丁質(zhì)酶活性，透明圈的大小與幾丁質(zhì)酶活性大小呈正相關(guān)。

1.2.4 吲哚乙酸的測定 將SSD49接種于含有500 mg/L色氨酸的ISP1液體培養(yǎng)基中，28℃ 120 r/min震蕩培養(yǎng)72 h。5 000 ×g離心10 min取上清，加入等體積Salkowshi試劑，然后用分光光度計在530 nm下測量吸光度，以不加內(nèi)生菌的培養(yǎng)基作空白對照，重復(fù)3次實驗，計算IAA的濃度，以分析純的IAA梯度稀釋制備標準曲線［21］。

1.2.5 內(nèi)生菌對毛白楊組培苗的促生實驗 內(nèi)生菌在ISP2培養(yǎng)基平板中培養(yǎng)1周后，用無菌水沖洗下孢子，制成106個/mL的孢子懸液。選取生長條件良好的毛白楊組培苗，用無菌剪刀剪下含有3片真葉且大小相似的組培苗頂芽，將下端浸泡在孢子液中1 min，立即插到新的MS固體培養(yǎng)基中；同時用等體積的無菌水浸泡的同一批組培苗作為對照組，每個瓶子接種1株幼苗，每個處理10個重復(fù)。將接種好的組培苗置于組培室中25℃培養(yǎng)4周后，測量并統(tǒng)計組培苗的生長情況。

1.2.6 內(nèi)生菌對大豆、番茄和辣椒的促生實驗 將大豆、番茄和辣椒種子表面消毒后種到裝有滅菌土的花盆中，大豆每盆種2株，番茄和辣椒每盆種3株，待長出4片真葉后澆灌50 mL的孢子液（107個/mL）于表層土中，每種植物各5盆作為實驗組，同時設(shè)置不施加孢子液用等體積的無菌水代替的同一批植物作為對照組，放置在溫室里培養(yǎng)60 d后測定各組大豆、番茄和辣椒的株高、根長和干重。

1.2.7 內(nèi)生菌對大豆菌核病的防治 飽滿大豆種子經(jīng)表面消毒后種到裝有滅菌土的花盆中，每盆播種2粒，待第4片真葉長出時接種50 mL 孢子液（107個/mL），以同一批大豆接種等量無菌水作為陰性對照。7 d后各組大豆均澆灌50 mL大豆核盤菌孢子液（107個/mL）于苗莖基部，以澆灌等量無菌水作為陽性對照，各組設(shè)置5盆重復(fù)。澆灌7 d和15 d后分別統(tǒng)計各組的大豆菌核病發(fā)病情況與病情指數(shù)并計算防治效果。

大豆菌核病病情指數(shù)分級標準：0級，無病；1級，一些壞死或葉片總病變區(qū)域＜5%；2級，葉片總病變區(qū)域在5%-10%之間；3級，植株有較多病變，葉片總病變區(qū)域在11%-30%之間，莖端出現(xiàn)腐爛；4級，植株病變嚴重，葉片總病變區(qū)域在31%-94%之間，莖頂端出現(xiàn)腐爛；5級，植株病變嚴重，葉片總病變區(qū)域＞ 94%，莖從頂端到底部均腐爛，或植株死亡［22］。

病情指數(shù)（%）=∑（各級病株數(shù)×各級代表值）/（調(diào)查總株數(shù)×最高級代表值）×100

防治效果（%）=（對照病情指數(shù)-處理病情指數(shù)）/對照病情指數(shù)×100

1.2.8 數(shù)據(jù)處理 用SPSS19.0（SPSS Inc.，Chicago，Illinois）的單因素方差分析（ANOVA）和Duncan’s tests（P＜0.05）進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果

2.1 菌株鑒定

內(nèi)生菌SSD49的16S rRNA基 因 的PCR產(chǎn)物的DNA序列長度為1 396 bp，GenBank序列號為KY290591，將序列提交EzTaxon進行比對，結(jié)果表明該菌為鏈霉菌，與Streptomyces somaliensis NBRC 12916T、Streptomyces albidoflavus DSM 40455T、Streptomyces hydrogenans NBRC 13475T、Streptomyces daghestanicus NRRL B-5418T和Streptomyces violascens ISP 5183T的同源性均為99.85%。選擇相似度高于98.5%的17株鏈霉菌，利用MEGA5.0軟件構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖1。

