賀夢(mèng)雪，席 俊，皮江一

（河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院，河南 鄭州 450001）

響應(yīng)面法優(yōu)化β-伴大豆球蛋白超高靜壓處理?xiàng)l件的研究

賀夢(mèng)雪，席 俊*，皮江一

（河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院，河南 鄭州 450001）

β-伴大豆球蛋白是7S球蛋白的主要成分，是重要的大豆抗原蛋白。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上對(duì)超高靜壓處理壓強(qiáng)、處理時(shí)間、β-伴大豆球蛋白質(zhì)量濃度3個(gè)因素進(jìn)行研究，以β-伴大豆球蛋白抗原抑制率為響應(yīng)值，采用響應(yīng)面法優(yōu)化β-伴大豆球蛋白超高靜壓處理?xiàng)l件。結(jié)果表明：β-伴大豆球蛋白超高靜壓處理最佳條件為壓強(qiáng)455 MPa、時(shí)間18 min、蛋白質(zhì)量濃度15 mg/mL，在此條件下β-伴大豆球蛋白抗原性抑制率為49.59%。驗(yàn)證試驗(yàn)測(cè)得此條件下β-伴大豆球蛋白抗原抑制率為51.19%，標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.07%，說(shuō)明利用響應(yīng)面法分析結(jié)果可靠。

β-伴大豆球蛋白；超高靜壓；β-伴大豆球蛋白抗原性；響應(yīng)面

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2017-4-20 14:09:34

0 引言

大豆中蛋白質(zhì)含量約40%[1]，還富含不飽和脂肪酸、維生素和礦物質(zhì)[2]，具有極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，是食品加工工業(yè)中植物蛋白的主要來(lái)源之一。但同時(shí)，大豆也是八大食物過(guò)敏原之一，包含許多抗原蛋白[3-4]。這些抗原蛋白通過(guò)干擾營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，改變機(jī)體的正常新陳代謝，引發(fā)不良生理反應(yīng)，造成大豆過(guò)敏。大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白是大豆中的主要抗原蛋白，而且β-伴大豆球蛋白比大豆球蛋白的致敏性更強(qiáng)[5-6]，其3個(gè)亞基α'、α、β均存在過(guò)敏原性，能被超過(guò)25%的大豆過(guò)敏患者血清所識(shí)別，因此成為大豆脫敏的重要靶向蛋白[7]。

作為一種新型的非熱物理脫敏技術(shù)，超高靜壓主要通過(guò)改變蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)來(lái)影響其致敏性，對(duì)食品中的氨基酸、維生素和風(fēng)味物質(zhì)等小分子物質(zhì)無(wú)明顯影響，可以最大程度保持食物原有的風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)，已被廣泛地應(yīng)用于食品生產(chǎn)中。超高靜壓能有效地降低食物致敏性，目前研究主要集中在大豆蛋白及其副產(chǎn)品處理中。Wang等[8]研究了高壓（HP）處理對(duì)大豆蛋白分離物的一些物理化學(xué)和功能性質(zhì)的影響，并指出超高靜壓能引起大豆蛋白結(jié)構(gòu)伸展和變性，甚至引起蛋白的解聚或聚合。Li等[9-10]研究發(fā)現(xiàn)，超高靜壓處理能有效地改變嬰幼兒配方食品專用大豆分離蛋白的致敏性，影響其功能特性，包括持水能力、乳化活性指數(shù)、發(fā)泡能力和乳化穩(wěn)定性指數(shù)。Penas等[11]發(fā)現(xiàn)，大豆經(jīng)高壓（300 MPa,15 min）處理后再發(fā)芽，大豆芽的致敏性明顯降低，可以用于工業(yè)生產(chǎn)低過(guò)敏大豆芽。但是，超高靜壓處理對(duì)β-伴大豆球蛋白抗原性的影響鮮有報(bào)道，本研究對(duì)超高靜壓處理前后β-伴大豆球蛋白抗原性進(jìn)行分析，并對(duì)超高靜壓處理?xiàng)l件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化，確定對(duì)β-伴大豆球蛋白抗原性影響最大的超高靜壓條件，為定位超高靜壓導(dǎo)致β-伴大豆球蛋白致敏性降低的亞分子結(jié)構(gòu)提供理論依據(jù)，對(duì)探明超高靜壓降低β-伴大豆球蛋白致敏性的分子機(jī)制，正確指導(dǎo)安全食品的生產(chǎn)，防止食物過(guò)敏性疾病的發(fā)生有重大意義。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器設(shè)備

