戴偉娟 徐麗娟 王 旭 劉艷華 朱凡河

1.山東濟寧醫(yī)學院，山東 濟寧 272067；2.山東省金鄉(xiāng)縣人民醫(yī)院，山東 金鄉(xiāng) 272067

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穿心蓮內酯對小鼠睪丸組織形態(tài)及NO、iNOS的影響

戴偉娟1徐麗娟2王 旭1劉艷華1朱凡河1

1.山東濟寧醫(yī)學院，山東 濟寧 272067；2.山東省金鄉(xiāng)縣人民醫(yī)院，山東 金鄉(xiāng) 272067

目的：觀察穿心蓮內酯對小鼠睪丸組織形態(tài)及NO、iNOS的影響。方法：取體重25±3g昆明種雄性小鼠，隨機分為5組：生理鹽水組、穿心蓮內酯低、中、高3個劑量組(66.7、200、600mg/kg)、雷公藤組(60mg/kg)，連續(xù)灌胃給藥60d。給藥結束后，處死小鼠，取睪丸，常規(guī)制備組織切片，觀察睪丸組織的形態(tài)學變化，并計數生精細胞層數和數量。制備10%的組織勻漿，分別用硝酸還原酶法、化學比色法測定睪丸組織中NO濃度及iNOS活力。結果：與生理鹽水組相比，光鏡下可見穿心蓮內酯三劑量組及雷公藤組，小鼠睪丸曲細精管發(fā)生不同程度的管壁變薄，生精細胞數量減少，排列疏松，不規(guī)則，成熟的精子較少。睪丸組織中iNOS活力降低，NO的含量減少。結論：長期服用穿心蓮內酯產生的抗雄性生育作用與抑制iNOS活力，減少NO的生成有關。

穿心蓮內酯；睪丸；NO；iNOS

穿心蓮內酯(Andrographolide)又名穿心蓮乙素，是穿心蓮的主要有效成分之一，具有清熱解毒、涼血消腫的功效。藥理研究表明，穿心蓮內酯具有解熱抗炎、抗病毒、抗腫瘤、抗血栓、抗糖尿病、免疫調節(jié)、保肝利膽等作用[1]。國外研究發(fā)現，穿心蓮內酯有阻止精子生成、影響精子的活力與結構的作用[2]。前期研究發(fā)現，穿心蓮內酯體內外給藥，對大鼠精子、胚胎及小鼠精子形成均有明顯影響，可使胚胎發(fā)育異常，精子數量和存活率降低[3]。為進一步探討穿心蓮內酯對睪丸組織的毒性作用及可能機制，實驗在前期工作的基礎上，觀察了睪丸組織的形態(tài)學改變，檢測了小鼠睪丸組織中NO和iNOS的變化，為闡明穿心蓮內酯的生殖毒性機理提供依據。

1 儀器與材料

1.1 實驗動物 昆明種小鼠，雄性，體重(25±3)g，由山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司實驗動物中心提供，動物合格證號SCXK(魯)20130001。1.2 藥品 穿心蓮內酯片(批準文號：國藥準字Z370200500，山東方健制藥有限公司，標示量0.105g)；雷公藤多甙片(批準文號：Z31020415，上海復旦復華藥業(yè)有限公司，標示量10mg)；將穿心蓮內酯片和雷公藤多甙片研碎，用生理鹽水分別配制成穿心蓮內酯6.67mg/mL、20mg/mL、60mg/mL，雷公藤6mg/mL。1.3 試劑 總蛋白定量測試盒(批號：20120426)、一氧化氮測試盒(批號：20120428)、一氧化氮合酶測試盒(批號：20120429)均由南京建成生物有限公司提供。

1.4 儀器 T10 basic IKA勻漿機(北京萌壯科技有限公司)；DK-600S型三用恒溫水箱(上海精宏實驗設備有限公司)；LDZ5-2低速自動平衡離心機(北京醫(yī)用離心機廠)；UV754N紫外可見分光光度計(上海精密科學儀器有限公司)。

2 方法

2.1 實驗方法 隨機將小鼠分為5組:生理鹽水組、穿心蓮內酯低(66.7mg/kg) 、中(200mg/kg)、高(600mg/kg)劑量組、雷公藤組(60mg/kg)，每只小鼠按0.1mL/10g灌胃給藥連續(xù)60d。7d稱重一次，調整劑量。給藥結束2d后，處死小鼠，取一側睪丸，4%甲醛固定，常規(guī)制備組織切片，HE染色，觀察睪丸組織曲細精管的形態(tài)學變化，并計數每只小鼠10個曲細精管的生精細胞層數和數量。取另一側睪丸，制備10%的組織勻漿，用硝酸還原酶法測定睪丸組織中NO濃度，化學比色法測定睪丸組織中iNOS活力。檢測過程嚴格按照試劑盒說明書的操作要求，

