管 笛，魏 穎，王 旗，李俊博，武會(huì)娟,*

（1.北京市理化分析測(cè)試中心，北京 100089；2.北京市基因測(cè)序與功能分析工程技術(shù)研究中心，北京 100089）

乳膠免疫層析法定量檢測(cè)豬尿液中的鹽酸克倫特羅

管 笛1,2，魏 穎1,2，王 旗1,2，李俊博1,2，武會(huì)娟1,2,*

（1.北京市理化分析測(cè)試中心，北京 100089；2.北京市基因測(cè)序與功能分析工程技術(shù)研究中心，北京 100089）

目的：建立以彩色乳膠微球?yàn)闃?biāo)記物的免疫層析技術(shù)檢測(cè)豬尿液中的鹽酸克倫特羅（clenbuterol，CLB）。方法：彩色乳膠微球標(biāo)記CLB抗體并真空冷凍干燥，鹽酸克倫特羅-牛血清白蛋白（CLB-bovine serum albumin，CLB-BSA）人工抗原與羊抗鼠抗體分別噴到硝酸纖維素膜上作檢測(cè)線和質(zhì)控線，豬尿液樣本與凍干微球混勻后，插入試紙條，通過(guò)讀條儀進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果：通過(guò)理化參數(shù)的優(yōu)化，吐溫-20為最優(yōu)表面活性劑，選用300 nm乳膠微球，層析時(shí)間為9 min。方法的檢出限為0.013 ng/mL，回收率范圍在97.8%～106.0%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差不高于9.6%。結(jié)論：本研究成功建立了一種靈敏、準(zhǔn)確的檢測(cè)豬尿液中CLB的彩色乳膠免疫層析方法。

免疫層析試紙；彩色乳膠；鹽酸克倫特羅；豬尿液；定量檢測(cè)

鹽酸克倫特羅（clenbuterol，CLB），瘦肉精的一種，是一種人工合成的β-腎上腺素受體激動(dòng)劑。在醫(yī)學(xué)和獸醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，因其具有加強(qiáng)心臟收縮、骨骼肌血管和支氣管平滑肌的擴(kuò)張的作用，常用于治療休克和支氣管痙攣[1]。當(dāng)大劑量使用CLB時(shí)，又具有能量重分配的作用，可顯著提高飼料轉(zhuǎn)化率和瘦肉率[2]。但是，CLB在動(dòng)物體內(nèi)具有殘留性積累和半衰期長(zhǎng)等藥理特性，且分布廣的特點(diǎn)。人們食用含有CLB殘留的肉品后，常常造成心動(dòng)過(guò)速、肌肉震顫、口干、頭暈、失眠甚至于癱瘓等中毒癥狀，對(duì)心臟病患者更有生命危險(xiǎn)[3-4]。我國(guó)農(nóng)業(yè)部發(fā)文明確禁止在飼料中添加CLB，并規(guī)定在動(dòng)物性食品中不得檢出CLB。

目前CLB的檢測(cè)方法主要有儀器分析法和免疫學(xué)分析法。儀器分析法主要包括氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[5-7]、高效液相色譜法[8-9]、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[10-13]、毛細(xì)管電泳法[14-15]。以上方法主要用于確證檢測(cè)，具有檢測(cè)靈敏度高、特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)；但是也存在檢測(cè)步驟復(fù)雜，依賴昂貴設(shè)備支撐和對(duì)人員操作要求高等缺點(diǎn)，不適用于市場(chǎng)現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)[16]。免疫學(xué)分析法包括酶聯(lián)免疫吸附法[17-21]、化學(xué)發(fā)光檢測(cè)法[22-23]和膠體金免疫層析方法[24-26]等。酶聯(lián)免疫吸附法和化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)靈敏度高，可用于定量分析，但檢測(cè)時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)（30 min以上），對(duì)操作者素質(zhì)要求較高，無(wú)法實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)[27]。膠體金免疫層析法具有檢測(cè)速度快（3～10 min）、成本低、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，適用于現(xiàn)場(chǎng)快速篩查；但該法目前多采用裸眼目測(cè)方式通過(guò)條帶顯色的有無(wú)進(jìn)行結(jié)果判讀，只能用于定性分析，存在檢測(cè)靈敏度不高、人為因素干擾大的缺點(diǎn)[28]。近年來(lái)，基于免疫層析讀數(shù)儀的試紙條定量檢測(cè)研究越來(lái)越多，在CLB檢測(cè)方面也有較多報(bào)道，用于定量檢測(cè)的標(biāo)記物主要為膠體金和熒光微球。彩色乳膠微球作為免疫層析技術(shù)的標(biāo)記物，與膠體金相比，成本更低且靈敏度更好。目前，主要應(yīng)用于疾病診斷領(lǐng)域，在食品安全領(lǐng)域應(yīng)用相對(duì)較少。本研究以彩色乳膠微球作為標(biāo)記物，建立定量檢測(cè)豬尿液中CLB的免疫層析技術(shù)，以期降低檢測(cè)成本，獲得更高檢測(cè)靈敏度。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