β-伴大豆球蛋白：實(shí)驗(yàn)室保存[12]；牛血清白蛋白（BSA）：Solarbio公司；兔抗β-伴大豆球蛋白血清：實(shí)驗(yàn)室保存；羊抗兔酶標(biāo)二抗（GaMIgG-HRP）：Solarbio公司；TMB單組分顯色液：Solarbio公司；其他試劑均為分析純或生化試劑。

BS-210-S型電子天平：德國(guó)Sartorius公司；無(wú)菌均質(zhì)袋：青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；PB-10型pH計(jì)：德國(guó)Sartorius公司；HPP-600 MPa/5L超高靜壓處理裝置：包頭科發(fā)高壓科技有限責(zé)任公司；LGJ-18C型冷凍干燥機(jī)：北京四環(huán)科學(xué)儀器廠；96孔聚苯乙烯板：美國(guó)Costar公司；Multiskan FC型酶標(biāo)儀：美國(guó)Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 超高靜壓處理

超高靜壓處理方法參照Li等[9]的方法。將β-伴大豆球蛋白按照不同的濃度用蒸餾水稀釋，置于無(wú)菌均質(zhì)袋中，封口抽真空。參數(shù)設(shè)置：處理腔溫度為23℃，升壓速率為250 MPa/min，卸壓速率為300 MPa/min。超高靜壓處理裝置預(yù)熱至所需溫度，將封閉好的均質(zhì)袋置于處理腔內(nèi)，升壓至所需壓強(qiáng)，到達(dá)保壓時(shí)間后機(jī)器自動(dòng)卸壓。

1.2.2 抗原性檢測(cè)

采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法檢測(cè)β-伴大豆球蛋白抗原性[13]。用β-伴大豆球蛋白包被96孔酶標(biāo)板（0.4 μg/mL，100 μL/孔，4℃過(guò)夜）。將超高靜壓處理樣品、未處理樣品蛋白及無(wú)蛋白競(jìng)爭(zhēng)樣品（1 μg/mL）與兔抗β-伴大豆球蛋白血清（1∶8 000）等體積混合，4℃過(guò)夜，進(jìn)行初級(jí)反應(yīng)。次日甩掉孔內(nèi)液體，用PBST溶液洗板4～6次。5%BSA封閉1～2 h后，洗板，拍干。加入抗原抗體混合液（100 μL/孔），37℃孵育1 h，洗板，拍干。加入羊抗兔IgGHRP酶標(biāo)記物，37℃孵育0.5 h，洗板，拍干。加入TMB單組分顯色液（100 μL/孔），37℃顯色10～15 min后，終止反應(yīng)。最后測(cè)定450 nm下各孔的OD值，抗原性大小按以下公式計(jì)算：

β-伴大豆球蛋白抗原抑制率（%）=（1-OD/OD0）×100，式中：OD表示被測(cè)樣品的吸光度值，OD0為無(wú)競(jìng)爭(zhēng)體系的吸光度值。β-伴大豆球蛋白抗原抑制率越低，則樣品中的β-伴大豆球蛋白抗原性越低[14]，超高靜壓處理效果越好。

1.2.3 單因素試驗(yàn)

