苦丁茶甲醇提取物對過氧化氫誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞炎癥的影響

鐘 韜，柳賢德

（海南大學(xué)動物醫(yī)學(xué)專業(yè)，海南?？?70228）

苦丁茶甲醇提取物對過氧化氫誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞炎癥的影響

鐘 韜，*柳賢德

（海南大學(xué)動物醫(yī)學(xué)專業(yè)，海南?？?70228）

通過苦丁茶甲醇提取物和綠原酸對過氧化氫誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞（RAW264.7）的處理，分析苦丁茶提取物和綠原酸對氧化應(yīng)激模型一氧化氮（NO），IL-6及TNF-α的影響。結(jié)果表明，苦丁茶甲醇提取物和綠原酸對巨噬細(xì)胞不產(chǎn)生毒性，但呈劑量依賴性顯著降低過氧化氫（H2O2）誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的NO水平（p＜0.05），并且顯著提高過氧化氫誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的IL-6水平（p＜0.05）和TNF-α水平（p＜0.05）?？喽〔杓状继崛∥锖途G原酸可降低巨噬細(xì)胞的NO來減少其氧化應(yīng)激，但對過氧化氫誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的IL-6和TNF-α顯著提高，似乎與過氧化氫一起促進(jìn)其細(xì)胞凋亡?？喽〔杓状继崛∥锖途G原酸對巨噬細(xì)胞的影響較為復(fù)雜，需要進(jìn)行更進(jìn)一步研究。

苦丁茶；綠原酸；巨噬細(xì)胞；細(xì)胞凋亡

當(dāng)機(jī)體發(fā)生應(yīng)激時會產(chǎn)生過量的活性氧，活性氧的清除不足會產(chǎn)生大量自由基，導(dǎo)致細(xì)胞的氧化性損傷，影響細(xì)胞的正常生理功能。近年來，越來越多的植物提取物被認(rèn)為是外源性的天然自由基清除劑，并開展了各種清除自由基的試驗研究[1]。苦丁茶主要分布于我國南方，性涼、味苦微甘，清熱解毒，治火眼、口疳、乳癰、腫毒、燙傷，具有清涼解熱、利尿等療效，在民間作為一種保健飲料已有2 000年的歷史?，F(xiàn)有的植物化學(xué)分析結(jié)果表明，苦丁茶富含綠原酸，具有明顯的消炎鎮(zhèn)痛、抗氧化作用，可以提高機(jī)體免疫力，增強(qiáng)白細(xì)胞功能[2]。試驗通過苦丁茶甲醇提取物和綠原酸對過氧化氫誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響，分析其NO，IL-6，TNF-α的水平，為苦丁茶的藥理作用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

苦丁茶，老葉烘干后磨粉過篩，甲醇萃取后蒸餾分離，冷凍干燥處理，三蒸水配制的溶液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后于-20℃保存；綠原酸，SIGMA公司提供；H2O2，廣州化學(xué)試劑廠提供；NO，IL-6，TNF-α試劑盒，南京建成生物工程研究所提供；MTT，DMSO，Biotopped公司提供；DMEM培養(yǎng)基、胰酶、小牛血清、抗生素，GIBCO公司提供。

1.2 儀器與設(shè)備

旋轉(zhuǎn)蒸餾儀、電子天平、6/24/96孔細(xì)胞培養(yǎng)板、酶標(biāo)儀、超凈工作臺、細(xì)胞培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡、高速冷凍離心機(jī)。

1.3 試驗方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)基含10%胎牛血清和1%抗生素的DMEM，并置于細(xì)胞培養(yǎng)箱（37℃，5% CO2）。細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)皿底70%～80%時，進(jìn)行傳代到第3代，并開始細(xì)胞試驗。

1.3.2 苦丁茶甲醇提取物和綠原酸對巨噬細(xì)胞存活率的影響

利用不同質(zhì)量濃度的苦丁茶甲醇提取物（0，200，400，800，1 000 μg/mL）和不同質(zhì)量濃度的綠原酸（0，5，10，20，40 μg/mL）對RAW264.7細(xì)胞進(jìn)行處理，并把MTT溶液添加到各個處理組，于波長570 nm處測其吸光度。

1.3.3 苦丁茶甲醇提取物和綠原酸對過氧化氫誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的影響

利用不同質(zhì)量濃度的苦丁茶甲醇提取物（0，200，400，800，1 000 μg/mL）和不同質(zhì)量濃度的綠原酸（0，5，10，20，40 μg/mL）對RAW264.7細(xì)胞預(yù)處理12 h，然后用過氧化氫（H2O2，0.12%）誘導(dǎo)4 h，并收集細(xì)胞培養(yǎng)液，用試劑盒測定NO含量。

1.3.4 苦丁茶甲醇提取物和綠原酸對過氧化氫誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞IL-6和TNF-α的影響

利用不同質(zhì)量濃度的苦丁茶甲醇提取物（0，200，400，800，1 000 μg/mL）和不同質(zhì)量濃度的綠原酸（0，5，10，20，40 μg/mL）處理RAW264.7巨噬細(xì)胞12 h，然后用H2O2（0.12%）誘導(dǎo)4 h，收集細(xì)胞培養(yǎng)液，用試劑盒測定IL-6和TNF-α的水平。

1.4 統(tǒng)計分析

采用SPSS 10.0統(tǒng)計軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，并用GraphPad Prism5作圖。p＜0.05為顯著性差異，p＜0.01為極顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 苦丁茶甲醇提取物和綠原酸對巨噬細(xì)胞存活率的影響

