鄭曉芳，趙 敏

(東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

?

YebF作為載體蛋白所引導(dǎo)的重組蛋白胞外分泌表達(dá)途徑的研究進(jìn)展

鄭曉芳，趙 敏*

(東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

大腸桿菌是表達(dá)重組蛋白最常用的宿主菌之一，但是由于它大多將重組蛋白分泌到菌體內(nèi)部，導(dǎo)致重組蛋白不能正確折疊或者被降解而失去活性，使得目的蛋白的提取和純化過(guò)程較為繁瑣。解決這些問(wèn)題的方法之一就是將重組蛋白分泌到胞外培養(yǎng)基中，這樣不僅有利于蛋白的正確折疊，也會(huì)極大地簡(jiǎn)化目的蛋白的提取和純化過(guò)程。近年發(fā)現(xiàn)的YebF蛋白是由大腸桿菌分泌到胞外培養(yǎng)基中的可溶內(nèi)源性短肽，大小為10.8 kDa；雖然其功能未知，但是YebF可作為載體蛋白與重組蛋白融合從而引導(dǎo)異源蛋白的胞外分泌表達(dá)。綜述了YebF蛋白的結(jié)構(gòu)及其胞外分泌表達(dá)的機(jī)理，總結(jié)了應(yīng)用YebF分泌途徑成功胞外表達(dá)異源蛋白的例子，闡述了利用YebF胞外分泌途徑提高目的蛋白表達(dá)量的策略，為更多重組蛋白的高效分泌表達(dá)提供了理論基礎(chǔ)。

YebF蛋白；載體蛋白；重組蛋白；胞外分泌表達(dá)；高效分泌策略

1 大腸桿菌分泌途徑

大腸桿菌是表達(dá)重組蛋白最常用的宿主菌之一[1]，具有遺傳背景清楚、操作簡(jiǎn)單、生長(zhǎng)周期短、成本低、易實(shí)現(xiàn)大規(guī)模高密度發(fā)酵等優(yōu)點(diǎn)[2]，利用大腸桿菌分泌途徑胞外表達(dá)重組蛋白具有可促進(jìn)蛋白正確折疊、提高蛋白穩(wěn)定性及可溶性、簡(jiǎn)化純化工序、降低生產(chǎn)成本等諸多優(yōu)勢(shì)[3]，備受關(guān)注和青睞。

目前在G-細(xì)菌中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并研究得較為成熟的蛋白分泌途徑有6種[4]，其中最主要的是大腸桿菌分泌途徑，表達(dá)重組蛋白應(yīng)用最廣泛的分泌途徑為Ⅰ型和Ⅱ型系統(tǒng)[5]。其中Ⅰ型分泌系統(tǒng)也稱(chēng)α-溶血素(HlyA)分泌系統(tǒng)，運(yùn)輸?shù)孜颒lyA通過(guò)HlyB、HlyD和TolC形成的連通周質(zhì)與胞外的跨膜通道直接從胞內(nèi)釋放到胞外，整個(gè)反應(yīng)為單步反應(yīng)，底物無(wú)需穿越兩層膜[6]；Ⅱ型分泌系統(tǒng)是以細(xì)胞周質(zhì)為中介的兩步跨膜運(yùn)輸過(guò)程：蛋白先經(jīng)SecB依賴(lài)性途徑、信號(hào)識(shí)別顆粒途徑(SRP)或雙精氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)途徑(TAT)，通過(guò)細(xì)胞內(nèi)膜轉(zhuǎn)運(yùn)至大腸桿菌周質(zhì)空間內(nèi)，隨后經(jīng)不同的轉(zhuǎn)運(yùn)體或滲透性作用分泌到胞外[5]。