1.2.3.1 超高靜壓處理壓強(qiáng)對(duì)β-伴大豆球蛋白抗原性的影響

將質(zhì)量濃度為10 mg/mL的β-伴大豆球蛋白，置于無(wú)菌均質(zhì)袋內(nèi)，分別在200、300、400、500 MPa壓力條件下處理15 min，檢測(cè)β-伴大豆球蛋白抗原抑制率。

1.2.3.2 超高靜壓處理時(shí)間對(duì)β-伴大豆球蛋白抗原性的影響

將質(zhì)量濃度為10 mg/mL的β-伴大豆球蛋白，置于無(wú)菌均質(zhì)袋內(nèi)，在300 MPa壓力條件下分別處理5、10、15、20 min，檢測(cè)β-伴大豆球蛋白抗原抑制率。

1.2.3.3 β-伴大豆球蛋白質(zhì)量濃度對(duì)其抗原性的影響

將質(zhì)量濃度為10、20、30、40 mg/mL的β-伴大豆球蛋白，置于無(wú)菌均質(zhì)袋內(nèi)，在300 MPa壓力條件下處理15 min，檢測(cè)β-伴大豆球蛋白抗原抑制率。

1.2.4 響應(yīng)面法對(duì)β-伴大豆球蛋白超高靜壓處理?xiàng)l件的優(yōu)化

根據(jù)響應(yīng)面中心組合設(shè)計(jì)理論（central composite experimental design principle）[15]，在單因素基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法在三因子三水平上對(duì)β-伴大豆球蛋白超高靜壓處理?xiàng)l件進(jìn)行優(yōu)化。試驗(yàn)因子和水平見表1。

表1 試驗(yàn)因子及水平Table 1 Experimental factors and levels

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 超高靜壓處理壓強(qiáng)對(duì)β-伴大豆球蛋白抗原性的影響

由圖1可知，β-伴大豆球蛋白經(jīng)過(guò)超高壓處理后，相對(duì)對(duì)照而言抗原性顯著下降，這可能是因?yàn)槌邏阂鸬鞍踪|(zhì)空間構(gòu)象的改變?cè)斐傻腫9]。在400 MPa之前隨著壓強(qiáng)的增大，β-伴大豆球蛋白抗原抑制率逐漸降低，即抗原性逐漸減弱，在400 MPa時(shí)抗原性下降幅度最大，因此，選擇超高靜壓處理壓強(qiáng)為400 MPa。過(guò)敏原結(jié)構(gòu)的變化往往導(dǎo)致抗原性的變化，在加工過(guò)程中過(guò)敏原表位可能受到一定程度的破壞，從而導(dǎo)致抗原性的變化。Messens等[16]認(rèn)為超高靜壓的壓強(qiáng)高于300 MPa時(shí)才能引起大豆蛋白結(jié)構(gòu)伸展和變性。Zhang等[17]在研究超高靜壓對(duì)β-伴大豆球蛋白構(gòu)象結(jié)構(gòu)影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)高壓（≥300 MPa）處理后巰基及氨基酸殘基數(shù)量均顯著增加。在Molina等[18]的研究中，400 MPa高壓處理下，7S球蛋白解聚為部分或全部變性的單體，使表面疏水性增加。在此基礎(chǔ)上，后續(xù)的試驗(yàn)主要研究超高靜壓對(duì)β-伴大豆球蛋白結(jié)構(gòu)的影響。

圖1 超高靜壓處理壓強(qiáng)對(duì)β-伴大豆球蛋白抗原性的影響Fig.1 Effect of HHP treatment pressure on antigenicity of β-conglycinin

2.1.2 超高靜壓處理時(shí)間對(duì)抗原性的影響

由圖2可知，超高靜壓處理時(shí)間在5～15 min時(shí)抗原性顯著下降，處理時(shí)間為15 min時(shí)，抗原性下降最為顯著，因此選擇超高靜壓處理時(shí)間為15 min。Li等[9]在研究超高靜壓對(duì)大豆分離蛋白致敏性的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，超高靜壓處理時(shí)間在5～15 min時(shí)致敏性顯著下降，處理時(shí)間為15 min時(shí)致敏性下降最為顯著，與此研究結(jié)果一致。