2.2 內(nèi)生鏈霉菌SSD49的抑菌活性分析

本研究利用平板對峙法檢測了內(nèi)生鏈霉菌SSD49對楊樹潰瘍病菌和其他5種植物病原菌（4種病原真菌和1種病原細菌）和兩種人類機會致病菌（1種細菌和1種酵母菌）的抑菌活性。結(jié)果表明，除辣椒疫霉外（圖2-C），該菌不但對白假絲酵母菌和甲氧西林金黃色葡萄球菌具有很強的抑制作用（圖2-H和I），而且對楊樹潰瘍病病原真菌（圖2-E和F），板栗疫病菌、大豆核盤菌、蘋果輪紋病病原菌和歐美楊細菌性潰瘍病病原菌具有較好的抑菌效果（圖2-A、B、D和J）。

2.3 幾丁質(zhì)酶和吲哚乙酸的產(chǎn)量

將SSD49菌株接種在膠體幾丁質(zhì)培養(yǎng)基后，菌株周圍形成了明顯的透明圈，單位菌落透明圈大小達到1.25 cm，可知SSD49是一株具有產(chǎn)幾丁質(zhì)酶活性的菌株。根際微生物產(chǎn)生植物生長激素調(diào)節(jié)植物生長是根際微生物促生作用的重要機制之一。經(jīng)Salkowski比色法測定，內(nèi)生鏈霉菌SSD49可產(chǎn)生31.56 mg/L的吲哚乙酸。

圖1 SSD49 16S rRNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹

圖2 內(nèi)生菌SSD49對9種病原菌的拮抗作用

2.4 內(nèi)生鏈霉菌SSD49的促生作用

采用組培苗和溫室盆栽實驗，對內(nèi)生菌SSD49的促植物生長作用進行測定。將內(nèi)生菌SSD49的孢子懸液接種于毛白楊組培苗、大豆、番茄和辣椒幼苗，相同條件培養(yǎng)60 d，結(jié)果（表1）表明該菌對毛白楊組培苗、大豆、番茄和辣椒均具有明顯的促生效果。接種SSD49孢子懸液的毛白楊組培苗、大豆、番茄和辣椒平均株高分別為10.14 cm、65.08 cm、22.05 cm和8.61 cm，與對照相比，分別提高了41.82%、 30.24%、18.17%和16.98%；地上部分的干重分別增加了19.00%、55.85%、49.54%和30.05%；根長分別提高了70.87%、4.58%、63.54%和32.69%，根干重也有了顯著提高，分別比對照組增加了28.19%、 126.06%、106.89%和15.25%。

表1 內(nèi)生鏈霉菌SSD49對大豆、番茄、辣椒和毛白楊組培苗的促生效果

2.5 內(nèi)生鏈霉菌SSD49對大豆菌核病的生物防治

本研究觀察和記錄了接種核盤菌的大豆植株的發(fā)病情況及SSD49對核盤菌發(fā)病情況的影響及防治效果。結(jié)果（表2）表明，接種核盤菌7 d和15 d后，大豆的病情指數(shù)分別達到約47.22和55.55，而接種SSD49孢子懸液一周后再接種菌核病病原菌，病情指數(shù)分別降低為5.55和11.11，7 d后對大豆核盤菌的防治效果高達88.24%，15 d后的生物防治效果依然很明顯。

表2 內(nèi)生鏈霉菌SSD49對大豆菌核病的防治效果

3 討論

植物內(nèi)生菌協(xié)同植物共同進化，不但能夠產(chǎn)生次級代謝產(chǎn)物和細胞壁降解酶抑制病原菌的侵染［23］，同時能夠產(chǎn)生植物激素促進植物生長［24］，在農(nóng)林業(yè)生物防治方面具有廣闊的應(yīng)用前景。通過選擇性分離和平板拮抗實驗篩選，實驗室前期從羊角拗根部獲得了內(nèi)生菌SSD49，該菌對楊樹潰瘍病病原真菌具有很強的抑菌活性。本研究通過16S rRNA基因的擴增、測序和系統(tǒng)發(fā)育分析將該菌鑒定為鏈霉菌；利用平板對峙法，檢測到該菌能夠抑制多種植物病原菌和人類機會致病菌，具有廣譜的抑菌能力。

