簡 雷， 肖才文， 何慶文， 李漢琳， 周 衛(wèi)， 徐 翔， 王 勇， 朱宏飛

1江漢大學(xué)附屬醫(yī)院(武漢市第六醫(yī)院)耳鼻喉科，武漢 4300152武漢大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，武漢 4300713武漢大學(xué)口腔醫(yī)院麻醉與危重癥醫(yī)學(xué)科，武漢 430079

金銀花提取物對變應(yīng)性鼻炎小鼠細(xì)胞因子表達(dá)的影響*

簡 雷1， 肖才文1， 何慶文1， 李漢琳1， 周 衛(wèi)1， 徐 翔1， 王 勇2， 朱宏飛3△

1江漢大學(xué)附屬醫(yī)院(武漢市第六醫(yī)院)耳鼻喉科，武漢 4300152武漢大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，武漢 4300713武漢大學(xué)口腔醫(yī)院麻醉與危重癥醫(yī)學(xué)科，武漢 430079

目的 建立小鼠變應(yīng)性鼻炎(allergic rhinitis，AR)模型，觀察金銀花提取物對變應(yīng)性鼻炎小鼠炎性因子水平的影響。方法 選取60只健康成年雄性C57BL/6小鼠，按照隨機(jī)數(shù)字法隨機(jī)分為4組：空白對照組、模型對照組、金銀花治療組、陽性對照組，每組15只。采用卵清蛋白(OVA)建立小鼠AR模型。采取積分法記錄AR癥狀嚴(yán)重程度；取小鼠鼻中隔黏膜，用流式細(xì)胞儀分析IL-17來源；ELISA法檢測各組小鼠血清中IL-2、IL-4、IL-17、IFN-γ、sIgE的表達(dá)水平；小鼠鼻中隔黏膜病理切片計(jì)數(shù)嗜酸性粒細(xì)胞；RT-PCR法檢測鼻中隔黏膜中IL-17 mRNA的表達(dá)；Western blot法檢測IL-17蛋白表達(dá)水平。結(jié)果 金銀花治療組及陽性對照組小鼠撓鼻、噴嚏及流涕情況較模型對照組有明顯減輕。通過流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)IL-17主要來源于γδT細(xì)胞。金銀花治療組及陽性對照組小鼠鼻黏膜病理切片嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)，血清IL-4、IL-17、sIgE水平，組織IL-17 mRNA的表達(dá)，IL-17蛋白表達(dá)水平等，均較模型對照組降低(均P<0.01)，而血清IL-2、IFN-γ水平均上升(均P<0.01)。結(jié)論 金銀花提取物可調(diào)控OVA致敏的AR小鼠炎性因子的表達(dá)，對AR具有免疫調(diào)節(jié)作用。

金銀花提取物； 小鼠； 變應(yīng)性鼻炎； 白細(xì)胞介素-17； γδT細(xì)胞

變應(yīng)性鼻炎(allergic rhinitis，AR)是耳鼻咽喉頭頸外科臨床的一個(gè)常見病、多發(fā)病，是特應(yīng)性個(gè)體接觸了致敏原后由IgE介導(dǎo)的介質(zhì)釋放、并有多種免疫活性細(xì)胞和細(xì)胞因子等參與的鼻黏膜慢性炎癥反應(yīng)性疾病[1]。其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜且尚不明確，使得目前臨床上用于治療AR的藥物種類繁多、使用周期長、費(fèi)用高、效果不理想，所以對AR發(fā)病機(jī)制的研究成為國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)[2]。AR發(fā)病機(jī)制有多種因素參與，比如特應(yīng)型個(gè)體學(xué)說和衛(wèi)生假說[3]。近期又有研究指出IL-17在AR的發(fā)病中也起到了重要作用，但分泌IL-17的T細(xì)胞和與IL-17有關(guān)的細(xì)胞因子在AR中是否也有相應(yīng)變化尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)通過建立小鼠AR模型，檢測小鼠鼻腔黏膜內(nèi)IL-17+T細(xì)胞比例，血清中IL-17等相關(guān)細(xì)胞因子含量，初步探討了小鼠AR模型中IL-17的來源及金銀花對相應(yīng)細(xì)胞因子表達(dá)的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：本研究中所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，均按照國家相關(guān)法律及動(dòng)物倫理學(xué)要求在武漢大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心內(nèi)進(jìn)行，70只(其中10只備用)健康成年雄性C57BL/6小鼠(7～9周齡、體重20～25 g)飼養(yǎng)于光/暗周期為12 h/12 h(光照時(shí)間7：00～19：00)、(22±2)℃、濕度(52±2)%的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室條件下，自由獲得飼料和飲水。

