李曉婷++宋佰芬++王歆桐++王夢(mèng)瑤++余崴++馬金柱++于立權(quán)++崔玉東

摘 要：禽病毒性疾病如禽傳染性法氏囊?。↖nfectious Bursal Disease，IBD）一直困擾著養(yǎng)禽業(yè)的健康、快速發(fā)展。在其他抗病毒感染的藥物效果不理想時(shí)，有必要應(yīng)用細(xì)胞因子制劑來(lái)改善機(jī)體免疫并提高抗病毒能力。已證明，雞白細(xì)胞介素18（Chicken interleukin-18，ChIL-18）和雞干擾素γ（Chicken interferon，ChIFN-γ）對(duì)多種病毒感染具有抑制作用。為了研究新型細(xì)胞因子制劑，該實(shí)驗(yàn)分析了雞白細(xì)胞介素18（Chicken interleukin-18，ChIL-18）和雞干擾素γ（Chicken interferon，ChIFN-γ）以及二者混合后的抗病毒機(jī)制。ChIL-18和ChIFN-γ蛋白注射雛雞后7d內(nèi)，應(yīng)用試劑盒檢測(cè)雛雞體內(nèi)血清中細(xì)胞因子的變化情況。利用雞外周血單核細(xì)胞分析ChIL-18和ChIFN-γ對(duì)細(xì)胞內(nèi)NO、幾種Toll樣受體（Toll-like receptors，TLR）及下游信號(hào)通路的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，混合組蛋白可刺激雛雞血清中產(chǎn)生高水平IL-6，IL-12，及IL-17?；旌辖M蛋白可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞中NO的分泌水平顯著升高，TLR 2、TLR 3、TLR 4和MHC-II的表達(dá)量升高，MAPK和NFκB信號(hào)通路被激活。綜上結(jié)果表明，ChIL-18和ChIFN-γ以及二者協(xié)同可誘導(dǎo)機(jī)體對(duì)病毒感染產(chǎn)生有效的防御作用，為新型細(xì)胞因子制劑的研究提供參考。

關(guān)鍵詞：雞白細(xì)胞介素18；雞干擾素γ；抗病毒；免疫調(diào)節(jié)

中圖分類(lèi)號(hào) S855.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2017）11-0040-07

Synergistic Antiviral Mechanism of Chicken IL-18 and IFN-γ

Li Xiaoting1 et al.

（1College of Animal Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319，China）

Abstract：The healthy and rapid development of poultry industry was troubled by avian viral diseases such as Infectious Bursal Disease（IBD）. With other anti-viral drug effect is not ideal，it is necessary to use cytokine preparations to improve the immune system and improve the anti-virus ability. Chicken interleukin-18 （ChIL-18）and chicken interferon gamma（ChIFN-γ）have been shown to inhibit a variety of viral infections. In order to study the novel cytokine preparations，the effects of ChIL-18 and ChIFN-γ and the two mixed antiviral mechanism was analyzed. The results of this laboratory had showed that ChIL-18 and ChIFN-γ can inhibit IBDV proliferation in chickens，especially with the mixed group，which indicates that the mixed group has better antiviral effect. Within 7 days after ChIL-18 and ChIFN-γ injection of chickens，the kit was used to detect the changes of cytokines in the chicks. The effects of ChIL-18 and ChIFN-γ on intracellular NO，several Toll-like receptors （TLR）and downstream signaling pathways were analyzed by using peripheral blood mononuclear cells of chickens. The results showed that the levels of IL-6，IL-12 and IL-17 in the serum stimulated by mixed group ware significantly different from those in the PBS group. Mixed group proteins could induce NO production，the expression levels of TLR2，TLR3，TLR4 and MHC-II were increased and MAPK and NFκB signaling were activated. These results indicated that the mixed group had a better theoretical basis for antiviral ability，ChIL-18 and ChIFN-γ，both of which could induce the body to produce effective defense against virus infection and provide reference for the study of new cytokine preparations.