CLB標(biāo)準(zhǔn)品、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、吐溫-20、吐溫-80、Triton X-100、2-（N-嗎啡啉）乙磺酸（2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid monohydrate，MES）、1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亞胺鹽酸鹽（N-(3-dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimide hydrochloride crystalline，EDC）、羊抗鼠抗體 美國(guó)Sigma-Aldrich公司；乳膠微球 德國(guó)Merck公司；硝酸纖維素（nitrocellulose fi lter membrane，NC）膜 德國(guó)賽多利斯公司；N-羥基琥珀酰亞胺（N-hydroxysuccinimide，NHS） 美國(guó)Pierce公司；CLB單克隆抗體、CLB-BSA偶聯(lián)物 北京百歐美生科技有限公司；Tetronic 1307 上海杰一生物技術(shù)有限公司；氯化鉀、氯化鈉、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鈉國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；實(shí)驗(yàn)用水均為超純水。

SCAN-01試紙條讀條儀 北京百歐美生科技有限公司；XYZ3060點(diǎn)膜儀 美國(guó)BioDot公司；ZQ2000斬切機(jī) 上海金標(biāo)生物科技有限公司；THZ-C恒溫?fù)u床太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠。

1.2 方法

1.2.1 乳膠微球與抗體的偶聯(lián)

以p H 6.0、0.1 m o l/L的M E S溶液（稱取1.066 g MES，0.45 g NaCl溶于50 mL純水，調(diào)pH 6.0）作為活化緩沖溶液，取50 μL乳膠微粒溶液于2 mL離心管中，14 000 r/min離心7 min，棄去液體，加入300 μL活化緩沖溶液，旋渦振蕩器上混勻；14 000r/min離心7 min，棄去液體，重復(fù)洗滌2 遍后，向乳膠微粒中加入0.96 mg EDC、1.15 mg NHS和300 μL活化緩沖溶液，37 ℃、120 r/min搖床振蕩30 min；用活化緩沖溶液洗滌2 遍，除去未反應(yīng)的活化劑，并更換新的2 mL離心管。加入CLB單克隆抗體至活化緩沖液終體積為400 μL，37 ℃、120 r/min搖床振蕩2.5 h。

封閉加入100 μL的BSA溶液（BSA事先溶解在偶聯(lián)緩沖液中）至BSA終質(zhì)量濃度為5 mg/mL，對(duì)免疫乳膠微粒表面沒(méi)有偶聯(lián)抗體的活化基團(tuán)進(jìn)行封閉，并且通過(guò)BSA的物理吸附，封閉其他空間位點(diǎn)，降低在之后實(shí)驗(yàn)中可能發(fā)生的非特異性吸附。37 ℃、120 r/min搖床振蕩30 min。14 000 r/min離心7 min，棄去液體，用含0.5% BSA的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌兩次，加入400 μL 0.5% BSA的PBS，80%功率超聲振蕩4 min后，4 ℃保存待用。

1.2.2 試紙條噴制與乳膠微球凍干

采用點(diǎn)膜儀將CLB-BSA（抗原質(zhì)量濃度為1 mg/mL）以及羊抗鼠二抗（質(zhì)量濃度為2 mg/mL）以1 μL/cm的噴量分別噴涂至NC膜上作為檢測(cè)線（T線）與質(zhì)控線（C線），T線與C線的間隔為0.5 cm，37 ℃烘箱干燥過(guò)夜。將NC膜、樣品墊、吸水墊依次相互交錯(cuò)2 mm粘在含有不干膠的底板上得到試紙板，并用斬切機(jī)切割成寬度為4 mm的試紙條，置于含干燥劑的錫箔袋中密封，并于室溫條件保存?zhèn)溆谩?/p>

取上述偶聯(lián)好抗體的乳膠微球加入到凍干緩沖液中（含1% BSA、1%蔗糖、2%吐溫-20、0.1% Proclin 300的PBS，pH 7.0），渦旋混勻后，以100 μL/孔加到微孔條中。將微孔條放入－80 ℃冰箱中預(yù)冷2 h后放入真空冷凍干燥機(jī)中，真空凍干16 h。凍干后將微孔條扣蓋放入含干燥劑的錫箔袋中密封，并于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 豬尿液的測(cè)定