主要試劑：卵清蛋白(OVA)購于美國Sigma公司，金銀花提取物購自四川省廣漢市維康植化有限公司，IL-2、IL-4、IL-17、IFN-γ、sIgE檢測試劑盒購于武漢博士德生物工程公司。引物由上海賽百盛基因技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)、合成并提純。氟波酯(PMA)、離子霉素(ionomycin)均購自美國EB公司，小鼠淋巴細(xì)胞分離液購自中科院天津所，Trizol購于TaKaRa公司。RT-PCR試劑盒、DNA標(biāo)記購于北京天根生化科技公司。

實(shí)驗(yàn)儀器：小動(dòng)物呼吸機(jī)(哈佛683，美國)，血?dú)夥治鰞x(i-State，美國)，石蠟切片機(jī)(Leika超薄切片機(jī)，德國)，PCR儀(Bio-Rad MJ PTC-100TM，美國)，半干式轉(zhuǎn)膜儀(Bio-Rad 170-3940，美國)，酶標(biāo)儀(Bio-Rad 680，美國)。

1.2 模型制備

本研究采用OVA建立小鼠AR模型。除空白對照組外，其余各組小鼠在第1、5、14和21天以含卵清蛋白(OVA)25 μg、氫氧化鋁凝膠1 mg、生理鹽水0.5 mL的混懸液0.5 mL行小鼠腹腔注射進(jìn)行基礎(chǔ)致敏；基礎(chǔ)致敏后，于第28天開始以500 μg OVA加20 μL生理鹽水給予小鼠雙側(cè)鼻腔滴注，連續(xù)進(jìn)行10 d局部激發(fā)[4]。

模型成功判定方法參照文獻(xiàn)[5]。末次激發(fā)30 min內(nèi)觀察小鼠撓鼻、噴嚏及流涕行為。撓鼻：輕搔鼻1～2次為1分，劇烈抓撓鼻面不止記3分，介于二者之間為2分；噴嚏：1～3個(gè)為1分，4～10個(gè)為2分，≥11個(gè)為3分；流涕：流至前鼻孔為1分，超出前鼻孔為2分，涕流滿面為3分。以上各項(xiàng)指標(biāo)計(jì)分疊加，總分>5分表示模型制備成功。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組及干預(yù)

選取C57BL/6雄性小鼠60只，采用隨機(jī)數(shù)字法將實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分成4組：空白對照組、模型對照組、金銀花治療組、陽性對照組，每組15只。

空白對照組與模型對照組以等體積生理鹽水1 mL灌胃，金銀花治療組與陽性對照組分別以金銀花提取物或枸地氯雷他定灌胃。金銀花提取物配成濃度為0.06 g生藥/mL，每次0.5 mL/只，每天1次灌胃，連續(xù)10 d。枸地氯雷他定按0.6 mg/kg灌胃，連續(xù)10 d。同時(shí)隔天以O(shè)VA滴鼻以維持過敏狀態(tài)。

1.4 癥狀評分

于最后1次給藥0.5 h后OVA滴鼻激發(fā)，觀察30 min內(nèi)小鼠撓鼻、噴嚏及流涕情況，采取積分法記錄上述癥狀程度，與給藥前的癥狀積分比較。

1.5 ELISA法檢測各組小鼠血清中sIgE、IL-2、IL-4、IL-17、IFN-γ水平

各組小鼠最后1次激發(fā)24 h后，用3%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉小鼠，暴露其腹主動(dòng)脈，用注射器抽取腹主動(dòng)脈血1 mL，注入抗凝管中，3 000 r/min離心15 min，分離血清，采用ELISA法檢測各組小鼠血清中sIgE水平和免疫細(xì)胞因子IL-2、IL-4、IL-17、IFN-γ的表達(dá)情況，操作按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.6 光鏡下嗜酸性粒細(xì)胞(EOS)計(jì)數(shù)