Key words：Chicken interleukin 18；Chicken interferon γ；Antiviral；Immunoregulation

1957年，Isaacs和Lindenmann在研究流感病毒的干擾現(xiàn)象時(shí)發(fā)現(xiàn)了一種與病毒干擾作用有關(guān)的活性物質(zhì)，命名為干擾素（interferon，INF）[1]。1958年Nagano和KoJima報(bào)道了同樣的發(fā)現(xiàn)[2]，這也是第一個(gè)純化到同質(zhì)，克隆，測(cè)序完全的細(xì)胞因子，并以重組的形式生產(chǎn)并被廣泛的應(yīng)用于臨床[3]。IFN應(yīng)答在對(duì)病毒的先天免疫中起重要作用[4-5]。病毒入侵誘導(dǎo)許多細(xì)胞類(lèi)型產(chǎn)生IFN，并且IFN作用于鄰近的健康細(xì)胞以防止進(jìn)一步的病毒感染。IFN-γ是唯一的Ⅱ型干擾素，又被稱(chēng)為免疫型IFN[6]，主要由活化的T、B淋巴細(xì)胞和自然殺傷（Natural killer，NK）細(xì)胞產(chǎn)生，是緊密參與先天和獲得性免疫應(yīng)答的促炎性細(xì)胞因子[7]。IFN-γ可以有效的刺激NK細(xì)胞和巨噬細(xì)胞活化[8]，激活抗微生物和抗原呈遞功能，在抗胞內(nèi)病原體的宿主防御中起關(guān)鍵作用[9]。發(fā)生免疫應(yīng)答時(shí)，IFN-γ的循環(huán)擴(kuò)增可以快速警告相鄰細(xì)胞以及先天免疫系統(tǒng)的效應(yīng)細(xì)胞對(duì)抗可能的感染。IFN-γ可以廣泛的影響細(xì)胞程序[10]，也可以引起細(xì)胞表面Ⅰ類(lèi)和Ⅱ類(lèi)主要組織相容性復(fù)合體（Major histocompatibility complex，MHC）分子的表達(dá)增加[11]。IFN-γ具有較為嚴(yán)格的種屬特異性。

IL-18在1989年首次在小鼠腹腔內(nèi)注射內(nèi)毒素后從血清中分離，被描述為“IFN-γ誘導(dǎo)因子”。許多研究者得出結(jié)論，該血清因子是IL-12，直到1995年從小鼠肝臟純化和“IFN-γ誘導(dǎo)因子”的分子克隆，才更名為IL-18[12]。IL-18屬于IL-1家族的第四成員，由巨噬細(xì)胞，樹(shù)突細(xì)胞（DC），嗜中性粒細(xì)胞，脂肪細(xì)胞，枯否細(xì)胞，小膠質(zhì)細(xì)胞和大腦中的某些神經(jīng)元等多種細(xì)胞產(chǎn)生。這種細(xì)胞因子呈現(xiàn)許多獨(dú)特的生物學(xué)效應(yīng)，包括多效性、多功能性、免疫應(yīng)答和促炎作用[13-16]。IL-18與家族中的IL-1β相似，其分泌不通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體，然而，IL-18的生物學(xué)活性并不能用IL-1β來(lái)概括。自1995年以來(lái)，許多研究已經(jīng)使用內(nèi)源性IL-18或IL-18缺陷型小鼠來(lái)研究IL-18的多種生物學(xué)功能。已有研究表明IL-18可以刺激激活NK細(xì)胞[17]、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞[18]以及對(duì)癌細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的抑制作用[19]。

本實(shí)驗(yàn)為了進(jìn)一步研究IFN-γ和IL-18及二者的協(xié)同抗病毒活性與機(jī)制，對(duì)IFN-γ和IL-18及它們的協(xié)同免疫調(diào)節(jié)活性進(jìn)行了誘導(dǎo)細(xì)胞因子分泌、NO產(chǎn)生和TLR表達(dá)和通路激活的分析。本實(shí)驗(yàn)獲得的單一IFN-γ和IL-18蛋白將為產(chǎn)業(yè)開(kāi)發(fā)和臨床應(yīng)用奠定了一定的物質(zhì)基礎(chǔ)，對(duì)后續(xù)的應(yīng)用研究具有重要意義。在研究結(jié)果中，蛋白的協(xié)同作用具有較好的抗病毒效果，且具有較單一蛋白更好地免疫調(diào)節(jié)能力，為新型抗病毒的細(xì)胞因子制劑的開(kāi)發(fā)和利用奠定了夯實(shí)的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物 14日齡SPF（specific-pathogen-free）級(jí)三黃雞和9～11日齡雞胚購(gòu)自大慶興旺養(yǎng)殖場(chǎng)。