雖然大腸桿菌分泌途徑有諸多優(yōu)點(diǎn)，但大部分目的蛋白都被分泌在菌體內(nèi)，需通過(guò)細(xì)胞破碎或滲透性失水作用處理菌體細(xì)胞，極易造成目的蛋白失活或流失，且大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)蛋白組分復(fù)雜，破胞后會(huì)和目的蛋白一同釋放到緩沖液中，不利于后續(xù)目的蛋白的純化。解決這些問(wèn)題的最有效方法之一是大腸桿菌直接將重組蛋白釋放到胞外培養(yǎng)基中，這一策略有諸多優(yōu)點(diǎn)[7-9]：第一，簡(jiǎn)化了重組蛋白的純化程序。所需重組蛋白在培養(yǎng)基上清液中，直接離心即可獲得，無(wú)需破胞處理，且大腸桿菌自身分泌到胞外的背景蛋白很少，有效簡(jiǎn)化了目的蛋白的純化步驟；第二，提高了重組蛋白的生物學(xué)活性，減少了包涵體的產(chǎn)生。重組蛋白在分泌過(guò)程中會(huì)經(jīng)過(guò)周質(zhì)空間，將重組蛋白暴露在一系列的二硫鍵異構(gòu)酶和折疊酶中，從而促進(jìn)重組蛋白的正確折疊和二硫鍵的形成，減少包涵體的產(chǎn)生；第三，增強(qiáng)了重組蛋白的穩(wěn)定性和溶解性。除了分子伴侶之外，周質(zhì)和胞外基質(zhì)中只有很少的蛋白酶，因此減少了重組蛋白的降解，增強(qiáng)了重組蛋白的穩(wěn)定性和溶解性。

通常認(rèn)為只有病原性的大腸桿菌可以將蛋白釋放到外部環(huán)境中[10]，非致病性的實(shí)驗(yàn)室大腸桿菌特別是EscherichiacoliK12菌株缺少相應(yīng)的蛋白分泌系統(tǒng)，因此在正常生長(zhǎng)條件下不能將蛋白分泌到胞外培養(yǎng)基中[11-12]，但是YebF蛋白的發(fā)現(xiàn)打破了這一觀點(diǎn)。

2 YebF分泌途徑

2.1 YebF蛋白簡(jiǎn)介

YebF蛋白廣泛存在于腸桿菌科(Enterobacteriaceae)細(xì)菌中，是由大腸桿菌分泌到胞外培養(yǎng)基中的可溶內(nèi)源性短肽，大小為10.8 kDa。雖然其功能未知，但是YebF可作為載體蛋白與重組蛋白融合從而引導(dǎo)異源蛋白的胞外分泌表達(dá)[13]。目前對(duì)YebF蛋白的研究不多，其分泌途徑更是少之又少。

2.2 YebF蛋白結(jié)構(gòu)

Prehna等[14]對(duì)YebF蛋白的結(jié)構(gòu)(圖1)進(jìn)行了研究，通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射實(shí)驗(yàn)證明YebF蛋白在溶液中是以單體的形式存在，其結(jié)構(gòu)包括一個(gè)有序的結(jié)構(gòu)核心(ordered structured core)和一個(gè)擴(kuò)展的動(dòng)態(tài)表面(extensive dynamic surface)。Dali Server蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)[15]比對(duì)發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)核心類(lèi)似于胱抑素蛋白家族，由47個(gè)氨基酸殘基組成，這些氨基酸殘基折疊成一個(gè)緊湊的結(jié)構(gòu)域，由一個(gè)二硫鍵(C35-C108)穩(wěn)定結(jié)構(gòu)；結(jié)構(gòu)核心的二級(jí)結(jié)構(gòu)包括1個(gè)4-轉(zhuǎn)角α-螺旋(4-turnα-helix,α1)、4個(gè)反向平行的β-折疊(β-strands)和1個(gè)1-轉(zhuǎn)角310螺旋(single turn of 310helix)；動(dòng)態(tài)表面包括2個(gè)區(qū)域：動(dòng)態(tài)環(huán)1(dynamic loop 1)和動(dòng)態(tài)環(huán)2 (dynamic loop 2)。15N異核單量子相關(guān)譜(15N-HSQC)顯示動(dòng)態(tài)環(huán)1和動(dòng)態(tài)環(huán)2的氨基酸殘基會(huì)發(fā)生構(gòu)象改變。這種現(xiàn)象在那些處于靈活運(yùn)動(dòng)狀態(tài)的蛋白質(zhì)中很常見(jiàn)，構(gòu)象的改變對(duì)于蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能起到?jīng)Q定性作用[16]。

圖1 YebF蛋白的結(jié)構(gòu)

