鄧春梅，何蘭珍，張國光，李思東，溫燕梅，吳育廉，黃燈威，康信煌

(廣東海洋大學化學與環(huán)境學院，廣東 湛江 524088)

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紅樹林土曲霉GX7-3B多糖的提取工藝優(yōu)化及抗氧化活性研究

鄧春梅，何蘭珍，張國光，李思東，溫燕梅，吳育廉，黃燈威，康信煌*

(廣東海洋大學化學與環(huán)境學院，廣東 湛江 524088)

通過正交實驗對紅樹林土曲霉GX7-3B多糖的提取工藝進行優(yōu)化，用Sevage試劑脫蛋白并純化多糖，用DPPH 自由基清除能力和總抗氧化能力評價多糖的體外抗氧化活性。結(jié)果表明，紅樹林土曲霉GX7-3B多糖的最佳提取工藝為：提取溫度75 ℃、提取時間3 h、料液比1∶30(g∶mL)，在此條件下，多糖提取率達到3.14%；在實驗濃度范圍內(nèi)，多糖清除DPPH自由基的能力及總抗氧化能力與其濃度呈正相關關系。表明紅樹林土曲霉GX7-3B多糖是一種天然抗氧化劑。

紅樹林；土曲霉；多糖；提??；抗氧化活性

紅樹林是生長于熱帶、亞熱帶海岸灘涂上的特殊森林植物，是陸地向海洋過渡的特殊生態(tài)系，兼具海洋與陸地的性質(zhì)[1-2]，具有豐富獨特的真菌資源。紅樹林共附生真菌能產(chǎn)生許多藥用活性次級代謝產(chǎn)物，是崛起的一類新型藥用真菌[3-8]。作者[9-10]前期研究發(fā)現(xiàn)，紅樹林土曲霉GX7-3B能產(chǎn)生具有抗腫瘤活性的次級代謝產(chǎn)物以及新的活性化合物。在此基礎上，作者進一步提取其中的多糖，對提取工藝進行優(yōu)化并研究多糖的體外抗氧化活性，以期擴大紅樹林土曲霉GX7-3B的藥用范圍、提高其藥用價值。

1 實驗

1.1 菌種、試劑與儀器

紅樹林土曲霉GX7-3B：GenBankID為KC461499。

蒽酮、丙酮、濃硫酸、30%雙氧水等均為國產(chǎn)分析純試劑，市售。

80-2B型離心沉淀機，江蘇新康醫(yī)療器械有限公司； 722S型紫外可見分光光度計，上海元析儀器有限公司； 電熱鼓風干燥箱，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化設備公司；小型粉碎機；水浴搖床；三用恒溫水箱。

1.2 菌種的培養(yǎng)

將紅樹林土曲霉GX7-3B接種于GPY培養(yǎng)基上，于25 ℃恒溫培養(yǎng)28d，過濾，分離菌體與培養(yǎng)液；將菌體在甲醇中浸泡清洗3次后取出，自然晾干，待用。

1.3 多糖的提取與純化

紅樹林土曲霉GX7-3B多糖的提取與純化工藝：菌體粉碎→熱水提取→旋轉(zhuǎn)濃縮→加入95%乙醇，冰箱靜置過夜→離心→干燥→粗多糖→溶解→Sevage法[11]脫蛋白→離心→取上清液→加95%乙醇，冰箱靜置過夜→離心→干燥→多糖。

1.4 多糖提取率的計算

參照文獻[12]，采用苯酚-硫酸法繪制葡萄糖標準曲線；測定多糖溶液在490nm處吸光度(A490)，依標準曲線計算多糖含量，再按式(1)計算多糖提取率。

(1)

