俱 雄，黨亞鋒，劉 祥，丁 銳，陳 琛，馮自立，張辰露

(1.陜西理工大學(xué)中德天然產(chǎn)物研究所，陜西 漢中 723001； 2.漢中市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心, 陜西 漢中 723000；3.陜西省天麻山茱萸工程技術(shù)研究中心，陜西 漢中 723001)

大腸桿菌外膜蛋白OmpC的生物信息學(xué)分析及表位多肽疫苗的重組預(yù)測

俱 雄1，3，黨亞鋒1，2，劉 祥1,3，丁 銳1,3，陳 琛1,3，馮自立1,3，張辰露1,3

(1.陜西理工大學(xué)中德天然產(chǎn)物研究所，陜西 漢中 723001； 2.漢中市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心, 陜西 漢中 723000；3.陜西省天麻山茱萸工程技術(shù)研究中心，陜西 漢中 723001)

為設(shè)計(jì)大腸桿菌外膜蛋白OmpC的表位多肽重組疫苗，進(jìn)一步提高OmpC蛋白的免疫效果，通過生物信息學(xué)軟件對OmpC蛋白的進(jìn)化關(guān)系、高級結(jié)構(gòu)與細(xì)胞表位進(jìn)行分析。結(jié)果表明，大腸桿菌、沙門傷寒菌 、肺炎克雷伯菌，這3種細(xì)菌具有較高同源性，OmpC蛋白可能對這3種菌株的感染起到交叉免疫保護(hù)作用。OmpC為親水性蛋白，1～21位氨基酸為信號肽位置，無跨膜結(jié)構(gòu)并定位于細(xì)胞膜外；OmpC二級結(jié)構(gòu)中含無規(guī)則卷曲43.05%，a-螺旋16.08 %，β-轉(zhuǎn)角0 %，β-片層40.87 %。OmpC蛋白可能存在5個(gè)優(yōu)勢B細(xì)胞表位，1個(gè)CTL表位，1個(gè)Th細(xì)胞表位；并重組拼接獲得抗原性較好的OmpC蛋白表位多肽。

大腸桿菌；OmpC蛋白；表位疫苗；抗原分析

大腸桿菌為革蘭氏陰性菌，廣泛存在于自然界中，可經(jīng)口腔進(jìn)入消化道，感染人類和動(dòng)物腸道，導(dǎo)致腹瀉和敗血癥[1]，是一種重要的人畜共患病源菌[3]。尤其是大腸桿菌誘發(fā)的奶牛乳房炎[2]，嚴(yán)重影響奶制品質(zhì)量，給奶制品業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。目前，針對大腸桿菌感染的防治主要是利用抗生素，伴隨著抗生素的大量使用，難免導(dǎo)致藥物殘留影響奶制品品質(zhì)，以及耐藥菌株的產(chǎn)生[4-5]。因此，有必要提出一種新的方法治療大腸桿菌疾病。研究發(fā)現(xiàn)大腸桿菌抗原性較好的蛋白主要有OmpC蛋白[6]、OmpA蛋白[7]、OmpT蛋白[8]、OmpF蛋白[9]、OmpW蛋白[10]等，尤其是OmpC蛋白具有很好的免疫保護(hù)作用，可以激發(fā)機(jī)體的體液免疫和細(xì)胞免疫，能有效抵抗大腸桿菌對機(jī)體的感染[11]，是一種很好的候選疫苗蛋白。本研究通過生物信息學(xué)方法，對大腸桿菌OmpC蛋白進(jìn)行進(jìn)化關(guān)系、理化性質(zhì)、高級結(jié)構(gòu)，以及細(xì)胞表位進(jìn)行分析，并設(shè)計(jì)重組表位多肽疫苗，以期進(jìn)一步提高OmpC蛋白的免疫作用，為OmpC表位疫苗的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌OmpC氨基酸序列來源于NCBI網(wǎng)站公布，登陸號: ADU34074.2，序列如下：MKVKVLSLLVPALLVAGAANAAEVYNKDGNKLDLYGKVD-GLHYFSDDKSVDGDQTYMRLGFKGETQVTDQLTG-YGQWEYQIQGNSAENENNSWTRVAFAGLKFQDV-GSFDYGRNYGVVYDVTSWTDVLPEFGGDTYGSDNFMQQRGNGFATYRNTDFFGLVDGLNFAVQYQGK-NGSVSGEGMTNNGRDALRQNGDGVGGSITYDYEGFGIGGAISSSKRTDAQNTAAYIGNGDRAETYTGGL-KYDANNIYLAAQYTQTYNATRVGSLGWANKAQN-FEAVAQYQFDFGLRPSVAYLQSKGKNLGTIGTRNYDDEDILKYVDVGATYYFNKNMSTYVDYKINLLDD-NQFTRDAGINTDNIVALGLVYQF。

