三氯卡班可以影響腎小管上皮細(xì)胞的屏障功能

楊峰，王京真，劉文華,#

1. 汕頭大學(xué)海洋生物研究所 廣東省海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，汕頭 5150632. 欽州學(xué)院，欽州 535000

三氯卡班可以影響腎小管上皮細(xì)胞的屏障功能

楊峰1，王京真2,*，劉文華1,#

1. 汕頭大學(xué)海洋生物研究所 廣東省海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，汕頭 5150632. 欽州學(xué)院，欽州 535000

三氯卡班(TCC)是一種被廣泛應(yīng)用于個(gè)人護(hù)理用品中的廣譜型親脂性殺菌劑，已在多種環(huán)境介質(zhì)和生物體中檢出。因其潛在的環(huán)境蓄積、生物累積和生物毒性效應(yīng)，日益受到學(xué)者們的關(guān)注。借助TCC對(duì)NRK-52E(大鼠腎小管上皮細(xì)胞)的毒性暴露實(shí)驗(yàn)，通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞活力、以及與跨膜電阻和緊密連接相關(guān)的連接黏附分子1(JAM-1， junctional adhesion molecule 1)的蛋白表達(dá)水平，研究了TCC潛在的腎臟毒性效應(yīng)。結(jié)果顯示，10 μmol·L-1TCC處理48 h時(shí)培養(yǎng)細(xì)胞呈現(xiàn)不規(guī)則的集落；10 μmol·L-1和20 μmol·L-1TCC處理NRK-52E 24 h、48 h和72 h后可以顯著抑制細(xì)胞生長(zhǎng)；3.57 μmol·L-1TCC(生長(zhǎng)抑制的48 h-IC20)處理NRK-52E 48 h可以顯著抑制細(xì)胞間緊密連接蛋白JAM-1的表達(dá)量，并降低跨膜電阻，影響腎臟的屏障功能。本研究的結(jié)果能夠?yàn)檫M(jìn)一步揭示TCC對(duì)動(dòng)物的毒害機(jī)制、評(píng)估其對(duì)動(dòng)物的健康風(fēng)險(xiǎn)提供數(shù)據(jù)支持。

TCC；NRK-52E細(xì)胞；細(xì)胞毒性；屏障功能

三氯卡班(1-(4-chlorophenyl)-3-(3,4-dichlorophenyl) urea, triclocarban, TCC)是一種廣泛運(yùn)用于個(gè)人護(hù)理用品中的廣譜型親脂性殺菌劑[1-3]，常添加在人們?nèi)粘Ｊ褂玫姆试?、洗面奶、沐浴露、美容化妝用品和牙膏中[4-5]。因?yàn)檩^大的環(huán)境輸入量以及其具有環(huán)境蓄積、生物累積和生物毒性等特征，已成為目前人們最為關(guān)心的污染物之一[6]。

20世紀(jì)70年代，歐盟基于毒理動(dòng)力學(xué)的研究將TCC認(rèn)定為安全、無(wú)毒的殺菌劑，可添加于人們?nèi)粘５淖o(hù)理用品中(personal care products, PCP)[7]。相比于毒性研究較為深入的三氯生(TCS)，TCC一直被認(rèn)為是較好的替代劑。由此TCC的使用量急劇增加。在化妝用品中TCC的含量可達(dá)0.2%；在抗菌皂中，它的使用量一般高于1.5%；在洗滌類用品中的允許濃度最高可達(dá)2%[2]。有報(bào)道顯示，TCC在美國(guó)的消耗量每年可達(dá)1百萬(wàn)磅[1-2]，而在中國(guó)的年消耗量可高達(dá)1 220 t[8]。隨著TCC的大量使用，其在環(huán)境中的排放量逐年增加；又因其較為穩(wěn)定的理化屬性和較高的環(huán)境持久性(在沉積物、土壤、水和空氣中的半衰期分別為540、120、60和0.75 d)[7,9]，目前已成為水環(huán)境中最常檢測(cè)到的污染物之一。其在北美、歐洲和亞洲污水中的濃度可以達(dá)到μg·L-1級(jí)[9-10]，在中國(guó)五大河(遼河、海河、黃河、珠江和東江)的表層水和沉積物中的檢出率為100%，而且在表層水和沉積物中的濃度高達(dá)338 ng·L-1和2 723 ng·g-1[8]，表明TCC在中國(guó)水體環(huán)境中的污染檢測(cè)和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估已成為環(huán)境工作者所面臨的重要問(wèn)題之一。