YebF蛋白的結(jié)構(gòu)核心類(lèi)似于大腸桿菌素M免疫蛋白(colicin M immunity protein，Cmi)，序列比對(duì)有高度的一致性[14,17]。類(lèi)似的結(jié)果也在Gerard等[18]的研究中發(fā)現(xiàn)，在90多個(gè)氨基酸殘基的序列比對(duì)中，Cmi與YebF有26%(E.coliYebF)到35%(Yersiniaspecies YebF)的序列一致性，Cmi的晶體結(jié)構(gòu)中構(gòu)成二硫鍵的2個(gè)半胱氨酸殘基在所有的YebF序列中都是高度保守的。但是與YebF不同，Cmi被它的N末端固定在內(nèi)膜的周質(zhì)面，通過(guò)與大腸桿菌素M結(jié)合，達(dá)到保護(hù)細(xì)菌的目的[18]。此外，Cmi的N末端有一個(gè)5個(gè)氨基酸殘基的缺失和一個(gè)3個(gè)氨基酸殘基的內(nèi)部插入，導(dǎo)致了Cmi二硫鍵的位置與YebF二硫鍵的位置不同[14]。

通過(guò)ConSurf Server[19]和PSI-BLAST(position-specific iterated BLAST)[20]分析發(fā)現(xiàn)，YebF蛋白的保守區(qū)域是動(dòng)態(tài)表面而非結(jié)構(gòu)核心，且其保守性最高的區(qū)域?yàn)閯?dòng)態(tài)環(huán)1和動(dòng)態(tài)環(huán)2。與之不同的是，除了對(duì)于正確折疊不可或缺的二硫鍵和疏水性氨基酸殘基序列比較保守外，YebF蛋白的結(jié)構(gòu)核心序列因菌株種類(lèi)的不同而存在差異。

由泊松-玻爾茲曼方程(Adaptive Poisson-Boltzmann Solver，APBS)[21]發(fā)現(xiàn)，YebF蛋白分子的表面由2種相反的電極組成，陽(yáng)性面包括α1 折疊面和2個(gè)動(dòng)力環(huán)，陰性面是YebF結(jié)構(gòu)核心區(qū)域的外部反向平行β-折疊面[14]。

2.3 YebF胞外分泌機(jī)制

通過(guò)基因工程技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，YebF蛋白的胞外釋放不是由于細(xì)胞的凋亡和細(xì)胞膜的滲漏，而是蛋白分泌表達(dá)的結(jié)果[13]。Seo等[22]通過(guò)YebF蛋白與β-防御素2(HBD2)融合在重組E.coliNissle 1917菌株中的胞外釋放也得到了相同的結(jié)論。YebF蛋白的分泌是通過(guò)2個(gè)步驟實(shí)現(xiàn)的，但是其蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制卻不同于目前已知的6種分泌途徑[13-14]。

2.3.1 外膜孔蛋白與YebF胞外分泌關(guān)系

Prehna等[14]運(yùn)用基因、生物化學(xué)和生物物理學(xué)技術(shù)研究了YebF蛋白獨(dú)特的外膜轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制，通過(guò)基因刪除、基因互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)以及平面脂雙層實(shí)驗(yàn)研究外膜孔蛋白OmpF、OmpC和OmpX與YebF胞外分泌的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，OmpF和OmpX是YebF胞外分泌所必需的元件，雖然OmpC參與了YebF胞外分泌過(guò)程，但不是必須的；OmpF是外膜上含量最豐富的蛋白之一[23-24]，是胞外毒素蛋白進(jìn)入周質(zhì)的通道[25]；OmpF和OmpC可以形成異三聚體OmpF/C[26]，OmpC作為附屬元件可以加強(qiáng)YebF蛋白與異三聚體OmpF/C的相互作用；OmpF和OmpC可以形成大小可變的陰性通道來(lái)轉(zhuǎn)運(yùn)小的可溶性代謝分子[23]，也可以攝取大的毒素蛋白進(jìn)入細(xì)胞中[25]。平面脂雙層實(shí)驗(yàn)證明YebF蛋白與OmpF/C的相互作用發(fā)生在外膜的周質(zhì)面，并且YebF蛋白的某一區(qū)域可能插入到OmpF的內(nèi)腔[14]，這一現(xiàn)象類(lèi)似于大腸桿菌素E3[24]和E9[27](在分泌過(guò)程中，E3和E9無(wú)序的N末端中83個(gè)氨基酸殘基插入到OmpF的內(nèi)腔)。OmpX是一大小為17 kDa、β-折疊的外膜蛋白，它可以促進(jìn)宿主細(xì)胞的粘附[28]。Prehna等[14]研究表明，OmpX的作用可能是幫助YebF蛋白定位和組裝到OmpF/C上。