用移液器吸取100 μL豬尿液加入到含有凍干免疫乳膠微球的微孔中，反復(fù)吸打幾次直至乳膠微球與豬尿液充分混勻，將試紙條插入微孔中進(jìn)行層析，9 min后將試紙條放入讀條儀中進(jìn)行測(cè)定。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立與數(shù)據(jù)處理

取CLB標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行梯度稀釋，分別加入到含有凍干免疫乳膠微球的微孔中，充分混勻后，插條層析，9 min后將試紙條放入儀器中進(jìn)行測(cè)定，獲得T線和C線位置的光密度值，每個(gè)質(zhì)量濃度重復(fù)測(cè)定3 次。以CLB的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，T/（T+C）值為縱坐標(biāo)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果用非線性四參數(shù)邏輯斯蒂回歸擬合。

1.2.5 豬尿液樣品中CLB回收率的測(cè)定

以不同質(zhì)量濃度CLB添加于空白豬尿液樣品中，使豬尿液中CLB的質(zhì)量濃度分別為0.8、0.2 ng/mL和0.08 ng/mL。取上述豬尿液樣品加入凍干免疫乳膠微球的微孔中，充分混勻后，插條層析，9 min后將試紙條放入讀條儀中進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)質(zhì)量濃度試紙條重復(fù)測(cè)定5 次。1.2.6 與酶聯(lián)免疫吸附法的比較

利用本研究建立的彩色乳膠免疫層析法與酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定含不同質(zhì)量濃度的CLB尿樣20 份，計(jì)算結(jié)果，并比較兩種方法的相關(guān)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 表面活性劑的選擇

表面活性劑在免疫層析過(guò)程中起到不可忽視的重要作用，表面活性劑的物理化學(xué)性質(zhì)對(duì)免疫層析試紙條的親水性、層析速度、靈敏度、均一性和穩(wěn)定性等都有著重要的影響。本實(shí)驗(yàn)選取免疫層析研究中常用的表面活性劑：2%吐溫-20、2%吐溫-80、2% Triton X-100與20 mg/mL Tetronic 1307進(jìn)行優(yōu)化。在免疫乳膠微球?qū)游? min后，分別測(cè)定加入吐溫-20、吐溫-80、Triton X-100與Tetronic 1307表面活性劑的試紙條的T/（T+C）值。當(dāng)T/（T+C）值在0.5～1之間時(shí)，表明檢測(cè)線T值大于C值，相對(duì)于彩色乳膠免疫層析來(lái)說(shuō)就是檢測(cè)線的顏色要比質(zhì)控線的顏色更深。在測(cè)定空白樣品時(shí)要盡量選取T/（T+C）值大的為最優(yōu)，表明在此條件下，抗體抗原結(jié)合更充分。加入2% 吐溫-20、2% 吐溫-80、2% Triton X-100與20 mg/mL Tetronic 1307表面活性劑的試紙條的T/（T+C）值分別為0.66、0.55、0.63、0.36。由于加入2%吐溫-20的試紙條T/（T+C）值最大，因此實(shí)驗(yàn)選擇2% 吐溫-20為最優(yōu)表面活性劑。

2.2 抗體用量與微球大小優(yōu)化

本研究選取兩種不同粒徑的乳膠微球（300 nm和200 nm）各50 μL分別偶聯(lián)3 種不同質(zhì)量的CLB抗體（10、30 μg和50 μg）。以上6 種乳膠微球各取0.5 μL加入到微孔中，再補(bǔ)加100 μL凍干緩沖液后進(jìn)行真空冷凍干燥。干燥完成后，分別測(cè)定空白豬尿液（CLB為陰性的豬尿液樣品）和CLB質(zhì)量濃度為0.5 ng/mL的豬尿液，層析9 min后對(duì)試紙條進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 抗體與微球的優(yōu)化Table1 Optimization of antibody and latex beads

