韓 穎，吳正升，吳 強

乳腺癌新輔助化療前后p62和XIAP表達(dá)的變化及其意義

韓 穎，吳正升，吳 強

目的 探討乳腺癌新輔助化療(neoadjuvant chemotherapy, NCT)前后自噬的變化及其與XIAP變化的關(guān)系。方法 應(yīng)用免疫組化EnVision兩步法檢測NCT前后94對乳腺癌組織中p62和XIAP的表達(dá)，觀察NCT后p62和XIAP表達(dá)的變化情況，分析其相關(guān)性。結(jié)果 NCT前乳腺癌標(biāo)本中，p62高表達(dá)率為51.1%(48/94)，XIAP高表達(dá)率為84.0%(79/94)；NCT后乳腺癌標(biāo)本中，p62高表達(dá)率升高為81.9%(77/94)，XIAP高表達(dá)率降低為35.1%(33/94)。即NCT后p62高表達(dá)率明顯升高，XIAP高表達(dá)率明顯降低(P均<0.05)。NCT前后相比，p62表達(dá)升高的樣本率為73.4%，XIAP表達(dá)下降的樣本率為75.5%，且p62表達(dá)變化與XIAP表達(dá)變化呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)。結(jié)論 乳腺癌NCT后自噬增強與XIAP下調(diào)共存，且XIAP可能參與NCT后自噬增強的負(fù)性調(diào)節(jié)。

乳腺腫瘤；新輔助化療；自噬；凋亡；p62；XIAP

乳腺癌是我國女性最常見的惡性腫瘤，且發(fā)病率逐年上升，已嚴(yán)重威脅我國婦女身心健康。新輔助化療(neoadjuvant chemotherapy, NCT)是目前治療局部晚期乳腺癌的標(biāo)準(zhǔn)方案之一，能使局部晚期乳腺癌降期，提高手術(shù)切除率和保乳率，并且利于了解腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性[1]。研究表明抗癌療法(如化療、放療、內(nèi)分泌治療)可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自噬，并且其是腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生抗藥性的機制之一[2-3]。自噬是依賴溶酶體途徑對細(xì)胞內(nèi)受損的細(xì)胞器和大分子物質(zhì)進行降解的過程，p62是自噬的標(biāo)志性蛋白，其表達(dá)量可用于監(jiān)測自噬。XIAP是凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein, IAP)家族中最受關(guān)注的成員，在腫瘤的進展、復(fù)發(fā)、預(yù)后以及腫瘤的化療耐藥中發(fā)揮重要作用[4-5]。目前，關(guān)于乳腺癌NCT后p62和XIAP表達(dá)的變化及其是否存在一定相關(guān)性尚未見報道。本文采用免疫組化EnVision兩步法檢測NCT前后p62和XIAP表達(dá)的變化，分析其相關(guān)性，探討其可能的分子機制及生物學(xué)意義。

1 材料與方法

1.1 材料 收集2010～2014年安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科存檔的94對乳腺癌石蠟標(biāo)本，所有患者術(shù)前均經(jīng)空心針穿刺證實為乳腺浸潤性癌，并進行2～6個周期的NCT后行乳腺改良根治。依據(jù)WHO(2012)乳腺腫瘤標(biāo)準(zhǔn)對所有病例進行病理學(xué)分型、分級和分期。

1.2 試劑 兔抗人多克隆抗體p62和單克隆抗體XIAP購自Cell Signaling公司，稀釋度分別為1 ∶500和1 ∶100，通用型EnVision兩步法免疫組化試劑盒和DAB顯色劑均購自北京中杉金橋公司。

1.3 方法 組織均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片，HE染色和免疫組化EnVision兩步法染色。65 ℃烤片2 h，脫蠟、水化，高壓修復(fù)100 s，自然冷卻后滴加3%H2O2室溫10 min，滴加一抗4 ℃過夜，復(fù)溫加二抗37 ℃孵育30 min，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，脫水、透明、封固，觀察。以PBS替代一抗作為陰性對照。