2.3.2 YebF蛋白結(jié)構(gòu)元件與其胞外分泌的關(guān)系

鑒于大腸桿菌素特有的結(jié)構(gòu)對(duì)于其孔蛋白介導(dǎo)的攝取過(guò)程起關(guān)鍵性作用[25]，Prehna等[14]通過(guò)NMR和基因突變技術(shù)研究了YebF蛋白的結(jié)構(gòu)元件與其孔蛋白介導(dǎo)的分泌途徑之間的關(guān)系。YebF蛋白表面是由2種相反的電極組成，這種靜電學(xué)結(jié)構(gòu)表明YebF蛋白很可能與大腸桿菌素E9相似[27]，通過(guò)陽(yáng)極和陰極交替的蛋白片段插入到OmpF的內(nèi)腔。此外，二硫鍵(C35-C108)的突變導(dǎo)致在胞外培養(yǎng)基中檢測(cè)不到Y(jié)ebF蛋白，2個(gè)動(dòng)態(tài)環(huán)的突變導(dǎo)致YebF胞外分泌量與野生型的相比減少了80%以上。YebF蛋白可以與二硫鍵體系(disulfide bond，Dsb)中的組分(DsbA、DsbC和DsbD)相互作用，并且DsbC(二硫鍵異構(gòu)酶)的缺失會(huì)導(dǎo)致大腸桿菌中4種周質(zhì)蛋白(MepA、End1、Ivy和YebF[29])的含量明顯減少。DsbC的作用是使二硫鍵異構(gòu)化，也可以糾正周質(zhì)中被二硫鍵氧化酶錯(cuò)誤氧化的二硫鍵[29-30]。因此二硫鍵的異構(gòu)化在YebF胞外分泌途徑中是必不可少的。通過(guò)質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)YebF蛋白整體是靜止的，只有N末端和動(dòng)態(tài)環(huán)區(qū)域以納秒-微秒的時(shí)間軸劇烈運(yùn)動(dòng)，進(jìn)行快速的構(gòu)象變化。此外，YebF蛋白結(jié)構(gòu)中的2個(gè)動(dòng)態(tài)環(huán)區(qū)域?yàn)殛?yáng)性電極，胱抑素核心區(qū)域?yàn)殛幮噪姌O。這表明YebF是一個(gè)具有2個(gè)相反電極的蛋白分子，一面是靈活無(wú)序的，另一面是靜止有序的。

平面脂雙層實(shí)驗(yàn)證明YebF蛋白在分泌過(guò)程中會(huì)識(shí)別OmpF/C的周質(zhì)面，并且這種相互作用會(huì)被YebF蛋白的陽(yáng)性動(dòng)態(tài)環(huán)區(qū)域、OmpF/C的陰性周質(zhì)面所加強(qiáng)。有研究表明蛋白的靈活性可以作為一種生物識(shí)別的途徑[31]，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)也顯示動(dòng)態(tài)環(huán)區(qū)域的突變會(huì)導(dǎo)致YebF胞外分泌量大大減少。綜合表明，YebF蛋白的動(dòng)態(tài)特性對(duì)于其分泌是很重要的，可能通過(guò)促進(jìn)YebF蛋白與外膜蛋白的靜電作用來(lái)促進(jìn)YebF蛋白的分泌[14]。

2.3.3 YebF胞外分泌機(jī)制

Prehna等[14]通過(guò)研究外膜孔蛋白和YebF蛋白結(jié)構(gòu)元件與YebF胞外分泌的關(guān)系，總結(jié)了外膜孔蛋白介導(dǎo)的YebF胞外分泌機(jī)制。YebF胞外分泌途徑分為兩步：首先preYebF蛋白(13 kDa)在細(xì)胞質(zhì)中合成后通過(guò)內(nèi)膜上的Sec途徑轉(zhuǎn)運(yùn)到周質(zhì)中，在周質(zhì)中被前導(dǎo)肽酶Ⅰ切割成成熟的YebF蛋白(10.8 kDa)；然后在周質(zhì)中通過(guò)識(shí)別外膜上的OmpX蛋白將YebF蛋白定位到外膜上，具體是通過(guò)OmpX的介導(dǎo)和YebF蛋白的陽(yáng)性動(dòng)態(tài)面的幫助，將YebF蛋白組裝到外膜陰性周質(zhì)面的OmpC上，以此與OmpF/C結(jié)合；定位到外膜上后，YebF蛋白的無(wú)序快速運(yùn)動(dòng)的N末端會(huì)插入到OmpF的內(nèi)腔，然后通過(guò)孔蛋白形成的通道分泌到胞外培養(yǎng)基中。在這個(gè)過(guò)程中YebF蛋白是線性的無(wú)折疊的狀態(tài)，因此推測(cè)YebF蛋白在被分泌到胞外培養(yǎng)基的時(shí)候，被重新折疊[14]。

