高糖脅迫下槲皮素對(duì)釀酒酵母胞內(nèi)損傷的保護(hù)作用與機(jī)制

徐曉丹，潘 宇，柯尊麗，周志欽,2,*

（1.西南大學(xué)園藝園林學(xué)院，重 慶 400716；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑桔研究所，農(nóng)業(yè)部柑桔產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室（重慶），重慶 400715）

高糖脅迫下槲皮素對(duì)釀酒酵母胞內(nèi)損傷的保護(hù)作用與機(jī)制

徐曉丹1，潘 宇1，柯尊麗1，周志欽1,2,*

（1.西南大學(xué)園藝園林學(xué)院，重 慶 400716；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑桔研究所，農(nóng)業(yè)部柑桔產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室（重慶），重慶 400715）

以釀酒酵母S288c為模型，分析高糖 脅迫下槲皮素對(duì)其胞內(nèi)損傷的保護(hù)作用及機(jī)制。結(jié)果表明：與對(duì)照相比，高糖脅迫不影響酵母胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平，但顯著降低了胞內(nèi)酶比活力（P＜0.05）；槲皮素處理后，與對(duì)照組和高糖組相比，釀酒酵母胞內(nèi)ROS水平、超氧化物歧化酶和過(guò)氧化氫酶活力均顯著下降（P＜0.05），而過(guò)氧化物酶（peroxi dase，POD）比活力極顯著升高（P＜0.01），說(shuō)明POD比活力對(duì)高糖耐受性反應(yīng)更為靈敏，可作為衡量高糖脅迫應(yīng)激機(jī)制的重要生理指標(biāo)，槲皮素可通過(guò)調(diào)節(jié)胞內(nèi)POD比活力來(lái)提高機(jī)體的抗氧化能力。另外，實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)結(jié)果表明高質(zhì)量濃度葡萄糖顯著抑制了酵母中GPD2和SUC2的表達(dá)水平（P＜0.05），并極顯著提高了HXT1的表達(dá)水平（P＜0.01），而對(duì)GUT1的表 達(dá)影響不顯著；槲皮素處理后，高糖脅迫下酵母中GPD2、SUC2和HXT1的表達(dá) 水平顯著提高（P＜0.05），而GUT1無(wú)顯著變化，說(shuō)明槲皮素可能通過(guò)高滲透甘油途徑、菊糖水解途徑和己糖轉(zhuǎn)運(yùn)途徑等來(lái)促進(jìn)葡萄糖的分 解代謝，從而達(dá)到保護(hù)機(jī)體細(xì)胞免受傷害的作用。結(jié)果表明槲皮素對(duì)高糖誘導(dǎo)的釀酒酵母胞內(nèi)損傷具有保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與自身的抗氧化作用以及利用調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)高滲透甘油途徑與糖的分解和轉(zhuǎn)運(yùn)途徑存在一定的關(guān)聯(lián)性。

釀酒酵母；高糖脅迫；槲皮素；酶比活力；基因表達(dá)水平

在發(fā)酵與釀造業(yè)中，高糖發(fā)酵具有節(jié)省能源，提高酒精產(chǎn)量，降低成本等優(yōu)點(diǎn)，而釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）因其耐高滲特性而被廣泛應(yīng)用[1]。然而，在高糖脅迫下，細(xì)胞內(nèi)也會(huì)產(chǎn)生過(guò)量的活性氧（reactive oxygen species，ROS）和活性氮（reactive nitrogen species，RNS）等有害物質(zhì)，促使線粒體產(chǎn)生超氧化物并激活一氧化氮合酶，形成過(guò)氧亞硝基，致使機(jī)體進(jìn)一步被氧化而受損傷[1]。在生物體內(nèi)，過(guò)量的ROS、氮化物等氧化物會(huì)對(duì)生物體產(chǎn)生不同程度的傷害，造成細(xì)胞損傷，甚至凋亡。目前，關(guān)于氧化應(yīng)激反應(yīng)在釀酒酵母中已有很多相關(guān)報(bào)道，但普遍認(rèn)為超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）是重要的ROS清除劑，對(duì)維持生物體內(nèi)ROS的動(dòng)態(tài)平衡起重要作用[2]；另外，提高SOD和過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）活性可顯著提高其對(duì)逆境的耐受能力[3]。除此之外，研究認(rèn)為過(guò)氧化物酶（peroxidase，POD）與高糖耐受力也緊密關(guān)聯(lián)[3]，但具體的分子作用機(jī)制尚不清楚。