1.1.2 主要試驗(yàn)試劑 ChIL-18和ChIFN-γ為本實(shí)驗(yàn)室制備，GM-CSF和VGX（TLR-4抑制劑）購(gòu)自abcam公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Bio NEER公司；質(zhì)粒提取及DNA純化試劑盒購(gòu)自Axygen公司；白介素-2（IL-2），白介素-4（IL-4），白介素-6（IL-6），白介素-10（IL-10），白介素-12（IL-12），白介素-17（IL-17），腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ELISA）檢測(cè)試劑盒購(gòu)自云克隆有限公司，NO檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物處理 原核表達(dá)的ChIL-18和ChIFN-γ蛋白為本實(shí)驗(yàn)室前期制備，已證明這2種蛋白具有抗IBDV感染的作用（未發(fā)表）。14日齡SPF級(jí)三黃雞雛雞20只，自由采食及飲水。隨機(jī)分成4組，每組5只，注射制劑分為ChIL-18組、ChIFN-γ組、ChIL-18+ChIFN-γ的混合組及PBS組。給藥方式為腹腔注射。實(shí)驗(yàn)流程為：對(duì)14日齡雛雞分別以腹腔注射的方式進(jìn)行初次注射純化后的濃度為1mg/mL的重組蛋白，每只雛雞注射200μL，24h后進(jìn)行二次注射同樣水平的蛋白。具體實(shí)驗(yàn)方法見(jiàn)表1。分別在注射后1d、2d、3d、5d和7d檢測(cè)血清中細(xì)胞因子IL-2，IL-4，IL-6，IL-10，IL-12，IL-17的分泌水平。

表1 試驗(yàn)動(dòng)物分組

[組別 注射方式 數(shù)量（只） 14日齡

（mL/只） 15日齡

（mL/只） PBS 腹腔 5 0.2 0.2 IFN-γ 腹腔 5 0.2 0.2 IL-18 腹腔 5 0.2 0.2 IFN-γ+ IL-18 腹腔 5 0.2 0.2 ]

1.2.2 分離雛雞血清 對(duì)注射后雛雞靜脈采血，放于37℃恒溫培養(yǎng)箱中靜置1h，取出后放入4℃后3h，800g離心10min，吸取血清用于檢測(cè)細(xì)胞因子水平。

1.2.3 細(xì)胞因子檢測(cè) 檢測(cè)注射蛋白后雛雞血清中細(xì)胞因子的分泌情況。按照Gallus IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12和IL-17Precoated ELISA Kit操作步驟進(jìn)行檢測(cè)。使用前將試劑盒所提供的Washing buffer（30×）、Dilution buffer R（1×）、Precoated ELISA plate和TMB取出室溫平衡一段時(shí)間，所有試劑需充分混勻且避免在此過(guò)程中產(chǎn)生泡沫。

將血清轉(zhuǎn)入試劑盒所提供的預(yù)包被平板條內(nèi)，每孔50μL。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中需設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔及空白孔。每孔加入50μl稀釋后的Biotinylated antibody，輕輕振動(dòng)混勻，酶標(biāo)板上加封板膜，37℃溫箱孵育。60min后取出平板，傾倒孔內(nèi)液體并于無(wú)菌濾紙上拍干，每孔加入250μL1×Washing buffer，洗滌3次，每次5min。最后一次洗滌結(jié)束后于無(wú)菌濾紙上拍干，每孔加入100μL稀釋后的Streptavidin-HRP，加上覆膜，37℃溫箱孵育30min。取出平板后傾倒孔內(nèi)液體，再次用1×Washing buffer清洗平板5次，每次5min，最后一次洗滌結(jié)束后將平板拍干。加入TMB，37℃靜置避光顯色。約顯色8min后每孔加入Stop solution終止反應(yīng)。在加入Stop solution 10min內(nèi)測(cè)定平板內(nèi)各孔450nm波長(zhǎng)處的光密度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度及其對(duì)應(yīng)吸光度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)并計(jì)算其所對(duì)應(yīng)公式，依照公式計(jì)算血清中細(xì)胞因子含量。