2.4 YebF所引導(dǎo)的重組蛋白胞外分泌表達(dá)途徑的應(yīng)用

YebF可以作為載體蛋白引導(dǎo)不同大小和形狀的原核和真核重組蛋白分泌到胞外培養(yǎng)基中，并保持重組蛋白的活性狀態(tài)不變[13]。已有很多蛋白通過(guò)YebF分泌途徑成功在胞外培養(yǎng)基中得到表達(dá)。表1是通過(guò)融合YebF蛋白成功實(shí)現(xiàn)重組蛋白胞外分泌表達(dá)的實(shí)例。

表1 融合YebF蛋白成功實(shí)現(xiàn)重組蛋白胞外分泌表達(dá)的實(shí)例Tab.1 Examples of recombinant proteins extracellular secretory expression fused to protein YebF

3 提高重組蛋白胞外積累量的策略

雖然通過(guò)YebF分泌途徑實(shí)現(xiàn)了重組蛋白成功分泌到胞外培養(yǎng)基中，但是目的蛋白的分泌效率很低，例如由YebF分泌途徑實(shí)現(xiàn)的CotA漆酶的分泌效率只有29%[9]，有些蛋白的分泌甚至受到阻礙，例如γ-干擾素[7]。目的蛋白不能高效表達(dá)，這一缺點(diǎn)大大限制了YebF分泌途徑更廣泛的應(yīng)用。因此需要采取一些策略提高目的蛋白的分泌表達(dá)，以擴(kuò)大YebF分泌途徑的應(yīng)用。

影響蛋白分泌量的因素有很多，總結(jié)起來(lái)主要有3個(gè)：目的蛋白基因水平、分泌表達(dá)元件和培養(yǎng)條件。

3.1 目的蛋白基因水平優(yōu)化

通過(guò)在基因水平對(duì)表達(dá)載體進(jìn)行改造，一般都是選擇強(qiáng)啟動(dòng)子以提高目的蛋白的表達(dá)量；此外，就是通過(guò)篩選突變菌株來(lái)提高重組蛋白的分泌量。

Haitjema等[33]利用基因工程技術(shù)構(gòu)建了一個(gè)可以直接篩選高效分泌重組蛋白菌株的工具。其原理為將FlAsH識(shí)別序列-四半胱氨酸基序與YebF蛋白的C末端融合，被表達(dá)后分泌到胞外與含有雙砷基團(tuán)的有機(jī)小分子FlAsH-EDT2特異結(jié)合，生成共價(jià)結(jié)合的雙砷染料-半胱氨酸體系，產(chǎn)生熒光，通過(guò)檢測(cè)胞外培養(yǎng)基中熒光強(qiáng)度來(lái)達(dá)到篩選的目的。通過(guò)這種方法發(fā)現(xiàn)，單一敲除E.coliBW25113菌株中以下任一基因：entC、entE、envZ、mzrA、nlpD、ompR、tnaA和yihF，都會(huì)使YebF蛋白的分泌量提高3倍；敲除兩個(gè)及以上基因會(huì)使YebF蛋白分泌量更高。這些突變菌株會(huì)使與YebF蛋白融合表達(dá)的Cel3A、Cel5B、Cel6A和Cel9A分泌量增加，在ΔnlpD、ΔentE和ΔtnaA3種突變菌株中同時(shí)共表達(dá)這4種蛋白，會(huì)使其分泌量提高25%～50%。這種篩選方法同樣適用于其它分泌途徑[33]。

3.2 分泌表達(dá)元件的影響

信號(hào)肽是引導(dǎo)新合成的蛋白質(zhì)向分泌通路轉(zhuǎn)移的短肽鏈，因此在重組蛋白的分泌表達(dá)過(guò)程中起著很重要的作用?？梢酝ㄟ^(guò)加強(qiáng)信號(hào)肽的作用來(lái)促進(jìn)分泌。Broedel等[7]發(fā)現(xiàn)，將YebF蛋白的信號(hào)肽序列換成SEC(OmpA)或SRP(DsbA)的信號(hào)肽序列會(huì)使YebF蛋白的分泌量分別提高46倍和35倍。

3.3 培養(yǎng)條件的優(yōu)化

在誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)過(guò)程中，誘導(dǎo)條件如誘導(dǎo)時(shí)間、溫度、IPTG 濃度、轉(zhuǎn)速和培養(yǎng)方式等都會(huì)影響蛋白的分泌量。重組蛋白不同，其最適培養(yǎng)條件也不同，這其中的特征及規(guī)律需進(jìn)一步探索[35]。