苦丁茶甲醇提取物對巨噬細(xì)胞存活率的影響見圖1，綠原酸對巨噬細(xì)胞存活率的影響見圖2。

圖1 苦丁茶甲醇提取物對巨噬細(xì)胞存活率的影響

由圖1和圖2可知，苦丁茶甲醇提取物（0～1 000 μg/mL）和綠原酸（0～40 μg/mL）在設(shè)定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，不影響RAW264.7細(xì)胞的存活率，表明苦丁茶甲醇提取物和綠原酸對細(xì)胞不產(chǎn)生毒性。

2.2 苦丁茶甲醇提取物和綠原酸對過氧化氫誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞NO的影響

苦丁茶甲醇提取物對H2O2誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞NO的影響見圖3，綠原酸對H2O2誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞NO的影響見圖4。

圖2 綠原酸對巨噬細(xì)胞存活率的影響

圖3 苦丁茶甲醇提取物對H2O2誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞NO的影響

圖4 綠原酸對H2O2誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞NO的影響

由圖3和圖4可知，苦丁茶甲醇提取物和綠原酸顯著降低H2O2誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞的NO含量（p＜0.01），表明苦丁茶甲醇提取物和綠原酸可減少細(xì)胞氧化應(yīng)激。

2.3 苦丁茶甲醇提取物對過氧化氫誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞IL-6和TNF-α的影響

苦丁茶甲醇提取物對H2O2誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞IL-6的影響見圖5，苦丁茶甲醇提取物對H2O2誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞TNF-α的影響見圖6。

由圖5和圖6可知，苦丁茶甲醇提取物和綠原酸顯著增加H2O2誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞的IL-6和TNF-α（p＜0.01），表明苦丁茶甲醇提取物和綠原酸可促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。

圖5 苦丁茶甲醇提取物對H2O2誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞IL-6的影響

圖6 苦丁茶甲醇提取物對H2O2誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞TNF-α的影響

3 討論與結(jié)論

一氧化氮（NO）是具有生物活性的氣體分子，是細(xì)胞間信息傳遞的重要調(diào)節(jié)因子，并介導(dǎo)細(xì)胞免疫和炎癥的功能，NO的過量生成與炎癥的產(chǎn)生具有密切關(guān)系。

結(jié)果表明，苦丁茶提甲醇取物和綠原酸對RAW 264.7細(xì)胞不產(chǎn)生毒性效應(yīng)，且H2O2誘導(dǎo)的NO釋放有抑制作用，呈明顯劑量依賴關(guān)系。但是，苦丁茶甲醇提取物升高了H2O2誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞的TNF-α和IL-6的水平。卞夢瑤等人發(fā)現(xiàn)，生姜油樹脂抑制H2O2誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞的NO釋放同時，通過顯著降低TNF-α和IL-6的水平，降低細(xì)胞凋亡來保護(hù)細(xì)胞。這與試驗結(jié)果差異較大?？喽〔杓状继崛∥飳?xì)胞不具有毒性，而且對NO釋放有抑制作用，但在H2O2誘導(dǎo)下反而促進(jìn)其凋亡[3]，這個過程可能較為復(fù)雜，需要進(jìn)一步的研究。

綜上所述，苦丁茶甲醇提取物富含綠原酸，通過抑制NO釋放，從氧化應(yīng)激中保護(hù)細(xì)胞，為苦丁茶的綜合開發(fā)利用提供依據(jù)。

[1]崔海燕，韓晨露，肖鵬，等.過氧化氫刺激RAW264.7巨噬細(xì)胞促炎細(xì)胞因子和趨化因子基因表達(dá)[J].中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報，2015，30（7）：734-740.

[2]胡宗福，于文利，趙亞平.綠原酸清除活性氧和抗脂質(zhì)過氧化的研究[J].食品科學(xué)，2006，27（2）：128-130.

[3]李宜培.線粒體損傷與細(xì)胞凋亡[J].河南職工醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2008，20（1）：94-97.◇

Effect of Kudingcha Methanol Extract on Hydrogen Peroxide Treated Macrophage Cell

ZHONG Tao，*LIU Xiande
（Department of Veterinary Medicine，Hainan University，Haikou，Hainan 570228，China）

The macrophage cell（RAW264.7）is induced to oxidation stress model by hydrogen peroxide and detected NO，IL-6，and TNF-α after treating of Kudingcha methanol extract and chlorogenic acid.The results show that Kudingcha methanol extract and chlorogenic acid did not affect macrophage cell viability and，dose dependently decreased NO production and increased IL-6 and TNF-α in hydrogen peroxide treated macrophage cell（p＜0.05）.Kudingcha methanol extract and chlorogenic acid decreased oxidation stress via NO reduction，but seem to promoted cell apoptosis with increasing of IL-6 and TNF-α in hydrogen peroxide treated macrophage cell.Therefore，effect of Kudingcha methanol extract and chlorogenic acid on hydrogen peroxide treated macrophage cell，that is very complicated and need further study.

Kudingcha；chlorogenic acid；macrophage cell；apoptosis

R285

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.05.003

1671-9646（2017）05a-0007-03

2017-04-22

海南省社會發(fā)展科技專項（SF201421）；海南省應(yīng)用技術(shù)研發(fā)與示范推廣專項（ZDXM2015065）。

鐘韜（1992—），男，在讀碩士，研究方向為動物遺傳育種。

*通訊作者：柳賢德（1979—），男，博士，副教授，研究方向為獸醫(yī)公共衛(wèi)生的教學(xué)與科研。