1.2.4 檢測(cè)巨噬細(xì)胞中NO分泌 雞外周血單核細(xì)胞制備。用10mL無(wú)菌注射器抽取肝素（100μg/mL），濕潤(rùn)注射器管壁后推出，抽取成年三黃雞的翅根靜脈血5mL，按TBD的外周血淋巴細(xì)胞分離液的操作說(shuō)明分離出淋巴細(xì)胞。將細(xì)胞濃度調(diào)整為1.0×106cells/mL，轉(zhuǎn)移細(xì)胞到10cm細(xì)胞培養(yǎng)板中，37℃，5% CO2條件下培養(yǎng)4h，棄掉培養(yǎng)基，用37℃預(yù)熱的培養(yǎng)基清洗3遍，用胰酶將剩下的貼壁細(xì)胞消化下來(lái)，重新調(diào)整細(xì)胞濃度到1.0×106cells/mL，于24孔板中加入50ng/mL的GM-CSF繼續(xù)培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞密度到80%或90%單層融合狀態(tài)時(shí)，用無(wú)血清培養(yǎng)基終止培養(yǎng)12h，給予不同的蛋白組刺激。蛋白刺激24h后取出細(xì)胞培養(yǎng)皿，取細(xì)胞培養(yǎng)上清液400μL，按照試劑盒中的方法檢測(cè)上清液中NO的含量。

1.2.5 TLR信號(hào)通路分析 提取的巨噬細(xì)胞中加入不同組蛋白刺激培養(yǎng)24h后收集細(xì)胞按2.2.2中的方法提取細(xì)胞總RNA，按2.2.9.3中的方法對(duì)TLR-2、TLR-3、TLR-4、TLR-5、TLR-7、TLR-9、MHC-I和MHC-II的mRNA水平進(jìn)行鑒定。對(duì)蛋白刺激后的巨噬細(xì)胞提取胞內(nèi)蛋白質(zhì)，利用western-blot方法檢測(cè)巨噬細(xì)胞中MAPK和NFκB信號(hào)通路中p38和p65的表達(dá)情況以及其他幾種關(guān)鍵蛋白的表達(dá)水平。在24孔培養(yǎng)皿中的巨噬細(xì)胞中加入蛋白刺激24h后同時(shí)加入TLR-4抑制劑（VGX）和1×TCID50的IBDV，用無(wú)血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)直至陽(yáng)性孔完全病變，觀(guān)察實(shí)驗(yàn)細(xì)胞孔中細(xì)胞的病變情況，利用qRT-PCR的方法定量檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中病毒的復(fù)制水平。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 所有的數(shù)據(jù)進(jìn)行生物統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用SPSS軟件進(jìn)行單因素方差分析，*表示P<0.05為差異顯著，**表示P<0.01為差異極顯著有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組蛋白體內(nèi)刺激血液中細(xì)胞因子檢測(cè) 使用純化后的ChIL-18和ChIFN-γ蛋白以腹腔注射方式接種雛雞，加強(qiáng)注射1天后開(kāi)始分離雛雞外周血血清。雛雞血清中細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果。如圖1所示，與PBS組相比，ChIL-18+ChIFN-γ混合蛋白注射后，血清中IL-2的分泌水平有所增加，到第3天之后，細(xì)胞因子水平逐漸下降。IL-4的分泌在第1天開(kāi)始升高，知道7d仍然高于PBS組，3個(gè)蛋白組都能明顯地升高其分泌水平。在蛋白注射后，IL-6的分泌水平逐漸升高，并在第7天達(dá)到高峰，ChIL-18+ChIFN-γ混合蛋白組可以更有效地刺激IL-6的分泌。與PBS組相比，混合組蛋白雖然可以增加IL-10的分泌，但增加的量不高，整體分泌水平都很低。在檢測(cè)的第2天，IL-12的分泌水平明顯升高，之后逐漸下降恢復(fù)正常水平，ChIL-18+ChIFN-γ混合蛋白組的刺激分泌效果相對(duì)較好，其他兩組與PBS沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。蛋白組可以刺激IL-17，且在檢測(cè)的第1天開(kāi)始分泌，之后逐漸下降，但仍然可以在幾天內(nèi)持續(xù)較高的分泌水平。綜上，注射蛋白后血清中的IL-4、IL-6、IL-12和IL-17能顯著分泌，其中IL-2，IL-10和IL-12的分泌水平較其他組低，證明蛋白刺激可以在體內(nèi)引起較強(qiáng)的細(xì)胞免疫，而在使用PBS刺激的情況下，這幾種細(xì)胞因子的分泌不明顯。結(jié)果說(shuō)明ChIL-18和ChIFN-γ蛋白刺激幾種細(xì)胞因子分泌具有特異性。

[IL-2pg（mL）][IL-4pg（mL）][IL-6pg（mL）][IL-10pg（mL）][IL-12pg（mL）][IL-17pg（mL）]