圖2 超高靜壓處理時(shí)間對(duì)β-伴大豆球蛋白抗原性的影響Fig.2 Effect of HHP treatment time on antigenicity of β-conglycinin

2.1.3 β-伴大豆球蛋白質(zhì)量濃度對(duì)其抗原性的影響

由圖3可知，β-伴大豆球蛋白質(zhì)量濃度從10 mg/mL到20 mg/mL遞變時(shí)，抗原抑制率有輕微的下降，濃度從20 mg/mL變化到40 mg/mL時(shí)抑制率變大，因此選擇蛋白質(zhì)量濃度為20 mg/mL。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果及方差分析

在單因素考察基礎(chǔ)上，應(yīng)用Design-Expert 8.0軟件以超高靜壓處理壓強(qiáng)（A）、超高靜壓處理時(shí)間（B）和β-伴大豆球蛋白質(zhì)量濃度（C）為自變量，以抗原抑制率（R）為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)三因素三水平響應(yīng)面分析試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見表2。

圖3 β-伴大豆球蛋白質(zhì)量濃度對(duì)抗原性的影響Fig.3 Effect of β-conglycinin concentration on antigenicity of β-conglycinin

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果Table 2 Design and results of Box-Behnken experiments

應(yīng)用Design-Expert 8.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果見表3。由表3可知，壓強(qiáng)和時(shí)間對(duì)抗原抑制率的影響顯著。3個(gè)因子經(jīng)過(guò)擬合得到的回歸方程為:Y=431.993 75-1.475 90A-7.722 75B-21.023 33C-1.29×10-3AB-3.975×10-3AC+0.580 50BC+1.844 58×10-3A2+0.200 523B2+3.973 33C2。

由表3方差分析結(jié)果可以看出，失擬項(xiàng) P=0.064 9（不顯著）說(shuō)明無(wú)其他因素能顯著影響本試驗(yàn)；模型的P值小于0.01（極顯著），方程的相關(guān)系數(shù)R2=0.974 3，說(shuō)明該方程擬合程度較好，可以模擬97.43%的超高靜壓β-伴大豆球蛋白抗原性的變化，各因素對(duì)抗原性的影響順序?yàn)椋築>A>C，即超高靜壓處理時(shí)間>超高靜壓處理壓強(qiáng)>β-伴大豆球蛋白質(zhì)量濃度。

表3 方差分析Table 3 Variance analysis of RSM

2.2.2 各因素交互作用的響應(yīng)面分析

根據(jù)回歸方程得出不同因素交互作用的響應(yīng)面3D圖見圖4。由圖4可以直觀地看出影響因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系，若曲線越陡峭，則該因素對(duì)抗原抑制率的影響越大。

圖4反映了各因素交互作用對(duì)β-伴大豆球蛋白的抗原抑制率的影響，可以看出：因素B（時(shí)間）對(duì)響應(yīng)值的影響最大，表現(xiàn)為曲線較陡；因素A（壓強(qiáng)）與因素C（蛋白質(zhì)量濃度）次之，表現(xiàn)為曲線較為平滑，且隨其數(shù)值的增大或減小，響應(yīng)值變化較小，這與方差分析中的結(jié)果一致。

圖4 各因素交互作用對(duì)β-伴大豆球蛋白抗原抑制率的影響Fig.4 The interactive effect of different factors on antigenicity of β-conglycinin