各組小鼠經(jīng)放血處死后，剖開鼻腔，取其中一側(cè)部分鼻中隔黏膜，10%甲醛固定，石蠟包埋后行組織切片(層厚5 μm)，行蘇木精-伊紅染色。光鏡下觀察嗜酸性粒細(xì)胞(EOS)并計(jì)數(shù)。每張切片觀察5個(gè)高倍視野(×400)，取其平均值。

1.7 流式細(xì)胞儀分析IL-17來源

取模型組小鼠部分鼻中隔黏膜放入RPMI 1640無菌培養(yǎng)液中用注射器反復(fù)沖洗，再用無菌PBS沖洗3遍，直至呈現(xiàn)白色。后將其置400目鋼網(wǎng)上，剪成約1 mm3的小塊反復(fù)研磨。然后將收集到的5 mL細(xì)胞懸液渦旋振蕩后沿管壁緩慢加入含有5 mL Ficoll的離心管中，重懸離心吸取中間層細(xì)胞。無菌PBS 1 500 r/min離心5 min，沖洗2遍，以1640培養(yǎng)液重懸細(xì)胞。計(jì)數(shù)后接種至96孔板，加入含10%小牛血清的1640培養(yǎng)液在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)待用。在分離細(xì)胞中加入PMA、離子霉素及高爾基阻斷劑，在200 μL體系終濃度分別為50、500 ng/mL和2 μg/mL，共同孵育4 h。1 800 r/min離心5 min收集細(xì)胞，以染色緩沖液重懸洗滌細(xì)胞棄去上清，再次以50 μL重懸，每孔細(xì)胞加入0.25 μL的APC-anti-mouse-CD45、APC-anti-mouse-IL-17A室溫避光保存30 min。以PBS洗2遍后加入100 μL固定液4℃避光孵育15 min，離心棄上清。加入破膜液，1 800 r/min離心5 min棄上清。用50 μL小鼠血清封閉10 min，PBS洗2次分2管，分別加入APC-anti-mouse-γδTCR、APC-anti-mouse-NK1.1、APC-anti-mouse-Th17和APC-anti-mouse-neutrophil 0.25 μL，室溫避光30 min，通透洗液洗2遍，以200 μL PBS重懸細(xì)胞后，上機(jī)檢測。

1.8 RT-PCR法檢測IL-17 mRNA的表達(dá)

取另一側(cè)鼻中隔黏膜，Trizol一步法提取細(xì)胞總RNA后合成cDNA。內(nèi)參照β-actin引物序列為：上游引物5′-CTAGGCACCAGGGTGTGATG-3′，下游引物5′-GGGGTACTTCAGGGTCAGGA-3′；IL-17引物序列為：上游引物5′-CCCTCAGACTACCTCAACCG-3′，下游引物5′-CAGCTTTCCCTCCGCATT-3′。PCR反應(yīng)條件：94 ℃(1 min)、57 ℃(1 min)、72 ℃(45 s)，30個(gè)循環(huán)，末次延伸為72 ℃(10 min)。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，采用美國Bio-Rad公司凝膠圖像分析儀進(jìn)行定量分析，以與內(nèi)參的吸光度比值反映目的基因的相對表達(dá)量。

1.9 Western blot法檢測IL-17蛋白表達(dá)水平

采用細(xì)胞裂解液Buffer A提取鼻中隔黏膜細(xì)胞蛋白，考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白濃度后，取5 μg蛋白上樣、電泳轉(zhuǎn)膜、封閉后一抗過夜，膜漂洗后二抗雜交，ECL化學(xué)發(fā)光法顯影。采用美國Bio-Rad公司圖像分析儀進(jìn)行定量分析，以目的條帶與內(nèi)參條帶的吸光度比值反映目的蛋白的相對表達(dá)量。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 小鼠癥狀評分

除空白對照組外，造模后各組小鼠均出現(xiàn)不同程度撓鼻、噴嚏及流涕癥狀，癥狀評分均大于5分，與空白對照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)，表示造模成功。經(jīng)過干預(yù)措施治療后，金銀花治療組、陽性對照組小鼠撓鼻、噴嚏及流涕情況較模型對照組有明顯減輕，其差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)。見表1。

組別治療前治療后空白對照組4.15±0.464.03±0.57模型對照組7.99±0.38#7.76±0.72#金銀花治療組7.91±0.41#4.31±0.55*陽性對照組7.98±0.45#4.23±0.47*