槲皮素（3,3′,4′,5,7-五羥基黃酮）是一種抗氧化能力較強(qiáng)的黃酮醇類物質(zhì)，在蔬菜、水果等食物中普遍存在，具有抗氧化、降脂及減少機(jī)體損傷等生物學(xué)功能，在清除自由基[4]、抗血小板聚集[5]、抗肥胖和延長(zhǎng)壽命[6]、抗炎[7]等方面發(fā)揮至關(guān)重要作用。此外，在人類系膜細(xì)胞模型中，槲皮素能顯著抑制高糖脅迫下ROS-NF-κB的信號(hào)途徑，從而保護(hù)機(jī)體細(xì)胞免受傷害[8]；其超強(qiáng)的抗氧化特性也能顯著抑制高糖脅迫下細(xì)胞的凋亡[9]。但在釀酒酵母模型中，高糖脅迫下槲皮素作為抗氧化劑對(duì)細(xì)胞保護(hù)作用的機(jī)理還尚不明確。因此，本研究以釀酒酵母S288c為模型，分析了高葡萄糖脅迫下槲皮素對(duì)相關(guān)抗氧化酶活性的影響及其葡萄糖代謝途徑中關(guān)鍵酶基因表達(dá)的差異，從細(xì)胞和分子水平上對(duì)槲皮素在高糖脅迫處理后胞內(nèi)抗氧化酶生理特性的變化及分子作用機(jī)制進(jìn)行了初步分析，為今后槲皮素等天然抗氧化黃酮類化合物的開(kāi)發(fā)及其應(yīng)用提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種與培養(yǎng)基

釀酒酵母S288c由廣東省微生物菌種保藏中心所提供。

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）液體培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L、蛋白胨20 g/L、酵母提取物10 g/L，121 ℃高壓滅菌15 min。

YPD固體培養(yǎng)基：YPD液體培養(yǎng)基加入瓊脂粉20 g/L。

高糖培養(yǎng)基：以YPD液體培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，添加葡萄糖至40、80、100 g/L，121 ℃高壓滅菌15 min。

1.1.2 試劑

槲皮素（純度≥98%） 寶雞浩翔生物技術(shù)有限公司；ROS檢測(cè)試劑盒 碧云天生物技術(shù)研究所；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、RNAiso Plus（Total RNA）提取試劑盒寶生物工程有限公司；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO） 美國(guó)Sigma公司；瓊脂粉、考馬斯亮藍(lán)G-250、葡萄糖、鉬酸銨、鄰苯三酚（焦性沒(méi)食子酸）、愈創(chuàng)木酚均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

300 μmol/L槲皮素：稱取0.151 g槲皮素粉末溶解于1 000 μL DMSO中，得500 μmol/L槲皮素，取300 μL的500 μmol/L槲皮素用DMSO定容至500 μL。

1.2 儀器與設(shè)備

紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 德國(guó)Eppendorf公司；Varioskan Flash全波長(zhǎng)掃描式多功能酶標(biāo)儀 美國(guó)Thermo公司；CFX96實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real time-polymerase chain reaction，qRT-PCR）儀 美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 釀酒酵母菌株活化與培養(yǎng)處理

將保存的菌種接種于YPD固體培養(yǎng)基于28 ℃培養(yǎng)，挑取單菌落轉(zhuǎn)接到Y(jié)PD液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)至OD600nm為1.0。將酵母細(xì)胞按1∶100（V/V）的接種量再接種于事先加入0.1%槲皮素或100 g/L葡萄糖處理的YPD液體培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)，槲皮素作用8 h后的釀酒酵母細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)中各指標(biāo)的測(cè)定。實(shí)驗(yàn)分4 個(gè)處理組，即對(duì)照組、高糖組（培養(yǎng)基葡萄糖質(zhì)量濃度為100 g/L）、對(duì)照組＋300 μmol/L槲皮素、高糖組＋300 μmol/L槲皮素。