圖1 注射蛋白后血清中細(xì)胞因子水平

2.2 蛋白誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO 以雞外周血單核細(xì)胞制備的巨噬細(xì)胞為研究對(duì)象，分析蛋白對(duì)NO產(chǎn)生的影響。加入ChIL-18、ChIFN-γ、ChIL-18和ChIFN-γ蛋白及PBS刺激巨噬細(xì)胞24h，利用試劑盒檢測(cè)細(xì)胞上清中NO的含量，結(jié)果如圖2所示。與PBS組相比較，ChIL-18和ChIFN-γ蛋白明顯刺激細(xì)胞產(chǎn)生更多的NO，混合蛋白刺激細(xì)胞產(chǎn)生NO相比于ChIL-18組具有明顯差異，而相比于ChIFN-γ組沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)果表明混合組蛋白能夠更有效地刺激NO的產(chǎn)生，從而使細(xì)胞具有更好地抗感染的微環(huán)境。

[NO（μmol/L）]

圖2 蛋白刺激后巨噬細(xì)胞中NO水平的檢測(cè)

2.3 蛋白激活巨噬細(xì)胞中信號(hào)通路 在巨噬細(xì)胞中加入ChIL-18、ChIFN-γ、ChIL-18+ChIFN-γ和PBS 4組刺激物，繼續(xù)培養(yǎng)24h后收集細(xì)胞提取細(xì)胞總RNA，并對(duì)TLR-2、TLR-3、TLR-4、TLR-5、TLR-7、TLR-9、MHC-I和MHC-II的mRNA水平進(jìn)行鑒定，結(jié)果如圖3所示。ChIL-18和ChIFN-γ混合蛋白組刺激后TLR-2、TLR-3、TLR-4和MHC-II的轉(zhuǎn)錄水平升高。表明混合蛋白激活了巨噬細(xì)胞中這幾種TLR的信號(hào)，使細(xì)胞具有更強(qiáng)的抗感染能力?；旌系鞍滋岣進(jìn)HC-II的轉(zhuǎn)錄水平表明混合蛋白可以更好地激活CD4+細(xì)胞免疫應(yīng)答。

圖3 蛋白刺激后巨噬細(xì)胞中TLR和MHC的表達(dá)情況分析

利用western-blot方法檢測(cè)MAPK和NFκB信號(hào)通路中幾種關(guān)鍵蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果如圖4所示。蛋白刺激后4～24h檢測(cè)p38和p65的表達(dá)，結(jié)果與PBS相比，3組蛋白都能夠刺激p38和p65蛋白的表達(dá)升高，而ChIL-18+ ChIFN-γ混合蛋白組中蛋白的水平更高，而且蛋白高表達(dá)時(shí)間延長(zhǎng)。ChIL-18+ChIFN-γ混合蛋白同樣能刺激通路中其他幾種關(guān)鍵蛋白的表達(dá)量升高，IκBα降解量增多。表明混合蛋白可以更強(qiáng)烈地激活MAPK和NFκB信號(hào)通路并延長(zhǎng)通路活化時(shí)間。

圖4 Western-Blot方法檢測(cè)巨噬細(xì)胞中蛋白水平

在24孔培養(yǎng)皿中的巨噬細(xì)胞中加入蛋白刺激24h后同時(shí)加入TLR-4抑制劑和1×TCID50的IBDV，用無(wú)血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)直至陽(yáng)性孔出現(xiàn)完全病變，觀(guān)察實(shí)驗(yàn)細(xì)胞孔中細(xì)胞的病變情況，結(jié)果如圖5所示。在加入VGX之后蛋白組巨噬細(xì)胞仍會(huì)發(fā)生與PBS組相似的死亡和溶解，表明蛋白并不能抑制病毒感染引起的細(xì)胞病變和死亡。qRT-PCR定量分析蛋白組在加入VGX之后細(xì)胞培養(yǎng)液中的IBDV含量沒(méi)有減少。說(shuō)明TLR-4信號(hào)對(duì)蛋白發(fā)揮的抗病毒感染的能力具有至關(guān)重要的作用。