環(huán)境中大量的TCC(尤其是水環(huán)境中的TCC)對(duì)人與水生動(dòng)物具有潛在的危害性。最新的研究表明TCC可以通過(guò)皮膚、口腔黏膜和胃腸道被人體吸收[11-13]。特別是在一次全身洗浴中會(huì)有0.39%至0.6%(約0.54 mg)的TCC會(huì)被吸收[13]，而后約21%隨尿代謝排出體外[7,13]。因此腎臟有可能成為TCC毒性作用的靶器官，對(duì)其進(jìn)行毒性效應(yīng)的評(píng)估具有重要價(jià)值。

連接黏附分子1(JAM-1, junctional adhesion molecule 1)是緊密連接的重要組分，它參與旁通透性、細(xì)胞極性、黏附、遷移和血管生成等重要過(guò)程[14-15]。急性腎損傷、多囊腎、腎結(jié)石[16]和腎癌[17]等多種腎疾病與緊密連接的功能紊亂有關(guān)。因此作為緊密連接重要組分的JAM-1對(duì)腎功能的正常發(fā)揮有重要作用。

目前，大多數(shù)關(guān)于TCC的研究主要集中在它的分布、生物降解和內(nèi)分泌干擾等方面。TCC腎毒性的研究還未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)TCC對(duì)NRK-52E細(xì)胞的毒性暴露實(shí)驗(yàn)，結(jié)合顯微鏡下的細(xì)胞形態(tài)觀察，并檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)、跨上皮電阻以及與腎臟功能密切相關(guān)的JAM-1蛋白水平，首次借助體外模型證實(shí)了TCC可以改變NRK-52E的屏障功能，可為進(jìn)一步開(kāi)展體內(nèi)實(shí)驗(yàn)、綜合評(píng)價(jià)TCC的腎臟毒性效應(yīng)提供科學(xué)支持。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

大鼠腎小管上皮細(xì)胞(NRK-52E)由中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)提供。細(xì)胞培養(yǎng)基為DMEM，添加5%(V/V)的胎牛血清，1×雙抗(100 U·mL的青霉素，100 μg·mL的鏈霉素)；在37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)。

儀器：艾本德170R二氧化碳培養(yǎng)箱(Eppendorf，德國(guó))；SW-CJ-IF型凈化工作臺(tái)(蘇州安泰)；Infinite M200 PRO酶標(biāo)儀(Tecan，瑞士)。

試劑：三氯卡班(TCC，純度≥ 99%)、二甲基亞砜(DMSO，純度≥ 99.5%)、DMEM培養(yǎng)基，均購(gòu)自美國(guó)Sigma；CCK-8和DCFH-DA熒光探針購(gòu)自中國(guó)碧云天；胎牛血清購(gòu)自美國(guó)賽默飛。

1.2 細(xì)胞形態(tài)觀察

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的NRK-52E細(xì)胞接種于12孔板中。待24 h細(xì)胞完全貼壁，吸去上清，用10 μmol·L-1TCC處理48 h。用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.3 CCK-8法測(cè)定細(xì)胞活性

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的NRK-52E細(xì)胞，接種于96孔板。待24 h細(xì)胞完全貼壁，吸去上清，然后分別加入0.1 μmol·L-1、1 μmol·L-1、10 μmol·L-1和20 μmol·L-1的TCC暴露處理[18-21]；對(duì)照組添加等體積的體積分?jǐn)?shù)為0.1%的DMSO。暴露處理24 h、48 h和72 h。每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次。每孔加入10 μL的CCK-8溶液，在培養(yǎng)箱中孵育1 h，用酶標(biāo)儀檢測(cè)在450 nm處的吸光值。

1.4 跨上皮細(xì)胞電阻檢測(cè)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的NRK-52E細(xì)胞，接種于transwells(0.4 μm, Corning Life Sciences)，使用Millipore Millicell-ERS來(lái)測(cè)量跨膜電阻，當(dāng)電阻穩(wěn)定時(shí)，用3.57 μmol·L-1(20%的生長(zhǎng)抑制效應(yīng)濃度，IC20)TCC暴露處理48 h；對(duì)照組添加等體積的體積分?jǐn)?shù)為0.1%的DMSO；空白組無(wú)細(xì)胞。暴露48 h，再次測(cè)量跨膜電阻，重復(fù)3次，細(xì)胞單層跨膜電阻=(實(shí)測(cè)-空白)×transwells有效膜面積，單位用Ω·cm2表示。