1.4 結(jié)果判斷 參考近期國外文獻方法，每張切片隨機選取5個高倍視野，每個視野計數(shù)200個腫瘤細(xì)胞，染色結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)綜合染色強度及陽性細(xì)胞率進行。(1)染色強度：無著色為0分,淡黃色為1分,棕黃色為2分,棕褐色為3分；(2)陽性細(xì)胞率：≤10%為0分,11%～25%為1分、26%～50%為2分、51%～75%為3分、>75%為4分。兩者相加判斷表達(dá)強度：0～1分為陰性(-)，2～3分為弱陽性(+)，4～5分為中度陽性()，6～7分為強陽性()。其中陰性和弱陽性為低表達(dá)，中度陽性和強陽性為高表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。樣本率之間比較采用χ2檢驗，相關(guān)性分析采用Spearman等級相關(guān)檢驗。

2 結(jié)果

2.1 NCT后乳腺癌組織形態(tài)學(xué)改變觀察 NCT后較NCT前乳腺癌組織發(fā)生不同程度的退行性變化：(1)腫瘤實質(zhì)主要表現(xiàn)為浸潤性癌成分變性、壞死，導(dǎo)致僅殘留原位癌結(jié)構(gòu)或者纖維間質(zhì)內(nèi)僅見少數(shù)癌細(xì)胞呈條索狀、巢團狀排列，甚至僅殘存單個癌細(xì)胞；乳腺癌細(xì)胞發(fā)生類似凋亡的形態(tài)學(xué)變化，主要表現(xiàn)為細(xì)胞皺縮，胞質(zhì)嗜酸性增強，胞核固縮、染色增強，有時可見奇異型巨核。(2)腫瘤間質(zhì)變化表現(xiàn)為間質(zhì)纖維化、水腫、鈣化、含鐵血黃素沉著等。

2.2 NCT前后p62和XIAP在乳腺癌組織中的表達(dá)及其變化 (1)p62和XIAP在乳腺癌組織中的表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)和(或)細(xì)胞核。NCT前p62主要定位于細(xì)胞核且染色較弱，NCT后p62定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核且染色較強；NCT前XIAP定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核且染色較強，NCT后XIAP主要定位于細(xì)胞核且染色較弱(圖1、2)。(2)94例NCT前乳腺癌穿刺標(biāo)本中，p62高表達(dá)率為51.1%(48/94)，XIAP高表達(dá)率為84.0%(79/94)；94例NCT后乳腺癌手術(shù)標(biāo)本中，p62高表達(dá)率升高為81.9%(77/94)，XIAP高表達(dá)率降低為35.1%(33/94)。即NCT后p62高表達(dá)率明顯升高，XIAP高表達(dá)率明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P均=0.000，表1)。

2.3 NCT后p62和XIAP表達(dá)變化的相關(guān)性 94對NCT前后乳腺癌標(biāo)本中，p62表達(dá)升高的樣本率為73.4%(69/94)；XIAP表達(dá)下降的樣本率為75.5%(71/94)。提示NCT后p62表達(dá)變化與XIAP表達(dá)變化呈顯著負(fù)相關(guān)(rs=-0.302，P=0.003，表2)。