1.2 方法

1.2.1 進(jìn)化關(guān)系分析 依據(jù)NCBI網(wǎng)站公布的不同菌株OmpC蛋白序列，利用DNAMAN軟件進(jìn)行同源性分析，并采用MEGA軟件構(gòu)建不同菌株的系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.2 理化性質(zhì)分析 采用ProtParam軟件對大腸桿菌OmpC蛋白進(jìn)行親水性、等電點(diǎn)、氨基酸數(shù)、穩(wěn)定性、半衰期進(jìn)行預(yù)測分析，利用ProtScale analysis獲得親水性圖譜。

1.2.3 信號肽、跨膜結(jié)構(gòu)分析 利用Signal P 4.1和TMHMM v. 2.0軟件分別對OmpC進(jìn)行信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測。

1.2.4 二級、三級結(jié)構(gòu)預(yù)測 通過SOPMA和SWISS在線預(yù)測軟件，對大腸桿菌OmpC蛋白分別進(jìn)行二級、三級結(jié)構(gòu)預(yù)測。

1.2.5 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析 采用String蛋白相互作用預(yù)測網(wǎng)站，預(yù)測大腸桿菌OmpC與其他蛋白的相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)。

1.2.6 細(xì)胞表位分析 利用BepiPred 1.0b和ABCpred 2種方法對大腸桿菌OmpC蛋白進(jìn)行B細(xì)胞表位預(yù)測，綜合2種方法的共同序列，獲得B細(xì)胞表位肽段。通過人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)法ComPred和Peptide對大腸桿菌OmpC分別進(jìn)行CTL表位、Th表位預(yù)測。

1.2.7 串聯(lián)表位重組 將預(yù)測獲得的B/T細(xì)胞表位按照B細(xì)胞表位、CTL細(xì)胞表位及Th細(xì)胞表位順序進(jìn)行編號，各個(gè)表位間以4個(gè)甘氨酸(GGGG)進(jìn)行柔性分割，然后利用DNAstar軟件對獲得的B/T表位肽段進(jìn)行不同排列組合優(yōu)化，找出抗原性好的排列組合作為最終的重組表位多肽。

2 結(jié)果與分析

2.1 大腸桿菌OmpC蛋白進(jìn)化關(guān)系分析

通過DNAMAN軟件對不同菌株的OmpC蛋白進(jìn)行同源性分析(如圖1)，發(fā)現(xiàn)大腸桿菌、沙門傷寒菌、肺炎克雷伯菌3種菌株的親緣關(guān)系更近。利用MEGA軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(如圖2)，可見大腸桿菌、沙門傷寒菌 、肺炎克雷伯菌進(jìn)化距離都小于0.1，親緣關(guān)系相對于其他菌株更近。因而，大腸桿菌、沙門傷寒菌 、肺炎克雷伯菌這3種細(xì)菌的OmpC蛋白序列具有較高同源性，其產(chǎn)生的抗體可能對這3種菌株的感染起到交叉免疫保護(hù)作用。

2.2 大腸桿菌OmpC理化性質(zhì)分析

通過ProtParam在線預(yù)測軟件對OmpC進(jìn)行理化性質(zhì)預(yù)測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)OmpC相對分子質(zhì)量為40 371.1，等電點(diǎn)4.58，半衰期均為30 h，脂肪族系數(shù)67.77；蛋白穩(wěn)定系數(shù)12.26，為穩(wěn)定蛋白；平均疏水性均-0.511，為親水性蛋白(圖3)。

2.3 大腸桿菌OmpC信號肽及跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測

采用Signal P 4.1軟件對OmpC進(jìn)行信號肽預(yù)測(圖4)，結(jié)果顯示1～21多肽可能為信號肽序列(圖4-A)。通過TMHMM v. 2.0軟件進(jìn)行跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測，發(fā)現(xiàn)OmpC位于細(xì)胞膜外；1～23位氨基酸跨膜結(jié)構(gòu)可信度值為0.26；而1～21位為信號肽序列，可能被剪切。因此可推測出OmpC無跨膜結(jié)構(gòu)。

