紅豆越橘中總黃酮的提取及抑菌性質(zhì)研究

李煜，韓春然，黃赫雁，戴傳榮，張家成，林樅雨

（哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，黑龍江哈爾濱150076）

紅豆越橘中總黃酮的提取及抑菌性質(zhì)研究

李煜，韓春然*，黃赫雁，戴傳榮，張家成，林樅雨

（哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，黑龍江哈爾濱150076）

研究超聲波輔助提取紅豆越橘總黃酮的工藝及其抑菌作用。以超聲波功率，料液比，溶劑濃度和提取時(shí)間為考察因素，以總黃酮提取率為指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)優(yōu)化最佳提取工藝，并對(duì)其總黃酮提取液的抑菌效果進(jìn)行系統(tǒng)研究。紅豆越橘中總黃酮提取的最佳條件為，超聲波功率為450 W、超聲時(shí)間為25 min、乙醇濃度為50%、料液比為1∶15（g/mL），總黃酮的提取率為29.87 mg/g。抑菌試驗(yàn)表明，紅豆越橘總黃酮提取液（pH 2.8）的濃度為40 mg/mL時(shí)，對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和白色葡萄球菌具有明顯的抑菌作用，抑菌圈直徑分別為21.17、21.67、23.91 mm；最低抑菌濃度分別為：2.5、2.5、1.25 mg/mL；紅豆越橘的低pH值對(duì)總黃酮提取液的抑菌效果具有一定貢獻(xiàn)，中和后的紅豆越橘總黃酮提取液對(duì)各菌株的抑制能力顯著下降。紅豆越橘中總黃酮提取率可達(dá)29.87 mg/g，在酸性條件下，對(duì)枯草芽孢桿菌、白色葡萄球菌和大腸桿菌具有明顯抑制作用。

紅豆越橘；超聲波提取；總黃酮；抑菌

紅豆越橘（Vaccinium Vitis-idaea L.）是一種營(yíng)養(yǎng)價(jià)值很高的天然野生漿果，屬于杜鵑花科植物，多年生落葉灌木，果實(shí)為亮紅色，風(fēng)味酸澀[1]。紅豆越橘中含有很多種化學(xué)活性成分，EK[2]從中分離出28種酚類(lèi)化合物，而黃酮類(lèi)化合物是其最重要的生物活性成分。并且黃酮類(lèi)化合物具有低毒和廣譜的藥理活性，在治療心血管疾病、抗腫瘤抗癌、抗氧化清除自由基、抗炎等方面均有突出表現(xiàn)[3-7]，許多研究表明，黃酮類(lèi)化合物具有直接抑菌[8]、協(xié)同抑菌及抑制細(xì)菌毒性等作用[9]。由于越橘本身含有豐富的有機(jī)酸[10]，而有機(jī)酸的抑菌作用是眾所周知的，目前對(duì)越橘黃酮抑菌作用的報(bào)道普遍沒(méi)有排除酸度對(duì)其抑菌能力的影響，因此，越橘中黃酮的抑菌能力并不是非常明確，本試驗(yàn)以超聲輔助波提取紅豆越橘總黃酮，并系統(tǒng)研究該總黃酮對(duì)大腸桿菌，枯草桿菌和白色葡萄球菌的抑制效果，明確越橘黃酮的抑菌能力，為紅豆越橘的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅豆越橘：大興安嶺百盛科技開(kāi)發(fā)有限公司。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品：北京紅星化工廠；無(wú)水乙醇、石油醚、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、氯化鈉、葡萄糖、瓊脂、牛肉膏和蛋白胨均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

R-205旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海申勝生物技術(shù)有限公司；ZHWY-2102C恒溫?fù)u床培養(yǎng)箱：上海智城分析儀器公司；手提式壓力蒸汽滅菌器：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；722型光柵分光光度計(jì)：上海光譜儀有限公司；SWCJ-1D無(wú)菌操作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備廠；ESJ180-4電子天平：上海光正醫(yī)療儀器有限公司；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 原料預(yù)處理

取適量紅豆越橘凍果解凍，然后放入勻漿機(jī)中充分?jǐn)囁?，備用?/p>

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

根據(jù)周慧恒[11]等的方法，以蘆丁質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出回歸方程y=0.197 9x-0.002 1，R2=0.990 1。

1.3.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.3.1 超聲功率對(duì)紅豆越橘總黃酮提取率的影響