①A①B②A②B

圖1 乳腺癌組織中p62的表達(dá)變化(同一病例)：A.NCT前p62呈低表達(dá)；B.NCT后p62呈高表達(dá)，EnVision兩步法

圖2 乳腺癌組織中XIAP的表達(dá)變化(同一病例)：A.NCT前XIAP呈高表達(dá)；B.NCT后XIAP呈低表達(dá)，EnVision兩步法

3 討論

自噬是真核細(xì)胞中高度保守又廣泛存在的一種“自我消化”過程，當(dāng)機體處于饑餓、營養(yǎng)不良等生理情況或暴露于低氧、輻射、細(xì)胞毒等壓力環(huán)境時，自噬被激活，自噬小體形成，并通過與溶酶體融合成自噬溶酶體降解細(xì)胞內(nèi)受損的細(xì)胞器和大分子物質(zhì)，以實現(xiàn)細(xì)胞的再循環(huán)、再利用，維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定[6-7]。自噬作為細(xì)胞的一種適應(yīng)環(huán)境的保護機制，不僅參與細(xì)胞成分更新、細(xì)胞生長與分化等生理過程，更是參與包括腫瘤發(fā)生、發(fā)展、治療耐藥等多種病理過程。在腫瘤發(fā)生階段，自噬抑制腫瘤形成，發(fā)揮抑癌作用；而在腫瘤進展和腫瘤治療過程中，自噬激活則促進腫瘤細(xì)胞存活，發(fā)揮促癌作用[8]。在放、化療等腫瘤治療過程中，自噬被激活，進而通過溶酶體途徑清除細(xì)胞毒性物質(zhì)、受損的細(xì)胞器、循環(huán)再利用營養(yǎng)物質(zhì)，阻止腫瘤細(xì)胞凋亡，發(fā)揮保護腫瘤細(xì)胞的作用[9]。

表1 NCT前后p62和XIAP蛋白表達(dá)的變化

表2 NCT后p62和XIAP表達(dá)變化的相關(guān)性

p62是SQSTM1編碼的具有多個功能性結(jié)構(gòu)域的泛素化蛋白，定位于細(xì)胞核，在細(xì)胞質(zhì)中合成。p62通過其UBA區(qū)募集泛素化蛋白，借助其PB1區(qū)形成大的蛋白聚集體，進而造成p62構(gòu)象改變，LIR區(qū)暴露，最后通過暴露的LIR區(qū)與定位于自噬小體膜上的LC3Ⅱ蛋白結(jié)合，在自噬溶酶體內(nèi)降解[10]。p62和LC3Ⅱ是自噬的標(biāo)志性蛋白，通過免疫組化技術(shù)檢測經(jīng)10%中性福爾馬林固定、石蠟包埋組織中p62和LC3Ⅱ的表達(dá)可以特異地、穩(wěn)定地檢測細(xì)胞內(nèi)自噬活性[11-12]。p62結(jié)構(gòu)域中還包含有2個NLS(核定位信號)和1個NES(出核信號)結(jié)構(gòu)域[13]，可以通過與多種入核和出核信號分子結(jié)合，而在核質(zhì)間自由穿梭。本組結(jié)果顯示NCT前p62主要定位于細(xì)胞核，而NTC后定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，我們推測化療藥物可能通過激活某種出核信號分子與p62蛋白的NES結(jié)構(gòu)域結(jié)合，介導(dǎo)p62蛋白穿梭到胞質(zhì)中發(fā)揮自噬相關(guān)作用。

XIAP是IAP家族中的一員，可直接抑制凋亡起始因子Caspase 9以及效應(yīng)分子Caspase 3與Caspase 7的活性，抑制外源性凋亡信號誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，XIAP在大多數(shù)腫瘤組織中高表達(dá)并與化療耐藥有關(guān)。越來越多的證據(jù)表明，在細(xì)胞毒性藥物介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中，自噬增強與XIAP下調(diào)共存[14-15]。本組結(jié)果與文獻[14-15]報道一致，NCT后p62高表達(dá)率明顯升高，XIAP高表達(dá)率明顯降低；p62表達(dá)升高的樣本率為73.4%，XIAP表達(dá)下降的樣本率為75.5%，提示乳腺癌NCT后自噬增強與XIAP下調(diào)共存。

本課題組前期實驗表明，XIAP能夠抑制細(xì)胞自噬。本實驗發(fā)現(xiàn)，XIAP通過結(jié)合并泛素化降解p62，抑制本底水平的自噬，促進腫瘤的生成；另一方面，XIAP下調(diào)造成p62介導(dǎo)的自噬增強對于腫瘤的轉(zhuǎn)移至關(guān)重要[16]。Wu等[17]發(fā)現(xiàn)XIAP和LC3在肝細(xì)胞性肝癌組織中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，并且低表達(dá)XIAP與高表達(dá)LC3的肝癌患者預(yù)后差，猜測肝癌組織中XIAP下調(diào)介導(dǎo)的自噬增強可能是預(yù)后差的分子機制。