圖1 OmpC蛋白氨基酸序列同源性分析Fig.1 Homology analysis for amino acid sequence of OmpC

圖2 大腸桿菌OmpC系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree of E.coli OmpC protein

圖3 大腸桿菌OmpC蛋白親水性分析Fig.3 Hydrophilcity analysis of E.coli OmpC protein

2.4 大腸桿菌OmpC蛋白二級、三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

大腸桿菌OmpC蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測采用SOPMA方法，預(yù)測可信度為82%， a-螺旋氨基酸所占比例為16.08 %，β-轉(zhuǎn)角為0.00%，無規(guī)則卷曲為43.05 %，β-片層為40.87 %(圖5)，表明OmpC蛋白大部分氨基酸序列呈無規(guī)則卷曲狀態(tài)，為細(xì)胞表位的產(chǎn)生奠定基礎(chǔ)。

通過SWISS在線預(yù)測軟件對大腸桿菌OmpC三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析(圖6-A)，模型覆蓋率為100%，波形圖穩(wěn)定，可靠性較高(圖6-B)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)OmpC三維結(jié)構(gòu)與二級結(jié)構(gòu)具有一致性。

圖4 大腸桿菌OmpC信號肽及跨膜區(qū)的預(yù)測Fig.4 The prediction of signal peptide and transmembrane structure of E.coli OmpC protein

c：無規(guī)則卷曲；e：β-片層；h：α-螺旋； t：β-轉(zhuǎn)角c: Random coil; e: Extended strand; h: Alpha helix; t: Beta turn

圖6 大腸桿菌OmpC三級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.6 Tertiary structure prediction of E.coli OmpC protein

2.5 大腸桿菌OmpC蛋白作用網(wǎng)絡(luò)分析

通過String方法對大腸桿菌OmpC進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果如圖7所示。10種蛋白與大腸桿菌OmpC存在相互作用，其中DegP蛋白、OmpA蛋白及OmpR蛋白與OmpC蛋白作用更為緊密。

圖7 大腸桿菌OmpC相互作用蛋白預(yù)測Fig.7 Protein-protein interaction prediction of E.coli OmpC protein

2.6 大腸桿菌OmpC蛋白B細(xì)胞表位預(yù)測

通過BepiPred 1.0b方法預(yù)測大腸桿菌OmpC蛋白B細(xì)胞表位(表1)。通過人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)ABCpred方法，對大腸桿菌OmpC進(jìn)行B細(xì)胞表位預(yù)測(表2)。綜合2種方案的共同表位序列，最終獲得OmpC蛋白B細(xì)胞優(yōu)勢表位區(qū)段為：74-90，129-144，146-152，178-194，213-227。

2.7 大腸桿菌 OmpC蛋白T細(xì)胞表位預(yù)測

2.7.1 OmpC蛋白CTL表位預(yù)測 通過人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)法軟件ComPred對大腸桿菌OmpC進(jìn)行CTL表位預(yù)測，選用HLA-A2，HLA-A*0201，HLA-A*0202，HLA-A*0203，HLA-A*0205 不同結(jié)合肽類型(表3)。綜合共同序列分析，獲得OmpC的CTL表位為291-299的GLRPSLAYL。

2.7.2 OmpC蛋白Th表位預(yù)測 使用軟件Peptide對大腸桿菌OmpC進(jìn)行Th表位預(yù)測，選用DRB1-0101、DRB1-0102、DRB1-0301 3種不同多肽類型，結(jié)果如表4所示。綜合共有肽段，分析獲得OmpC的Th表位為212-220的FGIGGAISS。

表1 BepiPred 1.0b預(yù)測大腸桿菌 OmpC 蛋白 B 細(xì)胞表位的肽段位置Table 1 B cellepitopes for E.coli OmpC protein by BepiPred 1.0b method

表2 ABCpred預(yù)測大腸桿菌OmpC蛋白B細(xì)胞表位的肽段位置Table 2 B cellepitopes for E.coli OmpC protein by ABCpred method