1.3.2 釀酒酵母生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

表1 釀酒酵母S288c不同稀釋倍數(shù)OD600 nm值計(jì)算回歸方程Table1 Regression equations for OD600of Saccharomyces cerevisiae S288c at different dilution factors

將接入1∶100（V/V）接種量接入YPD培養(yǎng)基開(kāi)始計(jì)為0 h，以未接種的YPD液體培養(yǎng)基將紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)校正為零點(diǎn)，在波長(zhǎng)600 nm處分別測(cè)定培養(yǎng)0、2、4、6、8、12、14、16、18、20、22、24 h的酵母細(xì)胞懸液的OD600nm值，每份樣品測(cè)定3 次計(jì)算平均值。當(dāng)菌懸液菌體濃度過(guò)高時(shí)，為保證結(jié)果可靠性，對(duì)其進(jìn)行稀釋，控制OD600nm值介于0.1～0.8之間[10]，按照每個(gè)稀釋梯度對(duì)應(yīng)的回歸方程計(jì)算獲得OD600nm實(shí)際值（表1），x為稀釋后OD600nm值，y為OD600nm實(shí)際值。以各時(shí)間點(diǎn)菌懸液的OD600nm值為縱坐標(biāo)，培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，繪制酵母細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.3.3 酵母胞內(nèi)ROS水平測(cè)定

釀酒酵母胞內(nèi)R O S水平采用2’,7’-二氯熒光黃雙乙酸鹽（2’,7’-dichloro-dihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）法進(jìn)行測(cè)定。用未接種酵母細(xì)胞的YPD培養(yǎng)基稀釋DCFH-DA終濃度為10 μmol/L，細(xì)胞數(shù)量控制在1×106個(gè)/mL，置于培養(yǎng)箱內(nèi)37 ℃避光孵育20 min。孵育完成后用800 μL 磷酸緩沖液（50 mmol/L，pH 7.0）洗滌3 次，充分去除附著于細(xì)胞表面的DCFH-DA，收集 并重懸細(xì)胞，酶標(biāo)儀在激發(fā)波長(zhǎng)為488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為525 nm，檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度。

1.3.4 蛋白質(zhì)量濃度測(cè)定

采用Bradford法測(cè)定樣品中蛋白質(zhì)量濃度，用595 nm波長(zhǎng)條件下校正的牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)樣[11]。

1.3.5 酵母細(xì)胞內(nèi)酶比活力測(cè)定

取20 mL酵母細(xì)胞懸液（OD600nm為0.1）8 000×g離心5 min，收集酵母細(xì)胞并破碎，再10 000×g離心20 min，收集上清液即為粗提酶液，分別用于后續(xù)相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定，3 次重復(fù)。酶的比活力以每毫克蛋白質(zhì)所具有的酶活力表示。

SOD活力采用鄰苯三酚自氧化法測(cè)定，具體步驟參照許雅娟等[12]方法，在波長(zhǎng)325 nm處每隔0.5 min測(cè)定一次OD值，共測(cè)定4 min，計(jì)算出OD值變化速率。每分鐘反應(yīng)液中SOD抑制50%反應(yīng)速率時(shí)即為1 個(gè)SOD活力單位（U）。

CAT活力測(cè)定參照程魯京等[13]方法，采用鉬酸銨比色法測(cè)定，在波長(zhǎng)410 nm處測(cè)定OD值并計(jì)算酶活力，以每分鐘分解1 μmol過(guò)氧化氫為1 個(gè)酶活力單位（U）。

POD活力 參照劉艷[14]采用的愈創(chuàng)木酚法進(jìn)行測(cè)定，記錄在波長(zhǎng)470 nm處每分鐘內(nèi)的OD變化值，以每分鐘OD值變化0.01為1 個(gè)酶活力單位（U）。

1.3.6 酵母中糖代謝基因的表達(dá)量差異分析

采用RNAiso Plus試劑盒提取酵母細(xì)胞的總RNA。各取1 μg總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒對(duì)RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄后的cDNA保存于－20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