按照液料比1∶10（g/mL）稱(chēng)取原料與60%乙醇溶液，分別在 250、300、350、400、450、500 W 功率下超聲提取25 min，進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，計(jì)算提取率。

1.3.3.2 超聲時(shí)間對(duì)紅豆越橘總黃酮提取率的影響

按照液料比1∶10（g/mL）稱(chēng)取原料與60%乙醇溶液，分別用 400 W 的超聲波處理 10、15、20、25、30、35 min，進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，計(jì)算提取率。

1.3.3.3 乙醇濃度對(duì)紅豆越橘總黃酮提取率的影響

按照液料比1∶10（g/mL）分別稱(chēng)取原料與30%、40%、50%、60%、70%、80%的乙醇溶液，攪拌均勻，分別用400 W的超聲波處理25 min，進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，計(jì)算提取率。

1.3.3.4 料液比對(duì)紅豆越橘總黃酮提取率的影響

按照料液比為 1 ∶5、1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30（g/mL）稱(chēng)取原料和60%乙醇溶液，然后用400 W的超聲波處理25 min，進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，計(jì)算提取率。

1.3.4 總黃酮提取率的測(cè)定

按照1.3.2的方法測(cè)定波長(zhǎng)510 nm處的吸光度。根據(jù)回歸方程式，求出相當(dāng)于樣品吸光度的總黃酮含量，按下式[12]求出總黃酮提取率。

式中：V為提取液定容體積，mL；m為紅豆越橘質(zhì)量，g。

1.3.5 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以超聲波功率（A）、超聲提取時(shí)間（B）、乙醇濃度（C）和料液比（D）為因素，以紅豆越橘總黃酮提取率為指標(biāo)，利用L9（34）正交試驗(yàn)表進(jìn)行正交試驗(yàn)，確定紅豆越橘總黃酮提取的最佳工藝。正交試驗(yàn)的因素水平表如表1。

表1 紅豆越橘總黃酮提取工藝正交試驗(yàn)因素及水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment for the extraction of total flavonoids from lingonberry

1.3.6 抑菌試驗(yàn)

1.3.6.1 紅豆越橘總黃酮供試液的制備

按照最佳工藝進(jìn)行超聲波輔助紅豆越橘總黃酮提取，并配置成濃度為40 mg/mL的供試液。

1.3.6.2 菌種的活化及菌懸液制備

參照付振喜[13]的方法進(jìn)行菌種的活化，使菌懸液濃度約在106CFU/mL～107CFU/mL，備用。

1.3.6.3 紅豆越橘總黃酮提取液抑菌活性的研究

采用濾紙片法[14]。以30%的乙醇（F）、檸檬酸緩沖溶液（pH=2.8，G）和 pH 2.8的30%乙醇溶液（H）分別作對(duì)照。置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，測(cè)量抑菌圈直徑大小，取其平均值作為試驗(yàn)結(jié)果。

1.3.6.4 紅豆越橘總黃酮提取液最小抑菌濃度（MIC）的測(cè)定

采用對(duì)倍稀釋法[15]，將總黃酮濃縮液（E）用無(wú)菌蒸餾水進(jìn)行對(duì)倍稀釋?zhuān)渲瞥蓾舛确謩e為40、20、10、5、2.5、1.25 mg/mL的稀釋液。用無(wú)菌吸管分別吸取1 mL稀釋液加入到無(wú)菌培養(yǎng)皿中，然后向每培養(yǎng)皿倒入19 mL培養(yǎng)基，充分混勻，靜置凝固后，制成含樣品平板。另取一組培養(yǎng)皿，操作同上，用30%的乙醇（F）、檸檬酸緩沖溶液（pH=2.8，G）和pH 2.8的30%乙醇溶液（H）取代稀釋液配做為對(duì)比組。并在上述各平板內(nèi)加入0.1 mL菌懸液，用無(wú)菌涂棒涂布均勻，置37℃條件下培養(yǎng)24 h后，觀察菌的生長(zhǎng)情況。以完全沒(méi)有菌落生長(zhǎng)的提取物濃度為該提取物的最低抑菌濃度。每個(gè)濃度及對(duì)照組均設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.3.6.5 紅豆越橘總黃酮提取液中和后的MIC的測(cè)定

參照Gündüz[16]的研究，用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)紅豆越橘總黃酮供試液使其pH值為7.0，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成浸膏狀，用 30%乙醇配制成濃度 600、500、400、300、200 mg/mL的供試液備用，并以30%的乙醇做為對(duì)比組，按照1.3.6.4的操作，以完全沒(méi)有菌落生長(zhǎng)的提取物濃度為該提取物的最低抑菌濃度。每個(gè)濃度及對(duì)照組均設(shè)3個(gè)重復(fù)。