表3 大腸桿菌OmpC CTL表位預(yù)測Table 3 The CTL epitope prediction of OmpC in E.coli

2.8 大腸桿菌串聯(lián)表位的重組

對獲得B/T細(xì)胞表位進(jìn)行順序編號，表位間加入4個(gè)甘氨酸(GGGG)作為柔性片段，通過DNAStar軟件優(yōu)化不同排列組合，最終獲得抗原性較好的串聯(lián)表位順序?yàn)椋篹pitope 5-epitope 2-epitope 4-epitope 7-epitope 6-epitope 1-epitope 3，如圖8所示。轉(zhuǎn)化成氨基酸序列為：AISSSKRTDAQNTAAGGGGYDVTSWTDVLPEFGGDGGGGVQ-YQGKNGSVSGEGMTNGGGGFGIGGAISSGGGGGL-RPSLAYLGGGGETQVTDQLTGYGQWEYQGGGGYG-SDNFM(下劃線為柔性片段)。翻譯的核酸序列為：GCGATCTCCAGCTCCAAACGTACTGATGCTCAGAACACCGCTGGGTGGCGGTGGCCCAGAATTCGGTGG-CGACACTTACGGTTCTGACAACTTCATGCAGCGGTGGCGGTGGCAGCGGCGAAGGCATGACCAACAACGGTCGTGATGCTCTGCGTCAGAACGGGTGGCGGTGGCGGTGCGATCTCCAGCTCCAAACGTAGGTGGCGGTGGCTCTGTAGCATACCTGCAGTCTAAAGGGTGGCGGTGGCTACGGCCAGTGGGAATATCAGATCCAGGG-CAACAGCGCTGAAAACGAAAGGTGGCGGTGGCGGTAACGGCTTCGCGACCT(下劃線為柔性片段核酸序列)。

表4 大腸桿菌OmpC Th抗原表位預(yù)測Table 4 The Th epitopes prediction of E.coli OmpC protein

圖8 重組多肽抗原指數(shù)分析Fig.8 Antigenic index of recombination polypeptide

3 結(jié)論與討論

生物信息學(xué)可實(shí)現(xiàn)蛋白進(jìn)化關(guān)系、理化性質(zhì)與高級結(jié)構(gòu)的準(zhǔn)確預(yù)測[12]，尤其對蛋白細(xì)胞表位的預(yù)測、設(shè)計(jì)，可減少試驗(yàn)的盲目性，提高試驗(yàn)效率，為重組表位疫苗的研制提供理論指導(dǎo)[12]。本研究通過生物信息學(xué)方法，對大腸桿菌OmpC蛋白的進(jìn)化關(guān)系、理化性質(zhì)、高級結(jié)構(gòu)、相互作用網(wǎng)絡(luò)與細(xì)胞表位，以及串聯(lián)重組表位進(jìn)行預(yù)測。遺傳進(jìn)化關(guān)系顯示大腸桿菌與沙門傷寒菌，肺炎克雷伯菌親緣關(guān)系最近，OmpC蛋白對這3種菌的感染可能存在交叉免疫保護(hù)作用；通過理化性質(zhì)預(yù)測得到OmpC為親水性蛋白，無跨膜結(jié)構(gòu)，存在信號肽序列，定位于細(xì)胞膜外，為分泌性蛋白。OmpC蛋白的高級結(jié)構(gòu)預(yù)測發(fā)現(xiàn)無規(guī)則卷曲占有較高比例，而無規(guī)則卷曲易于產(chǎn)生盤旋、扭曲，暴露于蛋白外層，常含有優(yōu)勢的細(xì)胞抗原表位[13]，這為細(xì)胞表位預(yù)測提供了依據(jù)。

目前，預(yù)測蛋白 B 細(xì)胞表位的常用方法有BepiPred 和ABCpred。BepiPred 方法主要是利用隱形馬爾可夫模型以及氨基酸的特定性質(zhì)進(jìn)行線性表位的預(yù)測[14]; ABCpred軟件主要是基于人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)算法，準(zhǔn)確率較高[15]。曾少靈等[16]采用ABCpred 方法對小反芻獸疫病毒N蛋白羊膿進(jìn)行了B細(xì)胞表位預(yù)測，閆晶晶等[17]通過 BepiPred 和ABCpred 2種方案對人巨細(xì)胞病毒包膜糖蛋白進(jìn)了B細(xì)胞表位預(yù)測。本研究結(jié)合BepiPred 和 ABCpred 2種方案，對OmpC蛋白進(jìn)行B細(xì)胞表位預(yù)測，并利用 OmpC 蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果，選取抗原性較好的無規(guī)則卷曲位置作為B細(xì)胞表位序列，最終獲得OmpC蛋白B細(xì)胞表位為: 74-90，129-144，146-152，178-194，213-227。這為串聯(lián)表位疫苗的設(shè)計(jì)提供了理論依據(jù)。