采用qRT-PCR方法分別對(duì)4 種不同條件處理的釀酒酵母細(xì)胞中GPD2、GUT2、SUC2和HXT1基因表達(dá)量的變化進(jìn)行了檢測(cè)，擴(kuò)增反應(yīng)體系含2 μL（約100 ng）模板cDNA，0.5 μL上下游引物（10 μmol/L），5 μL SYBR Green熒光染料，加ddH2O至10 μL。在qRTPCR儀進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，條件為95 ℃預(yù)變性3 min，40 個(gè)循環(huán)，95 ℃變性10 s，退火30 s（退火溫度根據(jù)引物確定，表2），65 ℃延伸5 s。反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)內(nèi)參基因ACT1計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量，采用3 次生物學(xué)重復(fù)和3 次技術(shù)重復(fù)，數(shù)據(jù)通過(guò)SPSS13.0軟件分析并進(jìn)行t檢驗(yàn)。

表2 qRT-PCR目的基因及引物序列Table2 Primers for target genes used for qRT-PCR in this study

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 高糖脅迫對(duì)釀酒酵母生長(zhǎng)的影響

圖1 不同葡萄糖質(zhì)量濃度處理下的釀酒酵母S288c生長(zhǎng)曲線Fig.1 Growth curve of S. cerevisiae S288c at different glucose concentrations

微生物生長(zhǎng)歷程一般分為延滯期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期4 個(gè)時(shí)期。圖1結(jié)果表明，不同質(zhì)量濃度葡萄糖處理的釀酒酵母主要經(jīng)歷了前3 個(gè)生長(zhǎng)階段，0～8 h為延滯期，在低糖質(zhì)量濃度（20、40、80 g/L）條件下8～16 h為對(duì)數(shù)期，16 h后趨于穩(wěn)定，而葡萄糖質(zhì)量濃度為100 g/L時(shí)，8～18 h為對(duì)數(shù)期，說(shuō)明葡萄糖質(zhì)量濃度對(duì)酵母生長(zhǎng)的延滯期影響較小，當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度為100 g/L時(shí)，酵母生 長(zhǎng)的對(duì)數(shù)期延長(zhǎng)，即進(jìn)入穩(wěn)定期的時(shí)間滯后，認(rèn)為對(duì)酵母生長(zhǎng)產(chǎn)生了高糖脅迫。因此，本研究以槲皮素作用8 h后的酵母細(xì)胞懸液（即釀酒酵母生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)期起始期）為不同實(shí)驗(yàn)處理起始臨界點(diǎn)，高糖脅迫的葡萄糖質(zhì)量濃度設(shè)為100 g/L。

2.2 槲皮素對(duì)釀酒酵母胞內(nèi)ROS水平的影響

圖2 高糖脅迫下槲皮素對(duì)釀酒酵母S288c胞內(nèi)ROS水平的影響Fig.2 Effects of quercetin on intracellular ROS levels of S. cerevisiae S288c under high glucose-induced stress

ROS具有很強(qiáng)的氧化活性，過(guò)量積累易造成細(xì)胞結(jié)構(gòu)的損傷，影響其正常的生理活性。槲皮素具有較強(qiáng)的抗氧化及自由基清除能力，且濃度為300 μmol/L時(shí)對(duì)釀酒酵母的保護(hù)作用最佳[4]。因此，本研究將在高糖脅迫條件下保護(hù)劑的槲皮素濃度設(shè)為300 μmol/L。圖2結(jié)果顯示，對(duì)照組與高糖組中胞內(nèi)ROS水平基本保持一致，無(wú)顯著差異（P＞0.05），而槲皮素處理后，對(duì)照組中胞內(nèi)ROS水平下降了12.88%（P＜0.05），而在高糖組中下降37.47%（P＜0.01），達(dá)到差異極顯著水平，說(shuō)明在進(jìn)入對(duì)數(shù)期之前，盡管高糖脅迫處理對(duì)胞內(nèi)ROS水平無(wú)顯著作用，卻能顯著降低尤其是高糖脅迫下胞內(nèi)ROS水平。因此，研究結(jié)果表明槲皮素具有很好的自由基清除能力，能顯著降低胞內(nèi)ROS水平，從而保護(hù)釀酒酵母免受自由基的損傷，維持機(jī)體正常生長(zhǎng)。