IPTG作為最常用的誘導(dǎo)劑可以誘導(dǎo)重組蛋白的表達(dá)，同時(shí)它也是一種細(xì)胞毒性物質(zhì)，濃度過(guò)高會(huì)抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)。例如，50 μmol·L-1IPTG可正常誘導(dǎo)α-淀粉酶和堿性磷酸酶的分泌表達(dá)，當(dāng)IPTG濃度達(dá)到0.1 mmol·L-1時(shí)，蛋白表達(dá)量就會(huì)降低[7]。Low 等[36]指出TB培養(yǎng)基的某些成分有利于蛋白分泌，因此可選擇 TB 代替 LB 來(lái)培養(yǎng)菌株。也可以用自誘導(dǎo)培養(yǎng)基[37]代替LB培養(yǎng)基，因?yàn)樽哉T導(dǎo)培養(yǎng)基可以短期內(nèi)實(shí)現(xiàn)菌體的高密度生長(zhǎng)，縮短重組蛋白的分泌時(shí)間同時(shí)提高分泌量，并且不需要加誘導(dǎo)劑。研究表明與搖瓶培養(yǎng)比較，生物反應(yīng)器條件下蛋白的活性及生長(zhǎng)量相對(duì)較高[38]。Broedel等[7]也發(fā)現(xiàn)，相比于在搖瓶中誘導(dǎo)α-淀粉酶和堿性磷酸酶(表達(dá)量為20～50 mg·L-1)，條件優(yōu)化后的大規(guī)模發(fā)酵會(huì)使表達(dá)量達(dá)到100 mg·L-1以上。

4 展望

YebF分泌途徑因其可直接將重組蛋白分泌到胞外培養(yǎng)基中，大大簡(jiǎn)化了重組蛋白的提取和純化過(guò)程，近幾年備受關(guān)注。特別是對(duì)于在大腸桿菌中重組表達(dá)的藥物蛋白，該途徑極大地減少了在收集和純化過(guò)程中脂多糖對(duì)藥物蛋白的污染。雖然參與YebF分泌途徑的幾個(gè)元件已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)，但是各個(gè)元件在分泌過(guò)程中與YebF蛋白的相互關(guān)系以及完整的分泌途徑仍需更進(jìn)一步的研究。二硫鍵及二硫鍵體系中DsbA、DsbC和DsbD在YebF分泌途徑中的功能也需要進(jìn)一步的探討。是否有其它因子如外膜脂質(zhì)參與分泌過(guò)程，或者是否有其它途徑也介導(dǎo)YebF蛋白的分泌，需要更深入的研究。雖然很多重組蛋白都通過(guò)YebF分泌途徑被成功分泌到胞外，但是分泌效率很低，嚴(yán)重限制了該途徑大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。因此，如何提高YebF途徑的分泌效率是未來(lái)努力的方向。隨著對(duì)YebF分泌途徑機(jī)制的深入認(rèn)識(shí)和高效分泌重組蛋白技術(shù)的提高，YebF分泌途徑的應(yīng)用范圍會(huì)更廣，各種藥物蛋白及酶類(lèi)產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)化前景會(huì)更廣闊。

[1] GEORGIOU G,SEGATORI L.Preparative expression of secreted proteins in bacteria:status report and future prospects[J].Current Opinion in Biotechnology,2005,16(5):538-545.

[2] 何冰芳,米蘭,陳文華.大腸桿菌蛋白質(zhì)分泌機(jī)理及其重組蛋白分泌表達(dá)新進(jìn)展[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào),2012,31(6):561-569．

[3] YOON S H,KIM S K,KIM J F.Secretory production of recombinant proteins inEscherichiacoli[J].Recent Parents on Biotechnology,2010,4(1):23-29．

[4] 訾禎禎,楊志偉.細(xì)菌蛋白分泌途徑的研究進(jìn)展[J].生物技術(shù)通報(bào),2011(8):44-54．

[6] BUCHANAN S K.Type I secretion and multidrug efflux:transport through the TolC channel-tunnel[J].Trends in Biochemical Sciences,2001,26(1):3-6.

[7] BROEDEL J S E,PAPCIAK S M.ACESTMsignal sequence and YebF expression systems.Athena Environmental Sciences,Inc.,Technical Brief,December 2007,http://athenaes.com /osc/TechBrief_ ACESSignalSeq_Web.