1.3.7 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)以SPSS10.0進(jìn)行分析。所有試驗(yàn)均重復(fù)3次進(jìn)行，采用單向方差分析（Tukey法）比較數(shù)據(jù)間的差異性，顯著水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 超聲波功率對(duì)總黃酮提取率的影響

超聲波功率對(duì)總黃酮提取率的影響見(jiàn)圖1。

圖1 超聲功率對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.1 Effect of ultrasonic action power on the extraction rate of total flavonoids

由圖1可知，當(dāng)超聲功率在250 W～400 W之間時(shí)，紅豆越橘總黃酮含量呈現(xiàn)增長(zhǎng)趨勢(shì)。當(dāng)超聲波功率為400 W時(shí)，總黃酮提取率顯著（P＜0.05）高于其它功率組，達(dá)到29.11 mg/g，顯著高于其它功率組。當(dāng)超聲功率繼續(xù)增加時(shí)，總黃酮的提取率反而緩慢下降，這可能是由于較大功率的超聲波會(huì)破壞黃酮類(lèi)化合物的分子結(jié)構(gòu)[17]，而且較大功率的超聲波會(huì)產(chǎn)生過(guò)多的熱量，這也會(huì)破壞物質(zhì)結(jié)構(gòu)，進(jìn)而導(dǎo)致提取率降低。

2.1.2 超聲處理時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響

超聲處理時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響見(jiàn)圖2。

圖2 超聲處理時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of ultrasonic time on the extraction rate of total flavonoids

由圖2可知，超聲處理時(shí)間在10 min～35 min之間，紅豆越橘總黃酮提取率隨著超聲時(shí)間呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)。當(dāng)超聲處理時(shí)間為25 min時(shí)，總黃酮提取率最高顯著（P＜0.05）高于其它組達(dá)到28.97 mg/g。超聲處理時(shí)間在25 min～35 min之間時(shí)，總黃酮的提取率隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，隨后總黃酮提取率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。

2.1.3 乙醇濃度對(duì)紅豆越橘總黃酮提取率的影響

乙醇濃度對(duì)總黃酮提取率的影響見(jiàn)圖3。

圖3 乙醇濃度對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of alcohol concentration on the extraction rate of total flavonoids

由圖3可知，乙醇濃度在30%～80%之間紅豆越橘總黃酮提取率隨著乙醇濃度呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì)。當(dāng)乙醇濃度達(dá)到50%時(shí)提取率最高，顯著（P＜0.05）高于其它組，達(dá)到29.38mg/g。當(dāng)乙醇濃度超過(guò)50%時(shí)，提取率反而下降，這是因?yàn)楫?dāng)乙醇濃度增加時(shí)，某些雜質(zhì)溶出也增多，因而會(huì)降低總黃酮的提取率。

2.1.4 料液比對(duì)紅豆越橘總黃酮提取率的影響

料液比對(duì)總黃酮提取率的影響見(jiàn)圖4。

由圖 4可知，在料液比為 1∶5（g/mL）到 1∶20（g/mL）之間，紅豆越橘總黃酮提取率呈現(xiàn)急劇增長(zhǎng)趨勢(shì)，且各組提取率存在顯著性差異。當(dāng)料液比為1∶20（g/mL）時(shí)，總黃酮提取率（29.52 mg/g）最高，顯著高于其它組，這可能是由于提取溶劑較多，超聲波難于作用到物料本身上，黃酮類(lèi)化合物溶出速度減慢，考慮生產(chǎn)的成本，料液比不宜太大。

圖4 料液比對(duì)總黃酮提取率的影響Fig.4 Effect of material/liquid ratio on the extraction rate of total flavonoids

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

正交試驗(yàn)結(jié)果及分析如表2所示。

表2 超聲波法提取總黃酮的正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of orthogonal experiment

由正交試驗(yàn)分析處理結(jié)果如表2所示，結(jié)合K值的分析可以得出優(yōu)化方案為：時(shí)間25 min，超聲波功率450 W，料液比 1∶15（g/mL），乙醇濃度 50%。在正交試驗(yàn)的4個(gè)因素中，由R值的大小分析比較可以得出來(lái)，影響提取率的因素依次為：料液比>功率>時(shí)間>乙醇濃度，由于D1A3B2C2不在以上9個(gè)正交試驗(yàn)中，進(jìn)而驗(yàn)證試驗(yàn)，在最優(yōu)條件下進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，從而得到紅豆越橘中總黃酮的提取率為29.87 mg/g。