3 結果

3.1 對小鼠睪丸組織形態(tài)學的影響 光學顯微鏡下(HE 低倍鏡10×)觀察發(fā)現，生理鹽水組小鼠睪丸曲細精管形態(tài)正常，管壁完整較厚，各級生精細胞層次清晰，排列緊密，規(guī)則有序，胞體充盈，有些可看到成熟的精子，且腔內未見脫落細胞；不同劑量的穿心蓮內酯組及雷公藤組，小鼠睪丸曲細精管發(fā)生不同程度形態(tài)變化，管壁變薄，管腔變大，各級生精細胞排列紊亂，層次不清，數量少而稀松，很難看到成熟的精子。生精細胞層數，各給藥組與生理鹽水組相比有統計學差異(P<0.05)。生精細胞總數，與生理鹽水組比較，穿心蓮內酯中劑量、高劑量及雷公藤組差異有統計學意義(P<0.05)，低劑量組無統計學意義(P<0.05)；而與雷公藤組相比，低劑量和中劑量組有統計學差異(P<0.05)，高劑量組無統計學差異(P>0.05)，結果見圖1、表1及表2。

表1 穿心蓮內酯對小鼠生精細胞層數的影響±s)

注：與NS組相比，*P<0.05。

表2 穿心蓮內酯對小鼠生精細胞數的影響±s)

注：與NS組相比，*P<0.05；與雷公藤組比，#P<0.05。

3.2 對小鼠睪丸組織中NO濃度的影響 與生理鹽水組相比，穿心蓮內酯各組及雷公藤組小鼠睪丸組織中NO含量均降低，低、高劑量組有統計學差異(P<0.05)。其中穿心蓮內酯高劑量組降低最為明顯，而中劑量組雖低于生理鹽水組，但無統計學差異(P>0.05)。穿心蓮內酯各劑量組與雷公藤組相比無統計學差異(P>0.05)。見表3。

表3 穿心蓮內酯對小鼠睪丸組織中NO濃度的影響±s)

注：與NS組相比，*P<0.05。

3.3 對小鼠睪丸組織中iNOS活力的影響 與生理鹽水組相比，雷公藤組睪丸組織內iNOS活力明顯降低，有統計學差異(P<0.05)；穿心蓮內酯各劑量組睪丸組織中iNOS活力也有所降低，有統計學差異(P<0.05)。與雷公藤組相比，穿心蓮內酯各組iNOS降低程度均低于雷公藤給藥組，但無統計學意義(P>0.05)。見表4。

注：與NS組相比，*P<0.05。

4 討論

睪丸是雄性生殖系統的重要器官，其功能是分泌雄性激素及產生精子，它易受溫度、化學物質及藥物的影響，使精子的產生發(fā)生障礙。本研究用穿心蓮內酯連續(xù)給小鼠灌胃60d，取睪丸切片HE染色后，光鏡下觀察發(fā)現，生理鹽水組曲細精管形態(tài)結構完整，生精細胞的層數和數量較多，排列規(guī)則緊密，管腔內可見有精子的形成，而穿心蓮內酯3個劑量組，可看到小鼠睪丸曲細精管生精上皮變薄、管腔有不同程度的增大，生精細胞排列松散而不規(guī)則，層數及總數量減少，很少有成熟的精子，各給藥組生精細胞層數與生理鹽水組相比,其差異性有統計學意義(P<0.05)，各級生精細胞總數與生理鹽水組相比，除低劑量組外，均有統計學差異(P<0.05)。雷公藤所導致的睪丸組織形態(tài)學改變與穿心蓮內酯組基本一致，但各級生精細胞數量減少較為明顯，與穿心蓮內酯3個劑量組相比，僅高劑量組無統計學差異(P>0.05)，其余兩組均有統計學差異(P<0.05)。結果表明穿心蓮內酯的抗雄性生育作用部位是在睪丸，干擾了睪丸曲細精管的生精過程等功能。當劑量較低時對小鼠生精細胞的影響不如60mg/kg的雷公藤多甙，達到一定用量時也能產生與雷公藤多甙相同的抗雄性生育效應。