2.3 槲皮素對(duì)釀酒酵母胞內(nèi)抗氧化酶活性的影響

圖3 高糖脅迫下槲皮素對(duì)釀酒酵母S288c胞內(nèi)SOD比活力的影響Fig.3 Effects of quercetin on intracellular superoxide dismutase activity of S. cerevisiae S288c under high glucose-induced stress

圖4 高糖脅迫下槲皮素對(duì)釀酒酵母S288c胞內(nèi)CAT比活力的影響Fig.4 Effects of quercetin on intracellular catalase activity of S. cerevisiae S288c under high glucose-induced stress

在逆境條件下，SOD、CAT和POD通常是細(xì)胞抵御ROS傷害的重要保護(hù)酶，能及時(shí)清除氧自由基、過(guò)氧化氫、羥自由基等，從而保護(hù)機(jī)體免受傷害[15]。在高糖脅迫處理后，釀酒酵母胞內(nèi)SOD和CAT比活力變化趨勢(shì)比較一致，均明顯低于對(duì)照，下降率高達(dá)48.59%和43.41%，達(dá)到極顯著水平（P＜0.01）（圖3、4）。然而，槲皮素處理后，對(duì)照組與高糖組中SOD和CAT比活力仍然表現(xiàn)為明顯的下降趨勢(shì)，在對(duì)照組中SOD與CAT比活力下降率分別達(dá)到18.11%（P＜0.05）和32.43%（P＜0.01），在高糖組中，SOD與CAT比活力分別下降了75.89%（P＜ 0.01）和41.58%（P＜0.01），說(shuō)明在一定濃度范圍內(nèi)的高糖脅迫及槲皮素能顯著降低釀酒酵母胞內(nèi)SOD與CAT比活力。

圖5 高糖脅迫下槲皮素對(duì)釀酒酵母S288c胞內(nèi)POD比活力的影響Fig.5 Effects of quercetin on intracellular peroxidase activity of S. cerevisiae S288c under high glucose-induced stress

然而與對(duì)照相比，高糖脅迫處理后，POD比活力降低了44.82%，達(dá)到顯著差異水平（P＜0.05），但在槲皮素處理后，對(duì)照組與高糖組中POD比活力分別上升了106.71%和198.49%，達(dá)到極顯著差異水平（P＜0.01）（圖5），說(shuō)明槲皮素可通過(guò)調(diào)節(jié)POD比活力來(lái)響應(yīng)高糖脅迫的抗 氧化應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)而顯著提高機(jī)體的抗氧化能力。

2.4 釀酒酵母中GPD2、GUT1、SUC2和HXT1表達(dá)量的變化

圖6 高糖脅迫下槲皮素對(duì)釀酒酵母S288c中GPD2 GUT1 SUC2 HXT1基因表達(dá)的影響Fig.6 Effects of quercetin on the expression profiles of GPD2, GUT1, SUC2 and HXT1 in S. cerevisiae S288c under high glucose-induced stress

圖6結(jié)果顯示，與對(duì)照相比，槲皮素處理后的酵母中GPD2、GUT1、SUC2和HXT1的相對(duì)表達(dá)量均無(wú)顯著變化（P＞0.05），說(shuō)明在正常培養(yǎng)條件下，槲皮素對(duì)酵母中相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量影響較小。在高糖脅迫處理后，釀酒酵母S288c中GPD2和SUC2相對(duì)表達(dá)量顯著下調(diào)（P＜0.05），分別比對(duì)照降低了45.30%和51.30%（圖6），而HXT1表現(xiàn)為極顯著上調(diào)表達(dá)（P＜0.01），相對(duì)表達(dá)量比對(duì)照增加了7.54 倍，GUT1相對(duì)表達(dá)量卻無(wú)顯著變化（P＞0.05）；同時(shí)在槲皮素處理后，釀酒酵母S288c中GPD2、SUC2和HXT1的相對(duì)表達(dá)量均顯著升高（P＜0.05），相對(duì)表達(dá)量分別比高糖組增加了39.50%、1.40倍和38.30%，但GUT1的相對(duì)表達(dá)量始終無(wú)顯著變化（P＞0.05）。本研究結(jié)果表明高質(zhì)量濃度葡萄糖能顯著抑制GPD2和SUC2的表達(dá)，誘導(dǎo)HXT1的表達(dá)；同時(shí)，槲皮素可顯著提高釀酒酵母S288c中GPD2、SUC2和HXT1的表達(dá)水平，從而促進(jìn)酵母體內(nèi)葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)代謝和分解利用。