2.2.3 最優(yōu)工藝條件的確定

分析得到最小響應(yīng)值（R）時(shí)各因素對(duì)應(yīng)實(shí)際值分別為超高靜壓處理壓強(qiáng)454.95 MPa、時(shí)間18.05 min、蛋白質(zhì)量濃度15.5 mg/mL，此條件下抑制率為49.59%。為方便實(shí)際操作，以超高靜壓處理壓強(qiáng)455 MPa、超高靜壓處理時(shí)間18 min、β-伴大豆球蛋白質(zhì)量濃度15 mg/mL對(duì)β-伴大豆球蛋白的抗原抑制率進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。3次平行試驗(yàn)得到的實(shí)際抗原抑制率為51.19%，與理論值相差不大，且測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定，說(shuō)明利用響應(yīng)面法優(yōu)化β-伴大豆球蛋白超高靜壓處理?xiàng)l件參數(shù)真實(shí)可靠，具有實(shí)際意義。

3 結(jié)論

本文在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以響應(yīng)面法優(yōu)化β-伴大豆球蛋白超高靜壓處理?xiàng)l件。結(jié)果表明：超高靜壓處理壓強(qiáng)、超高靜壓處理時(shí)間、壓強(qiáng)的平方項(xiàng)、時(shí)間的平方項(xiàng)和質(zhì)量濃度的平方項(xiàng)對(duì)β-伴大豆球蛋白抗原抑制率的影響顯著。說(shuō)明超高靜壓處理壓強(qiáng)、處理時(shí)間和蛋白質(zhì)量濃度對(duì)抗原抑制率的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。

根據(jù)響應(yīng)面中心組合設(shè)計(jì)理論對(duì)β-伴大豆球蛋白超高靜壓處理?xiàng)l件進(jìn)行優(yōu)化的試驗(yàn)結(jié)果得出：超高靜壓處理時(shí)間對(duì)β-伴大豆球蛋白的抗原抑制率的影響最大，壓強(qiáng)次之，蛋白質(zhì)量濃度最小。

優(yōu)化結(jié)果得到β-伴大豆球蛋白超高靜壓處理的最佳條件為：超高靜壓處理壓強(qiáng)455 MPa、處理時(shí)間18 min、β-伴大豆球蛋白質(zhì)量濃度15 mg/mL，抗原抑制率實(shí)際為51.19%，相對(duì)誤差為3.23%。試驗(yàn)值與理論值相差不大，說(shuō)明該模型合理可靠。

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OPTIMIZATION OF HIGH HYDROSTATIC PRESSURE PARAMETERS FOR REDUCING ANTIGENICITY OF β-CONGLYCININ BY RESPONSE SURFACE METHODOLOGY

HE Mengxue，XI Jun，PI Jiangyi
（School of Food Science and Technology，Henan University of Technology，Zhengzhou 450001，China）

β-conglycinin is the major component of the globulin，and is an important soybean antigen protein. The present study was to investigate the optimal high hydrostatic pressure treatment parameters for reducing Antigenicity of β-conglycinin by response surface methodology.Based on the single-factor experiments，the effects of HHP treatment pressure，HHP treatment time and β-conglycinin concentration on the antigenicity of β-conglycinin were studied.The results showed that the optimal high hydrostatic pressure parameters process conditions were as follows：HHP treatment pressure of 455 MPa，HHP treatment time of 18 min and β-conglycinin concentration of 15 mg/mL.Under these conditions，the predicted and observed antigenicity inhibition rates of β-conglycinin were 49.59%and 51.19%，respectively.The standard deviation was 1.07%，which implied that the optimal conditions of HHP treatment obtained by response surface methodology was reliable.

β-conglycinin；high hydrostatic pressure（HHP）；antigenicity of β-conglycinin；response surface methodology

TS201.2

B

1673-2383(2017)02-0069-06

http://kns.cnki.net/kcms/detail/41.1378.N.20170420.1409.024.html

2016-08-30

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目 (31671778)；河南省高等學(xué)校重點(diǎn)科研項(xiàng)目(16A550001)

賀夢(mèng)雪（1992—），女，河南沁陽(yáng)人，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称钒踩c品質(zhì)控制。

*通信作者