一氧化氮(Nitric Oxide，NO)是一種具有廣泛生物學活性的氣體信使分子，由NOS催化 L -精氨酸生成，參與體內多種生理或病理過程。研究發(fā)現，NO、NOS也存在于哺乳動物的雄性生殖系統內，對睪丸的微循環(huán)、睪酮的分泌、精子的發(fā)生、成熟及活動等起著雙向調節(jié)作用，生理范圍內NO有助于男性生殖系統的發(fā)育及功能的發(fā)揮，這主要取決于睪丸組織中的NO濃度和NOS的活性。iNOS是誘導型NOS，通常是在受到刺激時才可表達。但研究發(fā)現，iNOS在正常睪丸中如間質細胞、生精小管內的支持細胞、不成熟精子頭部和管周類肌細胞均有表達，提示它可能參與了正常支持細胞和精子發(fā)生過程的調節(jié)[4-7]。本研究結果表明，在正常小鼠睪丸組織中檢測到iNOS的存在，其活力為(2.21±1.24)U/mg·prot，穿心蓮內酯連續(xù)給藥60d，各劑量組均可使睪丸組織中iNOS活性受到抑制，最低到(1.11±0.48)U/mg·prot，減少了近一半。NO的含量亦明顯減少，由正常小鼠的(4.20±2.23)μmol/L最低降到(2.28±1.27)μmol/L，從結果看沒有明顯的劑量依賴性，低劑量與高劑量作用明顯，與生理鹽水組相比有統計學差異(P<0.05)。中劑量與生理鹽水組相比，NO雖有所降低但無統計學差異其原因可能是多方面的，有待進一步的研究探討。結果表明穿心蓮內酯可通過抑制這些部位的iNOS活性，導致NO的生成減少，這與徐芳芳、劉俊等體內外給穿心蓮內酯抑制iNOS表達和NO產生的結果相一致，但它是否對另外兩型NOS有影響仍需做進一步的研究[8-9]。前期的研究發(fā)現，穿心蓮內酯可使精子的數量減少，發(fā)育畸形、活動能力減弱等[2-3]，可推測其機制與穿心蓮內酯抑制iNOS活性，減少了ON的生成，其含量低于正常生理水平，使NO介導的正常生理狀態(tài)下的信號轉導受到限制，干擾了睪丸組織的正常發(fā)育，睪酮的分泌等，使精子數量、成熟度等受到抑制，這種機制與新型植物生長調節(jié)劑增產菊胺酯、氯化鎘、醋酸鉛及二硫化碳的生殖毒性機理基本一致[10-12]。另外，實驗發(fā)現穿心蓮內酯連續(xù)給小鼠60d，血中睪酮的水平明顯降低。

雷公藤具有抗炎和免疫調節(jié)作用，臨床用于自身免疫性疾病，也是新型雄性抗生育藥，研究顯示，大劑量雷公藤片用藥第 3、4周末NO S陽性睪丸間質細胞的數量略有減少，染色變淡[11]，可下調eNOS的表達[13]。實驗發(fā)現雷公藤多甙片能降低睪丸組織中iNOS活性，減少NO的含量，與生理鹽水組比有統計學差異(P<0.05)，但與穿心蓮內酯組相比無統計學差異(P>0.05)，為進一步研究雷公藤對雄性生殖系統的毒性機制提供了新思路。

綜上，穿心蓮內酯具有抗雄性生育作用，提示對生育期的男性盡量不要使用含有穿心蓮內酯的制劑，也可考慮將其作為一種男性避孕藥開發(fā)使用。

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The Effect of Andrographolide on Testicular Tissue Morphology and NO，iNOS in Mice

DAI Weijuan1XU Lijuan2WANG Xu1LIU Yanhua1ZHUFanhe

1.Department of Pharmacology,Jining Medical University,Jining 272067,China 2. People's Hospital of Jinxiang County, Jinxiang 272200,China

Objective To observe the effect of histological changes and iNOS,NO in mice testes submitted to Andrographolide. Methods Male Kunming mice of weight 25±3g were randomly divided into 5 groups：saline group, Andrographolide low dose group, middle dose group ,high dose group and Tripterygium wilfordii group. Drugs were given by gavage once a day for 60 days. After getting testicles out of mouse killed, tissue slices and homogenate were made for observing morphologic changes of testicular tissue,and count the layer number and the quantity of sperm cells. Measuring respectively changes of iNOS,NO by nitrate reduction enzymatic and chemical colorimetric method.Results In three dose groups of Andrographolide and Tripterygium wilfordii, compared with normal saline group, mice testicular seminiferous tubule wall become thinning, and lumen become bigger in different degrees, the decrease in the number of sperm cells (loosely arranged and irregular) were observed. The number of mature sperms decreased and iNOS activity decreased, NO concentration reduced. Conclusion If Andrographolide is taken for long term, the mechanism of Andrographolide resistance to male reproductive function is related to inhibition of iNOS vitality and reduction of the generation of NO.

Andrographolide；Testes；NO；iNOS

山東省計劃生育委員會資助(2010-)。

戴偉娟 (1960-)，女，漢族，碩士，教授，研究方向為心腦血管藥理學。E-mail:weijuan-d@163.com

R285.5

A

1007-8517(2017)11-0052-04

2017-04-04 編輯：程鵬飛)