2.3 抑菌試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 紅豆越橘總黃酮抑菌活性的研究

紅豆越橘總黃酮抑菌活性的研究結(jié)果見(jiàn)表3。

由于紅豆越橘總黃酮濃縮液其本身具有的低pH值和其溶劑中的乙醇存在一定的抑菌能力，此處試驗(yàn)與崔瑋[12]、黎繼烈[18]等的研究相比，添加了與總黃酮提取液pH值相同的檸檬酸緩沖溶液、30%乙醇溶液和乙醇溶液（30%，pH2.8）3組對(duì)照試驗(yàn)，進(jìn)一步明確紅豆越橘中總黃酮的抑菌能力。

表3 紅豆越橘總黃酮抑菌活性Table 3 Inhibitory activity of total flavonoids from lingonberry mm

結(jié)果如表3所示，乙醇溶液（30%）無(wú)抑制作用。檸檬酸緩沖溶液（pH 2.8）與乙醇溶液（30%、pH2.8）對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、白葡萄球菌均有一定抑菌能力，并且抑菌能力隨稀釋梯度增加而降低，乙醇溶液（30%，pH2.8）的抑菌能力略強(qiáng)于檸檬酸緩沖溶液（pH 2.8）。

紅豆越橘中總黃酮提取液對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、白葡萄球菌均有抑制作用。并且總黃酮提取液與各對(duì)照組對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、白葡萄球菌的抑菌圈直徑之間存在顯著（P<0.05）差異。此時(shí)總黃酮提取液的濃度為40 mg/mL，抑菌圈直徑均大于21 mm。尤其是對(duì)于枯草芽孢桿菌和白色葡萄球菌最為敏感，抑菌圈分別為21.67 mm和23.91 mm，并且均大于大腸桿菌的抑菌圈（21.17 mm）。

與紅豆越橘總黃酮提取液相比，檸檬酸緩沖溶液（pH 2.8）與乙醇溶液（30%，pH 2.8）的抑菌能力較低。這說(shuō)明紅豆越橘總黃酮濃縮液對(duì)供試菌種的抑制作用不僅是由于其本身濃縮液的低pH值和溶劑中的乙醇所引起的，進(jìn)一步說(shuō)明了紅豆越橘中黃酮類(lèi)化合物具有一定的抑菌能力。

2.3.2 紅豆越橘總黃酮提取液最低抑菌濃度的測(cè)定

紅豆越橘總黃酮提取液最低抑菌濃度的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 紅豆越橘總黃酮的最低抑菌濃度（pH2.8）Table 4 Minimum inhibitory concentration of total flavonoids from lingonberry（pH2.8）

續(xù)表4 紅豆越橘總黃酮的最低抑菌濃度（pH2.8）Continue table 4 Minimum inhibitory concentration of total flavonoids from lingonberry（pH2.8）

結(jié)果如表4所示：隨著紅豆越橘總黃酮濃縮液濃度的降低，抑菌能力也隨之降低，紅豆越橘總黃酮提取液對(duì)各菌株的最低抑菌濃度分別為：大腸桿菌2.5 mg/mL、枯草芽孢桿菌2.5 mg/mL、白葡萄球菌1.25 mg/mL。乙醇溶液（30%）無(wú)明顯抑菌能力，乙醇溶液（30%，pH=2.8）的抑制作用比檸檬酸緩沖溶液（pH 2.8）略強(qiáng)。紅豆越橘總黃酮提取液（pH 2.8）抑菌作用大小依次為：白色葡萄球菌大于枯草芽孢桿菌、大腸桿菌，這與濾紙法檢測(cè)結(jié)果基本一致。

2.3.3 紅豆越橘總黃酮提取液中和后的最低抑菌濃度的測(cè)定

紅豆越橘總黃酮提取液中和后的最低抑菌濃度的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 紅豆越橘總黃酮提取液中和后的最低抑菌濃度Table 5 Minimum inhibitory concentration of total flavonoids from Lingonberry（pH7.0）