1.5 Western blot檢測(cè)JAM-1的表達(dá)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的NRK-52E細(xì)胞，接種于12孔板中，待24 h細(xì)胞完全貼壁，吸去上清，用IC203.57 μmol·L-1TCC(排除高濃度TCC導(dǎo)致細(xì)胞死亡對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響)暴露處理；對(duì)照組添加等體積的體積分?jǐn)?shù)為0.1%的DMSO。暴露48 h，提取總蛋白，然后進(jìn)行電泳、轉(zhuǎn)膜、孵育抗體。一抗(JAM-1和GAPDH)4 ℃孵育過(guò)夜，LEC化學(xué)發(fā)光顯色。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用SSPS 21.0軟件(SPSS Inc.)對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，來(lái)檢驗(yàn)對(duì)照組和藥物暴露組之間的差異(P < 0.05表示顯著差異)。

2 結(jié)果(Results)

2.1 TCC對(duì)NRK-52E細(xì)胞形態(tài)的影響

通過(guò)倒置顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)對(duì)照組NRK-52E細(xì)胞密度相對(duì)較高，細(xì)胞邊緣光滑清晰而且貼壁性好；而處理組(10 μmol·L-1TCC處理48 h時(shí))細(xì)胞呈現(xiàn)不規(guī)則的集落如圖1所示。

2.2 TCC對(duì)NRK-52E細(xì)胞存活率的影響

CCK-8是一種廣泛應(yīng)用于細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性檢測(cè)的快速和靈敏的方法。如圖2所示，NRK-52E在TCC作用24 h、48 h和72 h后，細(xì)胞存活率隨著濃度增加而降低，10和20 μmol·L-1處理組存在顯著差異(P < 0.05)，而且同一濃度下隨著暴露時(shí)間的增加細(xì)胞存活率下降，呈現(xiàn)顯著的時(shí)間-劑量效應(yīng)關(guān)系。利用GraphPad Prism 5.0軟件擬合計(jì)算24 h、48 h和72 h的IC50和IC20。IC50分別為18.53、14.00和11.06 μmol·L-1；IC20分別為5.31、3.57和2.54 μmol·L-1。

2.3 TCC可以影響NRK-52E的屏障功能

NRK-52E的屏障功能可以通過(guò)跨膜電阻來(lái)評(píng)估。如圖3所示，3.57 μmol·L-1TCC暴露可以顯著降低跨膜電阻(P < 0.05)。

圖1 三氯卡班(TCC)對(duì)NRK-52E細(xì)胞形態(tài)的影響注：A為正常對(duì)照；B為10 μmol·L-1 TCC處理48 h。Fig. 1 Effect of triclocarban (TCC) on morphology of NRK-52E cellsNote: A- normal cultured； B- 10 μmol·L-1 TCC treatment for 48 h.

圖2 TCC對(duì)NRK-52E細(xì)胞具有生長(zhǎng)抑制作用Fig. 2 Triclocarban inhibits the growth of NRK-52E cells

圖3 TCC對(duì)NRK-52E跨膜電阻(TER)的影響Fig. 3 TCC alters transepithelial electrical resistance (TER) in NRK-52E

2.4 TCC可以降低NRK-52E細(xì)胞基因JAM-1的蛋白表達(dá)

如圖4所示，緊密連接分子JAM-1在3.57 μmol·L-1TCC處理48 h后表達(dá)量顯著降低(P < 0.05)。

圖4 通過(guò)Western blot檢測(cè)TCC對(duì)NRK-52E細(xì)胞JAM-1表達(dá)的影響Fig. 4 Effects of TCC on the expression of JAM-1 in NRK-52E cells

3 討論(Discussion)

TCC是一種廣泛運(yùn)用于個(gè)人護(hù)理用品中的廣譜型親脂性殺菌劑[1-3]，在被人體或水生動(dòng)物吸收[11-12,22]并排泄出體外[7,13]的過(guò)程中可能引發(fā)毒性作用。然而目前相關(guān)TCC的毒理學(xué)研究較多集中在其內(nèi)分泌干擾特性上[19]，對(duì)動(dòng)物體危害的其他方面報(bào)道相對(duì)較少。因此，本研究主要通過(guò)利用NRK-52E細(xì)胞探討了TCC對(duì)腎臟可能引起的毒性效應(yīng)。