幾丁質(zhì)酶能水解真菌病原菌的細胞壁的成分，使細胞壁破裂，進而抑制真菌病原菌的生長［25］。雖然本研究利用膠體幾丁質(zhì)培養(yǎng)基證實菌株SSD49具有產(chǎn)幾丁質(zhì)水解酶的能力，是抑制病原真菌的機制之一。但是SSD49除了能抑制多種病原真菌（大豆菌核病菌、蘋果輪紋病病原菌、板栗疫霉菌和白假絲酵母菌），還能有效抑制病原細菌（歐美楊細菌性潰瘍病病原菌和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌）的生長，這說明SSD49可能產(chǎn)生一些抑菌的次級代謝產(chǎn)物。該菌所產(chǎn)生的抑菌次級代謝產(chǎn)物的種類、結(jié)構(gòu)特征及抑菌機理有待進一步深入研究。

產(chǎn)生植物生長素是植物促生菌促進植物生長和發(fā)育、提高植物產(chǎn)量、以及增強宿主植物對生物［16］和非生物脅迫［14］抵抗能力的重要作用機制之一。本實驗證明內(nèi)生鏈霉菌SSD49能夠產(chǎn)生較高濃度的吲哚乙酸，說明該菌具有植物促生的潛力。溫室盆栽實驗和楊樹組培實驗證實該菌對楊樹組培苗、大豆、辣椒和番茄具有很強的促生效果，顯著提高了這4種植物的株高、根長和干重。

核盤菌是一種世界性的腐生病原真菌，主要侵染包括大豆、油菜、向日葵等400多種高等植物［26］，造成農(nóng)作物嚴重減產(chǎn)，還能引起許多園藝植物和水果蔬菜的軟腐病。溫室盆栽實驗結(jié)果表明SSD49對大豆菌核病的生物效果達到88.24%。深入研究內(nèi)生菌SSD49在大豆、玉米、楊樹等植物體內(nèi)的定殖情況、田間生防效果、以及生防機制將是下一步的研究目標。

4 結(jié)論

內(nèi)生鏈霉菌SSD49具有抑菌譜廣和抑菌效果明顯的特征，能夠產(chǎn)生水解真菌細胞壁的幾丁質(zhì)酶和高濃度的植物生長素IAA（31.56 mg/L），能顯著促進毛白楊組培苗、大豆、番茄和辣椒的生長，對大豆菌核病的生防效果達到88.24%。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Antimicrobial Activities and Efficacy of Endophytic Streptomyces sp. SSD49 in Plant Disease Control and Plant-growth-promoting

GE You-you1LIU Xiao-yu1DOU Gui-ming2MA Yu-chao1
（1. College of Biological Sciences and Technology，Beijing Forestry University，Beijing 100083；2. College of Forestry，Beijing Forestry University，Beijing 100083）

The endophytic Streptomyces sp. SSD49，isolated from the roots of Strophanthus divaricatus，showed strong antifungal activity against Botryosphaeria dothidea. In order to analyze its antimicrobial activity against various pathogens and the characterization of plant-growthpromoting as well as the potential of biocontrol agents，a series of experiments were conducted，including plat confrontation，tissue culture and potting test in greenhouse. The results showed that Streptomyces sp. SSD49 inhibited the bacterial pathogens of Cryphonectria parasitica，Sclerotinia sclerotiorum，Phytophthora capsici，Dothiorella gregaria，Lonsdalea quercina subsp. populi，as well as plant pathogens and human opportunistic pathogens of Methicillin-resistant Staphylococcus aureus and Candida albicans. It secreted chitinase and produced indole acetic acid at the concentration of 31.56 mg/L. The shoot height，root length，shoot and root dry weight of Populus tomentosa tissue seedlings，soybean，tomato and pepper plants inoculated with strain SSD49 increased by 16.98-41.82%，19.00-55.85%，4.58-70.87% and 15.25-126.06%，respectively. The inhibition rate to Sclerotinia sclerotiorum reached 88.24%. The above results demonstrated that endophytic Streptomyces sp. SSD49 is potentially applicable in controlling plant disease in agriculture and forestry，while the mechanism of plant disease control and plant-growth-promoting needs to be further studied.

endophyte；endophytic Streptomyces；antimicrobial activities；plant disease control；plant-growth-promoting

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016-1121

2017-02-16

國家林業(yè)局公益項目（201304409），北京市科技新星項目（2011033），國家自然科學(xué)基金項目（J1103516）

葛優(yōu)優(yōu)，女，碩士，研究方向：植物內(nèi)生菌的抑菌活性；E-mail：geyouyou@outlook.com

馬玉超，女，博士，副教授，研究方向：微生物資源開發(fā)利用；E-mail：mayuchao@bjfu.edu.cn