3 討 論

黃酮類化合物是一類重要的天然有機(jī)化合物，是植物在長(zhǎng)期自然選擇過(guò)程中產(chǎn)生的一類次生代謝產(chǎn)物，它能清除生物體內(nèi)的自由基，具有抗氧化作用而被廣泛關(guān)注[16]。其中，槲皮素被認(rèn)為是類黃酮物質(zhì)中最重要的一種天然抗氧化劑，屬于多羥基黃酮醇類化合物，廣泛存在于各種蔬菜、水果及中草藥中，其藥理作用主要表現(xiàn)在其抗氧化與自由基清除能力、抗炎、抗病毒等方面[5]。而在生物體中，抗氧化酶系統(tǒng)是有效清除ROS、維持細(xì)胞正常生理功能的第一道屏障，包括SOD、CAT和POD等保護(hù)酶系統(tǒng)均在清除自由基、過(guò)氧化氫和過(guò)氧化物及降低自由基的形成等方面發(fā)揮至關(guān)重要作用[17]。釀酒酵母是與人類關(guān)系最廣泛的一種酵母，其氧化應(yīng)激反應(yīng)的抗脅迫機(jī)制與多種代謝途徑相關(guān)，涉及眾多基因的參與調(diào)控[18]。當(dāng)機(jī)體受到高滲脅迫時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡系統(tǒng)被破壞，ROS、氮化物等內(nèi)源性氧化物大量積累從而對(duì)細(xì)胞形成傷害[3]。釀酒酵母在高鹽、高糖、高乙醇和氧化劑等脅迫后，胞內(nèi)ROS水平、SOD、CAT及POD比活力顯著提高[19]，說(shuō)明這些抗氧化物酶活性物質(zhì)對(duì)維持有機(jī)體胞內(nèi)正常滲透壓起到關(guān)鍵作用。本研究以釀酒酵母S288c為模型，在葡萄糖質(zhì)量濃度為100 g/L時(shí)，酵母生長(zhǎng)曲線的對(duì)數(shù)期延長(zhǎng)，說(shuō)明對(duì)酵母的生長(zhǎng)形成了高糖脅迫，且細(xì)胞內(nèi)的SOD、CAT和POD比活力卻受到顯著抑制，而胞內(nèi)的ROS水平差異不顯著；在槲皮素處理之后，釀酒酵母胞內(nèi)ROS水平降低，且SOD與CAT比活力受到抑制更加明顯，但極顯著提高了POD比活力。本研究結(jié)果顯示高質(zhì)量濃度（100 g/L）葡萄糖和槲皮素處理僅顯著提高了POD比活力，對(duì)ROS水平、SOD和CAT比活力起到抑制作用，說(shuō)明并未激活釀酒酵母胞內(nèi)所有的抗氧化系統(tǒng)應(yīng)激機(jī)制，釀酒酵母中POD的調(diào)節(jié)機(jī)制與ROS、SOD、CAT可能不同。另外，本研究結(jié)果說(shuō)明過(guò)氧化物酶活性對(duì)高糖耐受性更為靈敏，可作為衡量篩選及鑒定高糖脅迫應(yīng)激機(jī)制的重要生理指標(biāo)，而槲皮素主要作用在于通過(guò)調(diào)節(jié)胞內(nèi)過(guò)氧化物酶活性來(lái)提高機(jī)體的抗氧化能力。