由表1可知，兩種不同粒徑的乳膠微球均隨著偶聯(lián)抗體量的增多，T/（T+C）值呈上升的趨勢(shì)。表明單位乳膠微球內(nèi)抗體量的增加，使得免疫乳膠微球與T線的結(jié)合能力增加。在空白豬尿液時(shí)，抗體量的增加，使得T線的顏色比C線的顏色要深的多。但是實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在偶聯(lián)抗體量為50 μg時(shí)，兩種粒徑的乳膠微球?qū)游龊笥捎谌槟z微球絕大部分與T線的包被抗原結(jié)合，使得C線的顏色非常淺，用裸眼很難辨別是否顯色，容易使檢測(cè)人員作出試紙條失效判斷，因此該質(zhì)量濃度不可取。在豬尿液中CLB質(zhì)量濃度為0.5 ng/mL時(shí)，偶聯(lián)抗體量為30 μg的兩種乳膠微球的T/（T+C）值在0.5左右，表明T線與C線顏色深淺差不多；偶聯(lián)抗體量為10 μg的兩種乳膠微球的T/（T+C）值分別為0.20和0.34，表明300 nm乳膠微球T線與C線顏色深淺差異最明顯，接近T線消線。從用裸眼初步定性檢測(cè)的角度考慮，偶聯(lián)10 μg抗體的300 nm乳膠微球優(yōu)勢(shì)明顯，更易于判斷。因此，綜合定性檢測(cè)和定量檢測(cè)兩方面的要求，選擇偶聯(lián)10 μg抗體的300 nm乳膠微球?yàn)樽顑?yōu)。

2.3 層析時(shí)間的確定

圖1 層析時(shí)間的影響Fig.1 Effect of chromatography time

層析時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，影響檢測(cè)的效率；層析時(shí)間過(guò)短，免疫反應(yīng)不夠充分，造成結(jié)果重復(fù)性差，不穩(wěn)定。本研究在免疫層析開始后，從1 min開始測(cè)定，每間隔2 min測(cè)定一次，到19 min結(jié)束。由圖1可知，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，T線和C線的光密度值逐漸增大，即顏色一直加深。表明免疫乳膠微球隨著層析液均勻的在試紙條上層析，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，層析到T線和C線的乳膠微球也隨之增加，因此光密度值一直升高。但是T/（T+C）值沒(méi)有隨著層析時(shí)間的延長(zhǎng)而一直增加，在層析反應(yīng)的一開始T/（T+C）值一直在增加，但在9 min以后一直到19 min，T/（T+C）值不再增加維持相對(duì)穩(wěn)定。因此選擇9 min為最佳層析反應(yīng)時(shí)間。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立與檢出限的確定

用空白豬尿液配制標(biāo)準(zhǔn)品溶液，標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度分別為1、0.5、0.17、0.056 ng/mL和0.019 ng/mL。將0.5 μL偶聯(lián)10 μg抗體的300 nm乳膠微球加入到微孔中，再補(bǔ)加100 μL凍干緩沖液后進(jìn)行真空冷凍干燥。干燥完成后，將標(biāo)準(zhǔn)品溶液加入微孔中混勻，插試紙條層析9 min后測(cè)定結(jié)果。標(biāo)準(zhǔn)曲線橫坐標(biāo)為CLB質(zhì)量濃度，縱坐標(biāo)為T/（T+C）值，標(biāo)準(zhǔn)曲線采用四參數(shù)邏輯斯蒂擬合。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：，線性范圍在0.062～1 ng/mL之間，r值為0.999。

取20 個(gè)空白豬尿液，采用彩色乳膠試紙條檢測(cè)，每個(gè)樣品重復(fù)檢測(cè)3 次，9 min后測(cè)定試紙條的T/（T+C）值。試紙條測(cè)定豬尿液的檢出限等于20 個(gè)陰性樣品測(cè)量的T/（T+C）平均值減去3 倍的標(biāo)準(zhǔn)偏差所對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度。通過(guò)測(cè)定該法豬尿液樣品的檢出限為0.013 ng/mL。

2.5 方法的特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

將彩色乳膠試紙條與其他常見(jiàn)的β-興奮劑化學(xué)藥物進(jìn)行交叉反應(yīng)的測(cè)定。在陰性尿樣中分別添加萊克多巴胺、沙丁胺醇、賽曼特羅、鹽酸特布他林和鹽酸環(huán)侖特羅5 種藥物，添加質(zhì)量濃度均為50 ng/mL，用本研究建立的方法定量檢測(cè)。結(jié)果測(cè)得的質(zhì)量濃度均小于0.013 ng/mL的檢出限，表明本研究建立的彩色乳膠免疫層析法與以上5 種藥物幾乎沒(méi)有交叉反應(yīng)，特異性良好。2.6 添加回收率測(cè)定結(jié)果

向空白豬尿液樣品中添加一定量的CLB標(biāo)準(zhǔn)品，使終質(zhì)量濃度為0.8、0.2 ng/mL和0.08 ng/mL。每個(gè)質(zhì)量濃度試紙條重復(fù)測(cè)定5 次，結(jié)果見(jiàn)表2，添加回收率范圍在97.8%～106.0%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在5.3%～9.6%之間。表明本實(shí)驗(yàn)建立的用于豬尿液中CLB定量檢測(cè)的彩色乳膠免疫層析法具有良好的精密度。