腎小管上皮細(xì)胞的屏障功能對(duì)腎發(fā)揮正常生理功能有重要作用[23]，我們通過(guò)跨膜電阻來(lái)評(píng)估腎的屏障功能，可以發(fā)現(xiàn)TCC(IC20的3.57 μmol·L-1)可以明顯降低NRK-52E細(xì)胞跨膜電阻(P < 0.05)。有文獻(xiàn)報(bào)道改變細(xì)胞間的緊密連接可以改變腎小管上皮的屏障功能，進(jìn)而誘發(fā)腎臟疾病[23]。本研究中TCC(3.57 μmolL-1)染毒NRK-52E 48 h，可以抑制細(xì)胞間緊密連接蛋白JAM-1的表達(dá)，推測(cè)TCC可能通過(guò)抑制JAM-1的表達(dá)進(jìn)而影響腎臟的屏障功能。

與此同時(shí)，細(xì)胞間的連接能促進(jìn)同型細(xì)胞間的黏附而且可以轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)內(nèi)信號(hào)，這些信號(hào)可以調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和凋亡。JAM-1是一種跨膜的緊密連接蛋白，敲除JAM-1后可以抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)，并顯著增加細(xì)胞的凋亡[24]，這與本研究中的CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。

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◆

Triclocarban Alters Barrier Function in NRK-52E Cells

Yang Feng1, Wang Jingzhen2,*, Liu Wenhua1,#

1. Marine Biology Institute, Shantou University, Guangdong Provincial Key Laboratory of Marine Biotechnology, Shantou 515063, China2. Qinzhou University, Qinzhou 535000, China

24 May 2016 accepted 5 August 2016

Triclocarban (TCC) is a broad-spectrum, lipophilic, antimicrobial additive that is largely applied in a variety of personal care products (PCPs). Now, this chemical has been detected in various environmental matrices including sediments, fishes and water. Because of its potential accumulation capacity and biological toxicity, TCC is now increasingly drawing the attention of the researchers. In this study, the potential renal toxicity was evaluated using NRK-52E cells, and we analyzed cell viability, transepithelial electrical resistance (TER) and the protein levels of junctional adhesion molecule 1 (JAM-1) which is closely related to cellular tight junction. The results showed that irregular colonies occurred after exposing NRK-52E cells to 10 μmol·L-1TCC for 48 h, and the cell growth was also significantly inhibited in a dose- and time-dependent manners. Also, the TER and the protein levels of JAM-1 decreased after treatment with 3.57 μmol·L-1TCC for 48 h, implying the potential adverse effect of TCC on the barrier function of the kidney. Therefore, this study illustrated the in vitro nephrotoxicity of TCC, and the results can provide evidences for future study on toxicity mechanism of TCC and the possible health assessment on animals.

triclocarban; NRK-52E cell; cytotoxicity; barrier of kidney

國(guó)家自然科學(xué)基金(41306180，41176155)；教育部高等學(xué)校博士點(diǎn)科研基金項(xiàng)目(20134402110005)；海洋公益性行業(yè)科研專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目(201405007)；廣西北部灣海洋生物多樣性養(yǎng)護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自主項(xiàng)目(2016ZC02)

楊峰(1989-)，男，碩士研究生，研究方向?yàn)榉肿佣纠韺W(xué)，E-mail: yangfeng20082407@126.com；

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: wangjingzhen-1@163.com；

10.7524/AJE.1673-5897.20160524003

2016-05-24 錄用日期：2016-08-05

1673-5897(2017)2-177-05

X171.5

A

王京真(1982-)，男，博士后，研究方向?yàn)轶w外毒理學(xué)、生態(tài)和演化、保護(hù)生物學(xué)。

共同通訊作者簡(jiǎn)介：劉文華(1970-)，男，教授，研究方向?yàn)樯鷳B(tài)毒理學(xué)、海洋哺乳動(dòng)物保護(hù)生物學(xué)。

# 共同通訊作者(Co-corresponding author)， E-mail: whliu@stu.edu.cn；

楊峰， 王京真， 劉文華. 三氯卡班可以影響腎小管上皮細(xì)胞的屏障功能[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報(bào)，2017, 12(2): 177-181

Yang F, Wang J Z, Liu W H. Triclocarban alters barrier function in NRK-52E cells [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2017, 12(2): 177-181 (in Chinese)