在釀酒酵母中，葡萄糖可作為碳源，來(lái)維持其正常生長(zhǎng)代謝，主要參與了甘油與乙醇合成的糖代謝過(guò)程。研究認(rèn)為，在酵母中甘油的合成主要受胞內(nèi)高滲透甘油（high osmolarity glycerol，HOG）信號(hào)途徑中編碼3-磷酸甘油脫氫酶的GPD1、GPD2及甘油分解代謝途徑中編碼甘油激酶和FAD+-3-磷酸甘油脫氫酶的甘油利用的GUT1和GUT2的調(diào)控。GPD2在氧化還原代謝中起著至關(guān)重要的作用，GPD2過(guò)表達(dá)會(huì)提高細(xì)胞質(zhì)中NADH的氧化還原[20]。GUT1在發(fā)酵碳源（葡萄糖）和非發(fā)酵碳源（甘油、乙醇等）表達(dá)完全不同，在葡萄糖存在的條件下GUT1會(huì)受到抑制作用[21]。與GUT1相類似，一些基因的表達(dá)也會(huì)受到葡萄糖的影響而被抑制，主要包括GAL、SUC2、MAL和STA等基因[22]，其中，SUC2被認(rèn)為是編碼蔗糖轉(zhuǎn)化酶的重要基因，SUC2的過(guò)表達(dá)可促進(jìn)菊糖水解途徑中菊糖的水解與乙醇的合成，因此被認(rèn)為是分析葡萄糖抑制機(jī)理的一種理想基因分析模型[23]。另外，在糖代謝過(guò)程中，葡萄糖主要通過(guò)己糖代謝途徑被釀酒酵母細(xì)胞吸收和利用，而HXT1是該途徑中負(fù)責(zé)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)的重要基因，屬于HXT基因家族。目前，已有20多個(gè)HXT家族基因被成功克隆并完成功能鑒定[24]。當(dāng)HXT1表達(dá)上調(diào)時(shí)，釀酒酵母對(duì)葡萄糖的攝入利用加快，最終提高乙醇或乳酸的合成[25]。本研究結(jié)果表明，在高質(zhì)量濃度葡萄糖下，GPD2和SUC2的表達(dá)受到顯著抑制（P＜0.05），說(shuō)明高糖脅迫處理顯著影響了酵母細(xì)胞內(nèi)的HOG途徑與菊糖水解途徑，使甘油和乙醇形成受阻，導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)代謝失去平衡；同時(shí)，HXT1的表達(dá)水平顯著提高，說(shuō)明高糖脅迫可能會(huì)誘導(dǎo)己糖代謝途徑的發(fā)生。在槲皮素處理后，GPD2和SUC2的表達(dá)水平顯著提高（P＜0.05），說(shuō)明在高糖脅迫下，槲皮素在一定程度上緩解了高葡萄糖對(duì)HOG途徑的抑制作用，促進(jìn)了甘油的合成，同時(shí)槲皮素顯著提高了葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)，使機(jī)體內(nèi)菊糖的分解代謝加快，從而維持細(xì)胞正常的生長(zhǎng)代謝；另外，槲皮素極顯著提高HXT1的表達(dá)水平，說(shuō)明己糖代謝途徑可能是釀酒酵母攝取外源葡萄糖的重要代謝途徑，槲皮素通過(guò)促進(jìn)機(jī)體對(duì)葡萄糖的吸收利用，進(jìn)而維持機(jī)體內(nèi)與外界葡萄糖質(zhì)量濃度的平衡，保護(hù)細(xì)胞免受傷害。

因此，本研究以釀酒酵母S288c為分析模型，發(fā)現(xiàn)高糖脅迫與槲皮素處理后，釀酒酵母胞內(nèi)ROS水平、SOD和CAT比活力顯著降低，POD比活力顯著升高，說(shuō)明POD比活力對(duì)高糖耐受性及槲皮素處理后的反應(yīng)更為靈敏，可作為衡量高糖脅迫應(yīng)激機(jī)制的重要生理指標(biāo)；另外，在高糖脅迫后，槲皮素顯著提高了GPD2、SUC2和HXT1的表達(dá)水平，說(shuō)明槲皮素可以通過(guò)調(diào)控釀酒酵母中HOG途徑、菊糖水解途徑和己糖轉(zhuǎn)運(yùn)途徑來(lái)響應(yīng)高糖脅迫處理，從而保護(hù)釀酒酵母免受自由基的損傷、修復(fù)抗氧化系統(tǒng)和促進(jìn)機(jī)體內(nèi)的代謝平衡。本研究結(jié)果為槲皮素等天然抗氧化黃酮類化合物的開(kāi)發(fā)及其對(duì)酵母體內(nèi)高滲機(jī)理的分子機(jī)制研究提供一定的理論依據(jù)。