與空白對照組比較，#P<0.01；與模型對照組比較，*P<0.01

2.2 小鼠鼻中隔黏膜嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)

蘇木精-伊紅染色后，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野，觀察分析實(shí)驗(yàn)小鼠鼻中隔黏膜組織內(nèi)EOS浸潤情況。結(jié)果顯示：空白對照組小鼠鼻中隔黏膜組織內(nèi)無明顯EOS浸潤，平均每個(gè)高倍視野中EOS計(jì)數(shù)為(2.03±0.67)個(gè)。模型對照組小鼠鼻中隔黏膜部分纖毛結(jié)構(gòu)脫落，小血管擴(kuò)張，組織水腫，腺體增生，黏膜上皮下固有層伴有大量EOS等炎性細(xì)胞浸潤，平均每個(gè)高倍視野中EOS計(jì)數(shù)為(47.79±0.94)個(gè)，與空白對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；金銀花治療組和陽性對照組小鼠鼻中隔黏膜纖毛結(jié)構(gòu)基本完整，黏膜結(jié)構(gòu)基本正常，上皮細(xì)胞排列較整齊，少見EOS浸潤，平均每個(gè)高倍視野中EOS計(jì)數(shù)分別為(7.71±1.41)、(8.48±0.95)個(gè)，與模型對照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)。見圖1。

A：正常對照組，可見鼻中隔黏膜無明顯EOS浸潤；B：模型對照組，鼻中隔黏膜有大量EOS浸潤；C、D：金銀花治療組和枸地氯雷他定治療的陽性對照組，鼻中隔黏膜EOS浸潤明顯減少；紅色箭頭所示為EOS 圖1 4組小鼠鼻中隔黏膜蘇木精-伊紅染色(×400)Fig.1 HE staining of nasal septal mucosa in 4 groups of mice(×400)

2.3 小鼠血清中IL-2、IL-4、IL-17、IFN-γ、sIgE的表達(dá)

從表2可見，模型對照組小鼠血清IL-4、IL-17、sIgE水平均較空白對照組上升，而血清IL-2、IFN-γ水平均較空白對照組降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)。金銀花治療組、陽性對照組小鼠血清IL-4、IL-17、sIgE水平均較模型對照組均降低，而血清IL-2、IFN-γ水平均較模型對照組上升，其差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)。

組別IL-2IL-4IL-17IFN-γsIgE空白對照組15.59±2.3612.13±2.03201.37±12.5724.05±6.2320.58±2.33模型對照組5.35±1.93#35.49±3.28#649.76±11.72#10.97±5.34#48.46±2.74#金銀花治療組12.12±1.21*19.71±3.10*228.90±12.95*21.72±5.40*22.36±2.25*陽性對照組11.13±1.73*13.88±3.11*226.73±13.27*22.63±6.26*24.54±2.66*

與空白對照組比較，#P<0.01；與模型對照組比較，*P<0.01

2.4 小鼠鼻中隔黏膜細(xì)胞中IL-17的來源

從圖2可見，通過對造模成功的小鼠鼻中隔黏膜細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞技術(shù)分析，CD45+IL-17A+細(xì)胞中γδTCR+占76.2%，Th17+占15.6%，NK1.1+占3.8%，neutrophil+占4.4%?？梢姳侵懈麴つぜ?xì)胞中IL-17主要來源于γδT細(xì)胞(P<0.05)。

與γδTCR+比較，*P<0.05圖2 流式細(xì)胞儀分析IL-17來源Fig.2 Flow cytometric analysis of IL-17 sources

2.5 小鼠鼻中隔黏膜細(xì)胞IL-17 mRNA的表達(dá)水平

RT-PCR檢測結(jié)果顯示：模型對照組IL-17 mRNA的表達(dá)水平較空白對照組顯著增高(P<0.01)；金銀花治療組、陽性對照組IL-17 mRNA的表達(dá)水平較模型對照組均顯著降低(均P<0.01)。見表3、圖3。

2.6 小鼠鼻中隔黏膜細(xì)胞IL-17蛋白的水平

Western blot法檢測結(jié)果顯示：模型對照組IL-17蛋白水平較空白對照組顯著增高(P<0.01)；金銀花治療組、陽性對照組IL-17蛋白水平均較模型對照組顯著降低(均P<0.01)。見表3、圖4。