如表5所示，隨著紅豆越橘總黃酮提取液（pH7.0）的濃度降低，抑菌能力也隨之降低，紅豆越橘總黃酮提取液（pH7.0）對(duì)各菌株的最低抑菌濃度分別為：大腸桿菌400 mg/mL、枯草芽孢桿菌600 mg/mL、白葡萄球菌500 mg/mL。紅豆越橘總黃酮提取液（pH7.0）抑菌作用大小依次為：大腸桿菌＞白色葡萄球菌＞枯草芽孢桿菌。這與2.3.2中的結(jié)果，以及很多未探究酸性影響的研究[18-21]相比，中和后的紅豆越橘總黃酮提取液的最低抑菌濃度較大。這說(shuō)明，在中性條件下，紅豆越橘中的總黃酮抑菌能力較低，進(jìn)一步說(shuō)明了紅豆越橘中的黃酮類(lèi)化合物與低pH值復(fù)合時(shí)抑菌能力更強(qiáng)。

3 結(jié)論

超聲波輔助提取技術(shù)具有較高的提取效率、節(jié)約能源以等優(yōu)勢(shì)[22-23]。本研究通過(guò)單因素考察及正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，得到紅豆越橘總黃酮最優(yōu)提取工藝為：超聲波功率為450 W、超聲時(shí)間為25 min、乙醇濃度為50%、料液比為1∶15（g/mL）。在次條件下對(duì)紅豆越橘中總黃酮進(jìn)行提取，最終提取率為29.87 mg/g。

紅豆越橘總黃酮對(duì)枯草芽孢桿菌、白色葡萄球菌和大腸桿菌具有明顯的抑菌作用，對(duì)菌株的抑制作用隨著濃度的增加而增強(qiáng)，尤其是對(duì)白色葡萄球菌的最大抑菌圈直徑可達(dá)23.91 mm，枯草芽孢桿菌21.67 mm，大腸桿菌21.17 mm。同時(shí)經(jīng)測(cè)定，紅豆越橘總黃酮提取液（pH2.8）對(duì)各菌株的最低抑菌濃度分別為：大腸桿菌2.5 mg/mL、枯草芽孢桿菌2.5 mg/mL、白葡萄球菌1.25 mg/mL，中和后的紅豆越橘總黃酮提取液對(duì)各菌株的最低抑菌濃度分別為：大腸桿菌400 mg/mL、枯草芽孢桿菌600 mg/mL、白葡萄球菌500 mg/mL。這說(shuō)明紅豆越橘的低pH值對(duì)總黃酮提取液的抑菌效果具有一定貢獻(xiàn)，中和后的紅豆越橘總黃酮提取液對(duì)各菌株的抑制能力顯著下降。本試驗(yàn)結(jié)果可為紅豆越橘總黃酮提取工藝的確定及在抑菌方面的應(yīng)用提供理論參考。

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Optimization of Extraction Process of Total Flaonoids from Lingonberry and Evaluation of Its Antibacterial Activities

LI Yu，HAN Chun-ran*，HUANG He-yan，DAI Chuan-rong，ZHANG Jia-cheng，LIN Cong-yu
（School of Food Engineering，Harbin University of Commerce，Harbin 150076，Heilongjiang，China）

To investigate ultrasonic-assisted extraction of total flavonoids from lingonberry and its antibacterial activities.Using ultrasonic power，extraction time，solvent concentration and extraction time as factors，extraction yield of total flavonoids as indicator to optimize the extraction conditions of the total flavonoids from blueberry by orthogonal experiment，the antibacterial activity of flavonoids was investigated systematically.The optimal extraction conditions of total flavonoids of lingonberry were as follows：ultrasonic power 450 W，ultrasonic time 25 min，ethanol concentration 50%，solid-liquid ratio 1 ∶15 （g/mL），under above conditions，total flavonoids extraction rate was 29.87 mg/g.When the concentration（pH 2.8）of total flavonoids from lingonberry was 40 mg/mL，it had obvious antibacterial effect on Escherichia coli，Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus with the inhibition zone diameter of 21.17，26.67，23.91 mm respectively.The minimum inhibitory concentrations（MIC）were 2.5，2.5，1.25 mg/mL respectively.The low pH of the total flavonoids contributed to some extend to the antibacterial activity of the flavonoids，after neutralization，the antibacterial activity decreased significantly.The yield of flavonoids from lingonberry was 29.87 mg/g，under acidic conditions，the flavonoids had significant effect on Escherichia coli，Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus.

lingonberry；ultrasonic extraction；total flavonoids；antibacterial

2016-09-20

李煜（1990—），女（漢），研究生，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工利用。

*通信作者：韓春然（1970—），女，教授，博士，研究方向：果蔬貯藏與加工。

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.13.015