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Protective Effect and Mechanism of Quercetin against High Glucose-Induced Intracellular Damage in Saccharomyces cerevisiae

XU Xiaodan1, PAN Yu1, KE Zunli1, ZHOU Zhiqin1,2,*
(1. College of Horticulture and Landscape Architecture, Southwest University, Chongqing 400716, China; 2. Laboratory of Quality & Safety Risk Assessment for Citrus Products (Chongqing), Ministry of Agriculture, Citrus Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Chongqing 400715, China)

In this study, the protective effect of quercetin on high glucose-induced damage was investigated in Saccharomyces cerevisiae. Compared with the control group, the activities of superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), and peroxidase (POD) were all significantly decreased under high glucose-induced stress (P ＜ 0.05), but intracellular ROS was no obviously changed. After being treated with quercetin, the ROS levels and SOD and CAT activities were dramatically inhibited (P ＜ 0.05), but the POD activity was significantly enhanced in comparison to the control and high glucose groups (P ＜ 0.01). The results showed that POD activity was more sensitive than other indicators in reflecting the resistance to high glucose-induced stress, and quercetin could effectively enhance the antioxidant capacity by regulating POD activity in S. cerevisiae S288c. In addition, high glucose-induced stress resulted in an significant decrease in the expression levels of glycerol-3-phosphate dehydrogenase2 (GPD2) and sucrose transport protein-encoding genes (SUC2) (P ＜ 0.05), but a significant increase in the expression level of hexose transport-1-encoding gene (HXT1) (P ＜ 0.01), compared with the control. After being treated with quercetin, the expression profiles of GPD2, SUC2, and HXT1 were significantly increased in S. cerevisiae S288c (P ＜ 0.05). However, the expression level of glycerol kinase gene (GUT1) was not changed significantly. These results suggested that quercetin could reduce highglucose-induced damage by regulating the high osmolarity glycerol (HOG) signaling pathway, inulin catabolism pathway and hexose transport pathway to accelerate glucose decomposition. Therefore, we conclude that quercetin plays an important role in protecting S. cerevisiae from damage caused by high glucose-induced stress, and the underlying mechanism may be associated with its antioxidant effect and being involved in the HOG signaling pathway and the glucose decomposition and transport pathways in S. cerevisiae.

Saccharomyces cerevisiae; high glucose-induced stress; quercetin; enzyme activitity; expression levels

10.7506/spkx1002-6630-201712010

TS201.4

A

1002-6630（2017）12-0063-06

2016-09-13

重慶市基礎(chǔ)與前沿研究計(jì)劃項(xiàng)目（cstc2014jcyjA80026）；2016食用農(nóng)產(chǎn)品特征性營(yíng)養(yǎng)組成識(shí)別與驗(yàn)證評(píng)估專項(xiàng)項(xiàng)目（GJFP201601501；GJFP201601503）；重慶市現(xiàn)代特色效益農(nóng)業(yè)技術(shù)體系創(chuàng)新項(xiàng)目（20164-4）

徐曉丹（1990—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)楣窢I(yíng)養(yǎng)與質(zhì)量安全。E-mail：xuxiaodanxdd@163.com

*通信作者：周志欽（1964—），男，教授，博士，研究方向?yàn)楣窢I(yíng)養(yǎng)與質(zhì)量安全。E-mail：zzqswu@yahoo.com

徐曉丹, 潘宇, 柯尊麗, 等. 高糖脅迫下槲皮素對(duì)釀酒酵母胞內(nèi)損傷的保護(hù)作用與機(jī)制[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(12)：63-68.

10.7506/spkx1002-6630-201712010. http：//www.spkx.net.cn

XU Xiaodan, PAN Yu, KE Zunli, et al. Protective effect and mechanism of quercetin against high glucose-induced intracellular damage in Saccharomyces cerevisiae[J]. Food Science, 2017, 38(12)： 63-68. (in Chinese wit h English abstract) DOI：10.7506/ spkx1002-6630-201712010. http：//www.spkx.net.cn