表2 CLB添加回收率測(cè)定Table2 Recoveries of CLB from spiked swine urine samples

2.7 方法的比較

利用彩色乳膠試紙條與酶聯(lián)免疫吸附試劑盒測(cè)定20 份不同質(zhì)量濃度的豬尿液樣品，兩種方法測(cè)得的結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性比較，結(jié)果見(jiàn)圖2。兩種方法測(cè)定結(jié)果相關(guān)性良好，相關(guān)性方程為y=0.981x－0.005，R2為0.982。

圖2 彩色乳膠試紙條與酶聯(lián)免疫吸附試劑盒測(cè)定方法的相關(guān)性Fig.2 Correlation between the proposed method in the study and enzymelinked immunoabsorbent assay (ELISA)

3 結(jié) 論

本研究中，實(shí)驗(yàn)將彩色乳膠微球最為標(biāo)記物并應(yīng)用于免疫層析檢測(cè)中，通過(guò)層析時(shí)間、微球粒徑、抗體用量和表面活性劑等參數(shù)的優(yōu)化，建立了能夠定量檢測(cè)豬尿液中CLB的免疫層析技術(shù)。該技術(shù)的檢出限為0.013 ng/mL，添加回收率范圍在97.8%～106.0%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在5.3%～9.6%之間。本研究建立的方法比文獻(xiàn)報(bào)道利用膠體金標(biāo)記物[29]（檢出限為0.22 ng/mL）和熒光硅球標(biāo)記物[30]（檢出限為0.28 ng/mL）的檢出限更低，更加靈敏。綜上，本研究成功建立了一種檢測(cè)豬尿液中CLB的彩色乳膠免疫層析方法。

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Development of Dyed Latex Bead-Based Immunochromatographic Assay for Quantitative Detection of Clenbuterol in Swine Urine

GUAN Di1,2, WEI Ying1,2, WANG Qi1,2, LI Junbo1,2, WU Huijuan1,2,*
(1. Beijing Center for Physical and Chemical Analysis, Beijing 100089, China; 2. Beijing Engineering Technique Research Center for Gene Sequencing & Function Analysis, Beijing 100089, China)

Objective： Aiming at the development of an immunochromatographic method based on dyed latex beads for the detection of clenbuterol (CLB) in swine urine. Methods： Dyed latex beads were conjugated with anti-CLB antibody and vacuum freeze-dried. CLB-bovine serum albumin (CLB-BSA) conjugate and goat anti-mouse IgG antibodies were coated onto nitrocellulose membranes to establish test and control lines, respectively. The test was carried out by placing swine urine into the sample well and mixed with dyed latex beads. After incubation, the optical density was measured by a microplate reader. Results： After optimizing the physical and chemical parameters, the best surfacant was Tween-20, 300 nm dyed latex beads were chosen, and the incubation time was9 minutes. The limit of detection (LOD) was 0.013 ng/mL. The recoveries from spiked swine urine varied from 97.8% to 106.0%, with relative standard deviation of less than 9.6%. Conclusion： A sensitive and accurate method for the detection of CLB was successfully developed in this paper.

immunochromatographic strip; dyed latex beads; clenbuterol; swine urine; quantitative detection

10.7506/spkx1002-6630-201712042

TS207.3

A

1002-6630（2017）12-0273-05

管笛, 魏穎, 王旗, 等. 乳膠免疫層析法定量檢測(cè)豬尿液中的鹽酸克倫特羅[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(12)： 273-277.

10.7506/spkx1002-6630-201712042. http：//www.spkx.net.cn

GUAN Di, WEI Ying, WANG Qi, et al. Development of dyed latex bead-based immunochromatographic assay for quantitative detection of clenbuterol in swine urine[J]. Food Science, 2017, 38(12)： 273-277. (in Chinese with English abstract) DOI：10.7506/ spkx1002-6630-201712042. http：//www.spkx.net.cn

2016-07-22

北京市優(yōu)秀人才項(xiàng)目（2014400685627G277）；北京市科學(xué)技術(shù)研究院青年骨干計(jì)劃項(xiàng)目（201415）

管笛（1983—），男，副研究員，博士，研究方向?yàn)榉治龌瘜W(xué)。E-mail：guandi@yeah.net

*通信作者：武會(huì)娟（1972—），女，研究員，博士，研究方向?yàn)榉肿由飳W(xué)。E-mail：sunnywhj@126.com