式中：D490為多糖含量；n為提取液稀釋倍數(shù)；V為提取液的體積；m為菌體質(zhì)量。

1.5 多糖抗氧化活性評價

1.5.1 DPPH自由基清除能力的測定

用移液槍取2.8 mL 1.0 mg·mL-1多糖溶液于24孔板中；再用移液槍從中移取1.4 mL多糖溶液于下一個孔中，加蒸餾水1.4 mL，混勻；再從中取1.4 mL多糖溶液于下一個孔中，按此法稀釋得到5個梯度濃度多糖溶液，每個濃度做3個平行，空白對照為1.4 mL蒸餾水與1.4 mL無水乙醇混合液；然后用移液槍取1.4 mL 0.2 μmol·L-1DPPH溶液于多糖溶液及空白對照中，快速混勻，在黑暗中反應30 min后測定517 nm處吸光度，按式(2)計算清除率。

(2)

式中：A0為無水乙醇+DPPH溶液的吸光度；A1為多糖+DPPH溶液的吸光度。

1.5.2 總抗氧化能力的測定

稱取6.1 mg FeSO4，配成水溶液；加入0.25 mL 18 mol·L-1H2SO4，定容后放入還原鐵；取5.00 mL上述冷卻溶液于50 mL容量瓶中，再加入蒸餾水配制成800 μmol·L-1FeSO4標準溶液；繼續(xù)用蒸餾水稀釋，制備25 μmol·L-1、50 μmol·L-1、100 μmol·L-1、200 μmol·L-1、400 μmol·L-1FeSO4標準溶液，測定593 nm處吸光度，繪制FeSO4標準曲線；采用FRAP法[13]測定總抗氧化能力。

2 結(jié)果與討論

2.1 葡萄糖標準曲線

以葡萄糖標準溶液濃度為橫坐標、吸光度(A490)為縱坐標繪制葡萄糖標準曲線，如圖1所示。

圖1 葡萄糖標準曲線

從圖1可以看出，葡萄糖濃度在0.1～0.5 mg·mL-1范圍內(nèi)與A490呈線性關系。回歸方程為y=1.059x-0.0167,R2=0.9988。

2.2 多糖提取工藝優(yōu)化

在單因素實驗的基礎上，綜合多糖提取過程中各個單因素的相互關系，以提取溫度、提取時間及料液比為考察因素，以多糖提取率為評價指標，采用L9(34)正交實驗優(yōu)化多糖提取工藝。正交實驗因素與水平見表1，結(jié)果與分析見表2。

由表2可知，各因素對多糖提取率的影響大小為：C>B>A，即影響最大的是料液比，其次是提取時間，提取溫度影響最小，最優(yōu)提取條件為A1B1C1，即提取溫度75 ℃、提取時間3 h、料液比1∶30(g∶mL，下同)，在此條件下，多糖提取率達到3.14%。

表1 正交實驗的因素與水平Tab.1 Factors and levels of orthogonal experiment

表2 正交實驗結(jié)果與分析Tab.2 Results and analysis of orthogonal experiment

2.3 多糖的抗氧化活性評價

2.3.1 對DPPH自由基的清除能力

處于DPPH自由基中心位置的氮原子上的單電子對517 nm波長有強吸收，使得DPPH自由基醇溶液呈紫色。當存在自由基清除劑時，醇溶液褪色的程度與氮原子上單電子接受的電子數(shù)目呈劑量關系。本實驗參照文獻[14]，采用紫外分光光度法測定了多糖對DPPH自由基的清除能力，結(jié)果如圖2所示。

從圖2可以看出，隨著多糖濃度的增大，DPPH自由基清除率逐漸升高。表明，土曲霉GX7-3B多糖對DPPH自由基的清除能力與其濃度呈正相關關系。

2.3.2 總抗氧化能力

人體自由基的量在代謝正常的情況下是處于一種動態(tài)平衡中，當外界環(huán)境(如太陽光的輻射、吸入污染的氣體、吸煙等)發(fā)生變化時，這種動態(tài)平衡極易被破壞，導致自由基積累，傷害人體正常組織，甚至引發(fā)腫瘤、心臟病和老年癡呆等。為了防止和減輕自由基造成的損害，需要合適的自由基清除劑。研究顯示[15-16]，大多數(shù)真菌多糖能通過增強谷胱甘肽過氧化物酶活性來清除自由基。為此，本實驗采用FRAP法研究紅樹林土曲霉GX7-3B多糖的總抗氧化能力，F(xiàn)eSO4標準曲線見圖3，多糖總抗氧化能力見圖4。