組別IL-17mRNAIL-17蛋白空白對照組0.615±0.0460.303±0.057模型對照組1.790±0.038#0.967±0.072#金銀花治療組0.910±0.041*0.431±0.055*陽性對照組0.880±0.045*0.423±0.047*

與空白對照組比較，#P<0.01；與模型對照組比較，*P<0.01

A：空白對照組；B：模型對照組；C：金銀花治療組；D：陽性對照組圖4 Western blot檢測各組IL-17蛋白的表達(dá)Fig.4 Detection of IL-17 protein in each group by Western blotting

3 討論

金銀花是我國中醫(yī)藥寶庫中重要而常用的品種，近年來國內(nèi)外學(xué)者運(yùn)用現(xiàn)代藥理理論和技術(shù)對金銀花進(jìn)行了較全面的分析和研究，從科學(xué)的角度證實(shí)了金銀花具有調(diào)節(jié)免疫、廣譜抗菌、抗病毒、抗腫瘤及解熱抗炎、保肝、利膽、降脂、抗生育、止血、抗?jié)兊榷喾N藥理作用。有研究表明，金銀花具有促進(jìn)白細(xì)胞和炎性細(xì)胞吞噬的作用，還能降低豚鼠T細(xì)胞a-醋酸萘酯酶(ANAE)百分率，降低中性粒細(xì)胞(PMN)的體外分泌，具有恢復(fù)巨噬細(xì)胞功能，調(diào)理淋巴細(xì)胞功能，上調(diào)IL-2水平等作用[6]。金銀花提取物可通過降低特異性IgE水平而發(fā)揮抗過敏作用，但受濃度影響較大；通過減少抗卵清蛋白特異性IgE抗體的產(chǎn)生而對抗Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)；還能抑制肥大細(xì)胞的組織胺釋放，在一定程度上抑制過敏反應(yīng)的發(fā)生[7]。還有實(shí)驗(yàn)表明金銀花35%乙醇提取物的水溶液具有顯著的預(yù)防過敏的作用[8]。

AR的發(fā)病機(jī)制有多種因素參與，首先是特應(yīng)型個(gè)體學(xué)說與衛(wèi)生假說。特應(yīng)型個(gè)體又稱為過敏性體質(zhì)，是指患者體質(zhì)異常，對環(huán)境中的某些刺激物特別敏感，引起高Th2應(yīng)答反應(yīng)。“衛(wèi)生假說”[9]的核心是機(jī)體內(nèi)抗感染免疫反應(yīng)與變態(tài)反應(yīng)之間存在一定的拮抗關(guān)系，家庭衛(wèi)生條件的改善和抗生素的大量應(yīng)用減少了細(xì)菌、病毒和寄生蟲等的感染，Th1反應(yīng)降低而Th2反應(yīng)增強(qiáng)。其次是Th1與Th2平衡機(jī)制，從基本Th1 /Th2細(xì)胞因子免疫平衡到Th/Toll樣受體調(diào)節(jié)的Th1 /Th2免疫應(yīng)答的平衡[10-13]。此外還涉及IgE及其受體，肥大細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞及相關(guān)炎癥介質(zhì)等。而以上都不能解釋過敏性疾病發(fā)生的全部機(jī)制。其中Th1 /Th2平衡機(jī)制具有重要意義。T細(xì)胞是免疫系統(tǒng)的基本組成，并且在免疫應(yīng)答的過程中發(fā)揮重要作用，既參與對感染的適當(dāng)免疫反應(yīng)又參與對過敏原的超敏反應(yīng)[14]。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為，根據(jù)分泌因子的不同可將CD4+T細(xì)胞分為Th1和Th2兩個(gè)亞群[15]。Th1主要分泌IL-2、IFN-γ、TGF-β和TNF等，參與抗感染的細(xì)胞免疫應(yīng)答；Th2主要分泌IL-4、IL-5、IL-6和IL-13等，參與變態(tài)反應(yīng)的體液免疫應(yīng)答。而過敏性疾病的發(fā)生則主要是由Th2細(xì)胞驅(qū)動(dòng)的，AR患者Th1細(xì)胞數(shù)量下降，Th2水平明顯升高，Th1 /Th2平衡失調(diào)。鼻腔黏膜大量表達(dá)Th2細(xì)胞因子的輔助性T細(xì)胞、EOS的浸潤，同時(shí)產(chǎn)生大量的炎性介質(zhì)，進(jìn)而引發(fā)鼻腔黏膜的炎癥反應(yīng)。