圖6 蛋白不能抑制巨噬細(xì)胞加入VGX后對(duì)病毒的感染

3 討論

本研究使用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)出的ChIFN-γ和ChIL-18注射到14日齡雛雞體內(nèi)，1d后進(jìn)行二次注射，對(duì)注射后7d內(nèi)的幾種細(xì)胞因子進(jìn)行體內(nèi)分析，檢測(cè)的細(xì)胞因子包括IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12和IL-17?；旌辖M蛋白能明顯提高幾種細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄水平。作為T(mén)h1型細(xì)胞免疫的主要效應(yīng)分子，IFN-γ可以自動(dòng)擴(kuò)增Th1應(yīng)答并交叉調(diào)節(jié)其他Th型[20]，IL-18不僅誘導(dǎo)IFN-γ產(chǎn)生，也在增強(qiáng)Th1反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[21]，本研究結(jié)果中混合組蛋白注射后在血清中檢測(cè)到更高水平的IL-12。與Qiao Y等的研究一致，IFN-γ可以增加IL-12的表達(dá)[22]，也有報(bào)道表明，IL-18不能誘導(dǎo)IL-12的產(chǎn)生[23]，可能是由于實(shí)驗(yàn)的條件不同，所以出現(xiàn)不一樣的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)表明，混合組蛋白可以提高IL-4、IL-10和IL-6的水平，已知IFN-γ對(duì)Th2和Treg免疫反應(yīng)具有抑制作用，對(duì)促炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生具有促進(jìn)作用，而IL-18可以通過(guò)CD14+單核細(xì)胞誘導(dǎo)IL-10產(chǎn)生[23]，IL-18還誘導(dǎo)NK細(xì)胞，肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞產(chǎn)生IL-4[24]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果中IFN-γ和IL-18組及混合組蛋白誘導(dǎo)強(qiáng)烈的IL-17分泌，Th17細(xì)胞的分化被IL-6、IL-1、TGF-β和IL-21所驅(qū)動(dòng)，IL-1β和IL-18在內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和炎癥條件下促進(jìn)Th17細(xì)胞分化[25]，本實(shí)驗(yàn)中IFN-γ和IL-18明顯增加IL-6的表達(dá)，但由于實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)缺陷沒(méi)有檢測(cè)TGF-β的水平。以上結(jié)果說(shuō)明IFN-γ和IL-18蛋白注射后會(huì)引起機(jī)體強(qiáng)烈的細(xì)胞免疫應(yīng)答，使機(jī)體具有較強(qiáng)的抗病毒內(nèi)環(huán)境。

巨噬細(xì)胞是對(duì)宿主防御具有重要作用的先天免疫細(xì)胞，可以產(chǎn)生介導(dǎo)宿主防御的多種促炎性細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子的基因表達(dá)強(qiáng)烈地受到TLR等模式識(shí)別受體與各種內(nèi)源性炎癥因子所調(diào)節(jié)。所以本實(shí)驗(yàn)利用雞外周血巨噬細(xì)胞研究蛋白對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生NO的能力以及對(duì)TLR信號(hào)通路的影響進(jìn)行鑒定及分析。結(jié)果表明混合組蛋白可以明顯提高巨噬細(xì)胞培養(yǎng)液中NO的含量，與Schroder K等的研究一致，IFN-γ可以提高巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO的水平[9]，IL-18也可以通過(guò)促使巨噬細(xì)胞表面受體和IL-10的表達(dá)而間接誘導(dǎo)NO產(chǎn)生[26]。在TLR家族中，TLR-3、TLR-7、TLR-8和TLR-9位于細(xì)胞內(nèi)區(qū)域，識(shí)別病毒核酸種類(lèi)；TLR-1、TLR-2、TLR-4、TLR-5和TLR-6位于細(xì)胞表面，主要識(shí)別細(xì)菌細(xì)胞壁成分，TLR-2和TLR-4還能識(shí)別病毒結(jié)構(gòu)蛋白。本實(shí)驗(yàn)利用qRT-PCR的方法對(duì)幾種TLR和MHC分子進(jìn)行轉(zhuǎn)錄分析，結(jié)果TLR-2、TLR-3和TLR-4的轉(zhuǎn)錄水平升高；TLR-5、TLR-7和TLR-9的轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]有變化。IFN-γ刺激誘導(dǎo)細(xì)胞表面TLR-2和TLR-4蛋白的表達(dá)[27]。IFN-γ可以上調(diào)巨噬細(xì)胞中TLR-9的表達(dá)，但本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中TLR-9沒(méi)有變化，可能是因?yàn)樵贕M-CSF的存在下抑制了TLR-9的轉(zhuǎn)錄[28]。IL-18可以增加CD14+單核細(xì)胞中TLR-4的表達(dá)，而對(duì)TLR-2的表達(dá)沒(méi)有影響[23]。另一方面，Radstake等的研究表明在患有類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的滑膜組織中表達(dá)TLR-2和TLR-4與IL-18的水平相關(guān)[29]。當(dāng)IL-18處理PBMC時(shí)，同樣會(huì)觀(guān)察到TLR-2和TLR-4的上調(diào)。IFN-γ發(fā)揮抗病毒作用，在抗原呈遞細(xì)胞中誘導(dǎo)MHC-II類(lèi)分析的表達(dá)和運(yùn)輸，并影響吞噬作用和微管形成[30]。混合組蛋白刺激巨噬細(xì)胞會(huì)引起MHC-II類(lèi)分子的轉(zhuǎn)錄水平明顯升高，而MHC-I類(lèi)分子沒(méi)有明顯變化。這些結(jié)果表明蛋白刺激巨噬細(xì)胞可以改變細(xì)胞內(nèi)效應(yīng)分子的表達(dá)，使細(xì)胞具有更好的抗感染能力。