本實驗不僅證明乳腺癌NCT后自噬增強與XIAP下調(diào)共存，通過Spearman等級相關(guān)檢驗還發(fā)現(xiàn)，NCT后p62表達(dá)變化與XIAP表達(dá)變化呈明顯負(fù)相關(guān)，并且NCT前后XIAP表達(dá)的定位變化與p62表達(dá)的定位變化正好相反，表現(xiàn)為NCT前XIAP定位于細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核而NCT后主要定位于細(xì)胞核。結(jié)合課題組前期關(guān)于XIAP泛素化降解p62的分析，推測NCT后XIAP主要定位于細(xì)胞核且表達(dá)下調(diào)，進一步導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)中XIAP對p62蛋白的泛素化降解作用減弱，最終導(dǎo)致胞質(zhì)中p62蛋白介導(dǎo)的自噬增強，即NCT后p62介導(dǎo)的自噬增強可能由XIAP下調(diào)導(dǎo)致，XIAP可能參與NCT后自噬增強的負(fù)性調(diào)節(jié)，為乳腺癌臨床治療提供新靶點和新思路，且本實驗是在NCT患者活體乳腺腫瘤組織中獲得自噬模型，為乳腺癌患者制定個體化治療方案提供重要的臨床信息。然而，乳腺癌NCT后自噬增強的調(diào)節(jié)機制以及XIAP如何調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬還有待進一步分析。

綜上所述，乳腺癌NCT后自噬增強與XIAP下調(diào)共存，且XIAP可能參與NCT后自噬增強的負(fù)性調(diào)節(jié)，為進一步分析自噬活性調(diào)節(jié)機制提供重要的參考價值。

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Changes of p62 and XIAP expression after neoadjuvantchemotherapy in breast cancer and their significance

HAN Ying, WU Zheng-sheng, WU Qiang

(DepartmentofPathology,AnhuiMedicalUniversity,Hefei230032,China)

Purpose To explore the change of autophagy after neoadjuvant chemotherapy (NCT) and its relationship with XIAP expression in breast cancer tissues. Method The expression of p62 and XIAP was detected by immunohistochemistry of EnVision two-step in 94 cases of breast carcinoma before and after NCT. The changes of p62 and XIAP expression after NCT were observed and their correlation was also analyzed. Results High expression rate of p62 and XIAP was 51.1% (48/94) and 84.0% (79/94) respectively in breast cancer tissues before NCT. The high expression rate of p62 was increased to 81.9% (77/94) and that of XIAP was reduced to 35.1% (33/94) in breast cancer tissues after NCT. The high expression rate of p62 was significantly increased while that of XIAP was significantly decreased after NCT (Pboth<0.05). The sample rate of increased expression of p62 and decreased expression of XIAP was 73.4% and 75.5% after NCT respectively. Furthermore, the change of p62 expression was significantly negatively correlated with the change of XIAP (P<0.01). Conclusion Suppression of XIAP and increased autophagic activity coexist in breast cancer after NCT, and XIAP may be involved in the negative regulation of enhanced autophagy.

breast neoplasm； neoadjuvant chemotherapy； autophagy； apoptosis； p62； XIAP

國家自然科學(xué)基金(81372476、81472493)

安徽醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)教研室，合肥 230032

韓 穎，女，碩士研究生。E-mail: 1039400311@qq.com 吳 強，男，博士生導(dǎo)師，通訊作者。E-mail: aydjohn@yahoo.com

時間：2017-5-17 23:52 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170517.2352.003.html

R 737.9；R 730.53

A

1001-7399(2017)05-0481-04

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.05.003

接受日期：2017-03-10