近年來隨著Th17的發(fā)現(xiàn)，又將CD4+T淋巴細(xì)胞分為Th1、Th2、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cell，Treg)和Th17等4大亞群[16]，其中Th17細(xì)胞的主要效應(yīng)因子是IL-17。IL-17是一種主要由活化的T細(xì)胞產(chǎn)生的致炎細(xì)胞因子，可以通過促進(jìn)釋放促炎細(xì)胞因子來放大炎癥反應(yīng)，從而誘發(fā)自身免疫性疾病及慢性過敏性疾病。有大量研究發(fā)現(xiàn)γδT細(xì)胞也是IL-17的重要來源，在多種疾病的小鼠模型中，γδT細(xì)胞的某些亞群能通過早期產(chǎn)生大量IL-17，在感染性疾病、自身免疫性疾病和腫瘤等的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色[17]。這些新發(fā)現(xiàn)和新概念對于推動(dòng)T細(xì)胞免疫和變態(tài)反應(yīng)以及相關(guān)疾病的免疫學(xué)機(jī)制的研究有著深遠(yuǎn)的意義。

本研究造模成功后，CD45+IL-17A+細(xì)胞中γδT細(xì)胞占比高于Th17細(xì)胞，即在AR炎癥初期，IL-17主要來源于γδT細(xì)胞，而并非有些文章中提到的Th17細(xì)胞。在模型組小鼠中，IL-17、IL-4的水平高于空白對照組，而IL-2、IFN-γ低于空白對照組，說明在變應(yīng)性鼻炎超敏反應(yīng)中，除了與大多數(shù)關(guān)于變應(yīng)性鼻炎Th1 /Th2細(xì)胞因子免疫平衡機(jī)制的研究一致(即Th2類細(xì)胞增生)以外，IL-17分化亦占優(yōu)勢，而Th1類細(xì)胞受到抑制。在經(jīng)過金銀花治療后，IL-4、IL-17、sIgE水平均較模型對照組降低，而IL-2、IFN-γ水平較模型對照組上升，提示金銀花提取物參與了OVA致敏的變應(yīng)性鼻炎小鼠細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)，并在變應(yīng)性鼻炎的治療中發(fā)揮了重要的免疫調(diào)節(jié)作用。

變應(yīng)性鼻炎因其機(jī)制復(fù)雜，治療上多采用抗過敏藥物治療、脫敏治療乃至手術(shù)治療，抗過敏藥物多為抗組胺及激素類藥物，副作用較大，脫敏治療的效果亦不甚滿意，而手術(shù)治療的風(fēng)險(xiǎn)高，遠(yuǎn)期療效亦不確切。中藥口服治療變應(yīng)性鼻炎，其效果顯著，副作用小，但其治療變應(yīng)性鼻炎的作用較西藥作用緩慢，而且很多療效的評價(jià)缺乏實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)等統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。中藥復(fù)方的藥效機(jī)制研究是中藥現(xiàn)代化重要戰(zhàn)略之一。目前治療變應(yīng)性鼻炎的中成藥中尚未見以金銀花為主要成份的藥物，但根據(jù)對金銀花相關(guān)免疫調(diào)節(jié)作用的研究，我們期望以此在變應(yīng)性鼻炎的中藥治療上提供一種新的思路。

[1] Baxi S N，Portnoy J M，Larenas-Linnemann D，et al.Exposure and health effects of fungi on Humans[J].J Allergy Clin Immunol Pract，2016，4(3)：396-404.

[2] Quraishi S A，Davies M J，Craig T J.Inflammatory responses in allergic rhinitis：traditional approaches and novel treatment strategies[J].Am Osteopath Assoc，2004，104(5 Suppl)：S7-S15.

[3] Sakaguchi S，Sakaguchi N，Asano M，et al.Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains(CD25).Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases[J].J Immunol，1995，155(3)：1151-1164.