[8] NI Y,CHEN R.Extracellular recombinant protein production fromEscherichiacoli[J].Biotechnology Letters,2009,31(11):1661-1670.

[9] WANG T N,ZHAO M.A simple strategy for extracellular production of CotA laccase inEscherichiacoliand decolorization of simulated textile effluent by recombinant laccase[J].Applied Microbiology and Biotechnology,2017,101(2):685-696.

[10] YEN M R,PEABODY C R,PARTOVI S M,et al.Protein-translocating outer membrane porins of Gram-negative bacteria[J].Biochimica et Biophysica Acta,2002,1562(1/2)：6-31.

[11] PUGSLEY A P,FRANCETIC O.Protein secretion inEscherichiacoliK12:dead or alive？[J].Cellular and Molecular Life Sciences,1998,54(4):347-352.

[12] SHOKRI A,SANDEN A M,LARSSON G.Cell and process design for targeting of recombinant protein into the culture medium ofEscherichiacoli[J].Applied Microbiology and Biotechnology,2003,60(6):654-664.

[13] ZHANG G,BROKX S,WEINER J H.Extracellular accumulation of recombinant proteins fused to the carrier protein YebF inEscherichiacoli[J].Nature Biotechnology,2006,24(1):100-104.

[14] PREHNA G,ZHANG G,GONG X,et al.A protein export pathway involvingEscherichiacoliporins[J].Structure,2012,20(7):1154-1166.

[15] HOLM L,ROSENSTROM P.Dali server:conservation mapping in 3D[J].Nucleic Acids Research,2010,38:W545-W549.

[16] TRAASETH N J,VEGLIA G.Probing excited states and activation energy for the integral membrane protein phospholamban by NMR CPMG relaxation dispersion experiments[J].Biochimica et Biophysica Acta,2010,1798(2):77-81.

[18] GERARD F,BROOKS M A,BARRETEAU H,et al.X-ray structure and site-directed mutagenesis analysis of theEscherichiacolicolicin M immunity protein[J].Journal of Bacteriology,2011,193(1):205-214.

[19] ASHKENAZY H,EREZ E,MARTZ E,et al.ConSurf 2010:calculating evolutionary conservation in sequence and structure of proteins and nucleic acids[J].Nucleic Acids Research,2010,38:W529-W533.

[20] ALTSCHUL S F,MADDEN T L,SCHAFFER A A,et al.Gapped BLAST and PSI-BLAST:a new generation of protein database search programs[J].Nucleic Acids Research,1997,25(17):3389-3402.

[21] DOLINSKY T J,CZODROWSKI P,LI H,et al.PDB2PQR:expanding and upgrading automated preparation of biomolecular structures for molecular simulations[J].Nucleic Acids Research,2007,35:W522-W525.

[22] SEO E J,WEIBEL S,WEHKAMP J,et al.Construction of recombinantE.coliNissle 1917(EcN) strains for the expression and secretion of defensins[J].International Journal of Medical Microbiology,2012,302(6):276-287.

[23] NIKAIDO H.Molecular basis of bacterial outer membrane permeability revisited[J].Microbiology and Molecular Biology Reviews,2003,67(4):593-656.

[24] YAMASHITA E,ZHALNINA M V,ZAKHAROV S D,et al.Crystal structures of the OmpF porin:function in a colicin translocon[J].The European Molecular Biology Organization Journal,2008,27(15):2171-2180.

[25] KLEANTHOUS C.Swimming against the tide:progress and challenges in our understanding of colicin translocation[J].Nature Reviews Microbiology,2010,8(12):843-848.

[26] GEHRINGS K B,NIKAIDO H.Existence and purification of porin heterotrimers ofEscherichiacoliK12 OmpC,OmpF,and PhoE proteins[J].Journal of Biological Chemistry,1989,264(5):2810-2815.

[27] HOUSDEN N G,WOJDYLA J A,KORCZYNSKA J,et al.Directed epitope delivery across theEscherichiacoliouter membrane through the porin OmpF[J].Proceedings of the National Academy of Sciences,2010,107(50):21412-21417.

[28] VOGT J,SCHULZ G E.The structure of the outer membrane protein OmpX fromEscherichiacolireveals possible mechanisms of virulence[J].Structure,1999,7(10):1301-1309.

[29] VERTOMMEN D,DEPUYDT M,PAN J,et al.The disulfide isomerase DsbC cooperates with the oxidase DsbA in a DsbD-independent manner[J].Molecular Microbiology,2008,67(2):336-349.