IFN-γ和IL-18刺激也影響TLR誘導(dǎo)的MAPK和NFκB信號(hào)通路的活化。本實(shí)驗(yàn)中巨噬細(xì)胞在蛋白刺激24小時(shí)內(nèi)利用western-blot分析表明，混合組蛋白可以明顯升高p38和p65的表達(dá)水平，IFN-γ和IL-18混合組蛋白刺激p38和p65表達(dá)升高都持續(xù)24h，表明混合蛋白可以激活MAPK和NFκB信號(hào)通路并使通路的激活狀態(tài)延長(zhǎng)。之后對(duì)MAPK和NFκB信號(hào)通路中幾種關(guān)鍵蛋白進(jìn)行表達(dá)分析。IκBα作為NFκB的抑制劑，二者具有拮抗作用，通過(guò)檢測(cè)IκBα的降解來(lái)反向證明NFκB的激活；細(xì)胞對(duì)趨化因子的反應(yīng)性可以通過(guò)調(diào)節(jié)信號(hào)分子JNK來(lái)觀(guān)察；轉(zhuǎn)錄因子STAT1是IFN-γ應(yīng)答的關(guān)鍵介質(zhì)，可以增加組蛋白乙?；筎LR下游多種促炎性細(xì)胞因子基因的表達(dá)增加；C/EBPβ作為T(mén)LR誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子，可以促進(jìn)其他轉(zhuǎn)錄因子的募集和促炎性細(xì)胞因子基因的轉(zhuǎn)錄。當(dāng)JNK、STAT1和C/EBPβ的表達(dá)上調(diào)時(shí)，表明蛋白可以促進(jìn)多種細(xì)胞因子的產(chǎn)生。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與之前的報(bào)道一致，IFN-γ和IL-18刺激可以引起NFκB抑制劑IκBα的快速降解[31]，JNK在受蛋白刺激的細(xì)胞中普遍存在，而在IFN-γ和混合組蛋白刺激的細(xì)胞中磷酸化的JNK水平較高，STAT1被IFN-γ刺激所激活，有研究表明在IFN-γ預(yù)處理的巨噬細(xì)胞中C/EBPβ的募集也增強(qiáng)[22]，與其一致，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中IFN-γ和混合組蛋白能明顯提高巨噬細(xì)胞中C/EBPβ的表達(dá)。以上結(jié)果表明IFN-γ和IL-18刺激巨噬細(xì)胞可以誘導(dǎo)TLR介導(dǎo)的MAPK和NFκB信號(hào)通路的激活，促進(jìn)其他轉(zhuǎn)錄因子和炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，并使細(xì)胞更敏感。在巨噬細(xì)胞中加入蛋白24h后同時(shí)加入TLR-4抑制劑和IBDV，結(jié)果在加入抑制劑之后，巨噬細(xì)胞的抗病毒能力明顯下降，表明TLR-4信號(hào)對(duì)巨噬細(xì)胞的抗病毒活性具有重要作用。綜上所述，IFN-γ和IL-18都可以誘導(dǎo)機(jī)體和細(xì)胞產(chǎn)生抗病毒能力，但二者的協(xié)同作用效果優(yōu)于單一蛋白，為后續(xù)的抗病毒機(jī)制的研究打下夯實(shí)基礎(chǔ)。

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（責(zé)編：張宏民）