[4] 成娜莎.地塞米松對實(shí)驗(yàn)性過敏性鼻炎小鼠血清和鼻中隔黏膜TGF-β表達(dá)的影響[D].太原：山西醫(yī)科大學(xué)，2010：1-27.

[5] 趙秀杰，董震，楊占泉，等.鼻超敏反應(yīng)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕J].中華耳鼻咽喉科雜志，1993，28(1)：17-18

[6] 季雪峰.金銀花的藥理作用[J].安微醫(yī)藥，2003，7(4)：311-312.

[7] 李斐，黎海芪.金銀花水提物對卵清蛋白致敏小鼠的抗過敏作用研究[J].重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2004，29(3)：342-347.

[8] 小川優(yōu)子.金銀花抗促過敏作用[J].國際中醫(yī)中藥雜志，2006，28(6)：115-121.

[9] Bousquet J，Chanez P，Lacoste J Y，et al.Asthma：a disease remodeling the airways[J].Allergy，1992，47(1)：3-11.

[10] Orchard T R.Williams H.Inflammatory bowel disease[J].Prog Drug Res，2016，71(4)：117-222.

[11] Liu A H，Murphy J R.Hygiene hypothesis：fact or fiction[J].J Allergy Clin Immunol，2003，111(3)：471-478.

[12] Kawai T，Akira S.The Role of pattern-recognition in innate immunity：update on Toll-like receptors[J].Nat Immunol，2010，11(5)：373-384.

[13] Akira S，Uematsu S，Takeuchi O.Pathogen recognition and innate immunity[J].J Immunol，2006，124(4)：783-801.

[14] Akira S.Pathogen recognition by innate immunity and its signaling[J].Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci，2009，85(4)：143-156.

[15] Gold M S，Kemp A S.Atopic disease in childhood[J].Med J Aust，2005，182(6)：298-304.

[16] 徐志鴻，楊成章.Th1/Th2失衡與變應(yīng)性鼻炎[J].臨床耳鼻咽喉科雜志，2004，18(8)：510-512.

[17] Romagnani S.Regulation of the T cell response[J].J Immunol，2006，36(7)：1357-1366.

(2017-02-06 收稿)

Effect of Honeysuckle Extract on Expression of Cytokines in Mice with Allergic Rhinitis

Jian Lei，Xiao Caiwen，He Qingwenetal

DepartmentofOtorhinolaryngology，AffiliatedHospitalofJianghanUniversity，Wuhan430015，China

Objective To establish a mouse model of allergic rhinitis (AR)，and to observe effect of Honeysuckle extract on inflammatory factors in AR mice.Methods Sixty healthy male C57BL/6 mice were randomly divided into 4 groups：blank control group，model control group，treatment group and control group.AR mouse model was established by using ovalbumin(OVA).AR symptom severity was graded by score.Nasal mucosa of the mice was harvested.IL-17 source was analyzed by flow cytometry.Expression levels of IL-2，IL-4，IL-17，IFN-γ and sIgE in serum were detected by ELISA.Eosinophilic granulocytes were counted in nasal mucosa section of the mice.Expression of IL-17 mRNA was detected by RT-PCR.Western blotting was used to detect the expression level of IL-17 protein.Results Symptoms of scratching nose，sneezing and runny nose were significantly alleviated in the Honeysuckle treatment group and positive control group as compared with the control group.The flow cytometry results showed that IL-17 was mainly derived from γδT cells.Eosinophilic granulocyte count，serum IL-4，IL-7 and sIgE，tissue IL-17 mRNA and protein were significantly decreased，while IL-2 and IFN-γ significantly increased in the Honeysuckle treatment group and positive control group as compared with the control group (allP<0.01).Conclusion The extract of Honeysuckle extract can regulate expression of inflammatory factors in OVA sensitized AR mice，and exert immunomodulatory effect on AR.

Honeysuckle extract； mice； allergic rhinitis； interleukin 17； γδT cells

*武漢市衛(wèi)生計(jì)生委2017年度臨床醫(yī)學(xué)科研項(xiàng)目(No.WZ17D14)；湖北省科技廳科技條件資源開發(fā)項(xiàng)目(No.2015BCE099)

R765.213

10.3870/j.issn.1672-0741.2017.03.009

簡 雷，男，1979年生，主治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士，E-mail：jianyutian@163.com

△通訊作者，Corresponding author，E-mail：wb000326@whu.edu.cn