CTL 表位預(yù)測的方法較多，常見方法包含IEDB、SYFPEITHI和IMTECH 等[18-19]。時(shí)冉冉等[20]利用在線軟件，采用人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)法成功預(yù)測腫瘤抗原PIWIL2蛋白 CTL 表位。本研究采用人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)法及量化矩陣法對 OmpC 蛋白的 CTL 表位預(yù)測。結(jié)果獲得 OmpC 蛋白CTL 表位為: 291-299的GLRPSLAYL。這些 OmpC 蛋白的CTL表位可能與 MHC-Ⅰ類分子相結(jié)合，經(jīng)過抗原呈遞，從而激活CTL 細(xì)胞免疫作用[20]。

Th 表位預(yù)測方法在細(xì)菌蛋白[19]、病毒蛋白[21]上均有研究。本研究通過選取3 類不同等位基因的Th表位進(jìn)行預(yù)測，獲得OmpC 蛋白的 Th 表位為：212-220的FGIGGAISS。這些 OmpC蛋白的表位序列可能與 MHC -Ⅱ類分子結(jié)合，進(jìn)一步增強(qiáng)機(jī)體的免疫反應(yīng)[22]。

表位疫苗是近年來發(fā)展起來的一種新型疫苗，與傳統(tǒng)疫苗相比具有能被多種遺傳背景的MHC分子識別優(yōu)勢[23]，在HIV-1病毒[24]、結(jié)核桿菌[25]、黑色素瘤[26]、人乳頭瘤病毒[27]、乙型肝炎病毒[28]等病原菌上均有研究。然而，重組表位疫苗的開發(fā)還處于初始階段，且存在諸多問題需要解決，如：更加有效的表位篩選方法的建立，表位疫苗的開發(fā)等。本研究通過成熟的蛋白B/T細(xì)胞表位預(yù)測方法，設(shè)計(jì)了大腸桿菌OmpC蛋白表位疫苗，而表位疫苗的免疫學(xué)功能則有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

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(責(zé)任編輯：朱秀英)

Bioinformatic analysis ofE.coliOmpC and recombinant prediction of epitope peptide vaccine

JU Xiong1，3, DANG Yafeng1，2, LIU Xiang1,3, DING Rui1,3, CHEN Chen1,3, FENG Zili1,3, ZHANG Chenlu1,3

(1.Chinese-German Joint Institute for Natural Product Research, Shanxi Sci-Tech University,Hanzhong 723001, China; 2. The Food and Drug Inspection and Testing Center of Hanzhong City, Hanzhong 723000, China; 3.Shanxi Engineering Research Center for Tall Gastrodia Tuber and Medical Dogwood, Hanzhong 723001, China)

In order to improve the immune effect of OmpC (outer membrane protein C) protein, the recombinant vaccine ofEscherichiacoliOmpC epitope polypeptide was designed. By bioinformatic software, the evolution relationship, advanced structure and cell epitopes of OmpC protein were analyzed. The results showed that the OmpC protein sequences ofEscherichiacoli,Salmonella,Klebsiellapneumoniae, had high homology, and OmpC antibodies might play a cross immune protective effect for these strains. OmpC was a hydrophilic protein, 1～21 amino acids of OmpC was signal peptide sequence, and had not transmembrane structure being located outside the cell membrane.The OmpC secondary structure contained 43.05% of random coil,16.08% of alpha helix,0% of beta turn, and 40.87% of extended strand,respectively. OmpC might have 5 B-cell epitopes, 1 CTL epitopes, and 1 Th epitopes, and OmpC protein epitope vaccine with good immunogenicity was obtained by recombinant splicing.

Escherichiacoli; OmpC protein; epitope vaccine; antigenic analysis

2016-05-13

陜西省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新與攻關(guān)項(xiàng)目(2016NY-088)；陜西理工大學(xué)校級科研項(xiàng)目( SLGKY16-13)

俱 雄(1990-)，男，陜西咸陽人，碩士研究生，主要從事蛋白質(zhì)組學(xué)與免疫學(xué)研究。

劉 祥(1983-)，男，安徽合肥人，副教授，博士，碩士生導(dǎo)師。

1000-2340(2017)01-0094-07

Q816

A