圖2 多糖對DPPH自由基的清除能力

圖3 FeSO4標準曲線

圖4 多糖的總抗氧化能力

從圖4可以看出，在實驗濃度范圍內(nèi)，當多糖濃度每增加一倍，總抗氧化能力會顯著增強(P<0.01)；當多糖濃度達到最大，即1 mg·mL-1時，F(xiàn)RAP值可以達到103.2，總抗氧化能力最強。表明，紅樹林土曲霉GX7-3B多糖的總抗氧化能力與其濃度呈正相關關系。

3 結(jié)論

通過正交實驗確定紅樹林土曲霉GX7-3B多糖的最佳提取條件為：提取溫度75 ℃、提取時間3 h、料液比1∶30(g∶mL)，在此條件下，多糖提取率達到3.14%。紅樹林土曲霉GX7-3B多糖清除DPPH自由基的能力和總抗氧化能力與其濃度呈正相關關系。表明，紅樹林土曲霉GX7-3B多糖是一種較好的天然抗氧化劑，具有開發(fā)成為藥物或功能食品的潛力。

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打擊非法集資 共創(chuàng)社會和諧

——《化學與生物工程》編輯部

Optimization on Extraction Process of Polysaccharides from Mangrove EndophyticAspergillusterreusGX7-3B and Their Antioxidant Activity

DENG Chun-mei,HE Lan-zhen,ZHANG Guo-guang,LI Si-dong,WEN Yan-mei,WU Yu-lian,HUANG Deng-wei,KANG Xin-huang*

(SchoolofChemistryandEnvironment,GuangdongOceanUniversity,Zhanjiang534088,China)

TheextractionprocessofpolysaccharidesfrommangroveendophyticAspergillus terreusGX7-3Bwasoptimizedthroughanorthogonalexperiment.ThepolysaccharideswerepurifiedbydeproteinizationusingSevagereagent.Theantioxidantactivityin vitrowasevaluatedbythescavengingabilityofDPPHfreeradicalandthetotalantioxidantability.Resultsindicatedthattheoptimumextractionconditionsofpolysaccharideswereasfollows:extractiontemperatureof75 ℃,extractiontimeof3h,solid-liquidratioof1∶30(g∶mL).Theextractionrateofpolysaccharidesreached3.14%underaboveconditions.ThescavengingabilityofDPPHfreeradicalandthetotalantioxidantabilityshowedapositiverelationshipwiththeconcentrationofpolysaccharidesinrangeoftestingconcentrations,whichsuggestedthatpolysaccharidefrommangroveendophyticAspergillus terreusGX7-3Bwasanaturalantioxidant.

mangrove;Aspergillus terreus;polysaccharide;extraction;antioxidantactivity

湛江市科技局自然科學基金項目(A15445，A14457)，廣東海洋大學自然科學基金項目(E13503，Q14176)

2016-12-15

鄧春梅(1968-)，女，江西南昌人，博士，高級實驗師，研究方向：天然藥物化學，E-mail：dcm2382405@163.com；通訊作者：康信煌，副教授，E-mail：kang.xinhuang@gmail.com。

10.3969/j.issn.1672-5425.2017.06.009

O636.1 R931

A

1672-5425(2017)06-0041-04

鄧春梅，何蘭珍，張國光，等.紅樹林土曲霉GX7-3B多糖的提取工藝優(yōu)化及抗氧化活性研究[J].化學與生物工程，2017，34(6)：41-44.