[30] INABA K.Disulfide bond formation system inEscherichiacoli[J].Journal of Biochemistry,2009,146(5):591-597.

[31] DYSON H J,WRIGHT P E.Intrinsically unstructured proteins and their functions[J].Nature Reviews Molecular Cell Biology,2005,6(3):197-208.

[32] CHEN N,HONG F L,WANG H H,et al.Modified recombinant proteins can be exportedviathe Sec pathway inEscherichiacoli[J].PLoS One,2012,7(8):e42519.

[33] HAITJEMA C H,BOOCK J T,NATARAJAN A,et al.Universal genetic assay for engineering extracellular protein expression[J].ACS Synthetic Biology,2014,3(2):74-82.

[34] XIAO Y,ZHANG Q S,LUO Y Q,et al.Neurosporacrassatox-1 gene encodes a pH-and temperature-tolerant mini-cellulase[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2016,64(23):4751-4757.

[35] 王靖瑤,王天女,盧磊,等.大腸桿菌I型分泌表達(dá)系統(tǒng)研究進(jìn)展及提高蛋白表達(dá)量的策略[J].中國(guó)生物工程雜志,2014,34(6):98-104．

[36] LOW K O,MAHADI N M,RAHIM R A,et al.An effective extracellular protein secretion by an ABC transporter system inEscherichiacoli:statistical modeling and optimization of cyclodextrin glucanotransferase secretory production[J].Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology,2011,38(9):1587-1597.[37] STUDIER F W.Protein production by auto-induction in high-density shaking cultures[J].Protein Expression and Purification,2005,41(1):207-234.

[38] SUGAMATA Y,SHIBA T.Improved secretory production of recombinant proteins by random mutagenesis ofhlyB,an alpha-hemolysin transporter fromEscherichiacoli[J].Appllied and Environmental Microbiology,2005,71(2):656-662.

Research Progress in Extracellular Secretory Expression Pathway of Recombinant Protein Fused to the Carrier Protein YebF

ZHENG Xiao-fang,ZHAO Min*

(CollegeofLifeSciences,NortheastForestryUniversity,Harbin150040,China)

AlthoughEscherichia coliisoneofthemostwidely-usedhostsfortheexpressionofrecombinantprotein,severallimitationsremainbecauseofintracellularsecretoryexpressionofrecombinantprotein,thusrecombinantproteincannotbefoldedcorrectlyordegradedtoloseactivity,andtheextractionandpurificationofdesiredproteinwillbegreatlycomplicated.Onewaytosolvetheseproblemsistosecreterecombinantproteinintoanextracellularmedium,whichismoreconductivetofoldcorrectly,andgreatlysimplifiestheextractionandpurificationprocess.RecentinvestigationshaveshownthattheproteinYebFsecretedintotheextracellularmediumbyE.coliisasmall(10.8kDainthenativeform)andsolubleendogenousshort-peptide.ThefunctionofproteinYebFisunknown,butitcanactasacarrierproteintofusetherecombinantproteinintotheextracellularmedium.ThestructuresandtheextracellularsecretoryexpressionmechanismofproteinYebFarereviewed.TheapplicationsofproteinYebFtocoexpressrecombinantproteinsintotheextracellularmediumaresummarized.Besides,thestrategyforenhancingtheexpressionandsecretionlevelofdesiredproteinsisexplained,whichprovidesatheoreticalbasisfortheefficientsecretoryexpressionofmorerecombinantproteins.

proteinYebF;carrierprotein;recombinantprotein;extracellularsecretoryexpression;efficientsecretorystrategy

國(guó)家林業(yè)局948項(xiàng)目(2012-4-03)，國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2014FY210400)，中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專(zhuān)項(xiàng)資金項(xiàng)目(2572014AA05)

2017-01-04

鄭曉芳(1990-)，女，河南濮陽(yáng)人，碩士研究生，研究方向：漆酶的胞外誘導(dǎo)表達(dá)和固定化，E-mail：18745029415@163.com；通訊作者：趙敏，教授，E-mail：82191513@163.com。

10.3969/j.issn.1672-5425.2017.06.002

Q786 Q51

A

1672-5425(2017)06-0006-06

鄭曉芳，趙敏.YebF作為載體蛋白所引導(dǎo)的重組蛋白胞外分泌表達(dá)途徑的研究進(jìn)展[J].化學(xué)與生物工程，2017，34(6)：6-11.