系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者中miR-410表達及其靶基因生物信息學(xué)分析①

張 濟 歐大明 黃麗芳 歐陽琳 鄒禮衡

(南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，衡陽421001)

·臨床免疫學(xué)·

系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者中miR-410表達及其靶基因生物信息學(xué)分析①

張 濟 歐大明 黃麗芳 歐陽琳 鄒禮衡

(南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，衡陽421001)

目的：檢測miR-410在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者(SLE)中的表達水平，運用生物信息學(xué)方法研究miR-410及其靶基因在SLE發(fā)生發(fā)展過程中的作用。方法：定量檢測miR-410在SLE患者外周血單個核細胞中的表達水平，并通過miR-410序列分析，靶基因預(yù)測和Genecards數(shù)據(jù)庫分析，進一步對其靶基因進行GO富集和KEGG Pathway分析。結(jié)果：miR-410在SLE患者中表達顯著降低，其核苷酸序列在多物種間呈高度保守性。受miR-410調(diào)控且與SLE疾病相關(guān)的潛在靶基因包括FASLG、CSF2、IFNAR2、MAPK1、PLCG2、IL4等。GO分析發(fā)現(xiàn)miR-410的靶基因參與細胞生長增殖、程序性死亡、細胞分化、免疫系統(tǒng)發(fā)育等多個生物過程。KEGG Pathway分析發(fā)現(xiàn)miR-410的靶基因顯著富集在腫瘤途徑信號通路、細胞因子-細胞因子受體相互作用信號通路、膠質(zhì)瘤信號通路、黑色素瘤信號通路、TGF-β和JAK-STAT 信號通路等。結(jié)論：miR-410可能通過直接靶向作用其調(diào)控靶分子，影響SLE患者體內(nèi)多條信號通路的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控，從而參與SLE疾病的發(fā)生和發(fā)展。

miR-410；SLE；靶基因；GO富集；KEGG信號通路

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Systemic lupus erythematosus,SLE)是一種多發(fā)于青年女性的累及多臟器的自身免疫性炎癥性結(jié)締組織病，由于免疫細胞過度增生激活，產(chǎn)生大量的自身抗體，并與體內(nèi)相應(yīng)的自身抗原結(jié)合形成相應(yīng)的免疫復(fù)合物，沉積在皮膚、關(guān)節(jié)、小血管、腎小球等部位，導(dǎo)致皮膚黏膜、骨骼肌肉、心臟、腎臟及神經(jīng)系統(tǒng)等多個組織器官損傷。microRNA(miR)是一類由18～25核苷酸(nt)組成的小分子單鏈非編碼小調(diào)控RNA，它們基于與靶RNA的3′端非翻譯區(qū)(3′-UTR)序列互補結(jié)合，可以降解mRNA和/或抑制蛋白質(zhì)翻譯過程，miR的異常缺失或過表達與多種自身免疫性疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[1-3]。研究報道m(xù)iR-410在多種腫瘤包括前列腺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌等疾病的發(fā)生過程中發(fā)揮重要的抑癌作用[4-6]。最近的研究表明miR-410在SLE患者中存在異常表達，且參與SLE及狼瘡性腎炎的發(fā)病緊密相關(guān)[7,8]，但其與SLE發(fā)生相關(guān)詳細的靶分子的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)仍不清楚。本研究通過生物信息學(xué)方法推測miR-410作用的靶分子在SLE的發(fā)生與發(fā)展中的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，分析可能參與的生物學(xué)過程，為研究其在SLE發(fā)生、發(fā)展的作用和相關(guān)調(diào)控機制奠定基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1臨床標(biāo)本 選擇22 例2015年3月至10月在南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院附屬醫(yī)院風(fēng)濕科診治的初診SLE患者，其中女20例，男2例，年齡13～62 歲，平均(30.92±13.50)歲，所有患者符合美國風(fēng)濕病學(xué)會(ACR)1997年分類診斷標(biāo)準(zhǔn)。正常對照組20例健康體檢者，其中女18例，男2例，年齡12～59歲，平均(31.42±12.26)歲，年齡和性別與SLE患者組比較差異無明顯統(tǒng)計學(xué)意義。

1.1.2主要試劑和儀器 人外周血淋巴細胞分離液購自天津灝洋公司，TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司， 人miR-410及內(nèi)參U6的引物均購自廣州銳博生物技術(shù)有限公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒為Thermo Scientific公司，2×Power Taq PCR MasterMix為北京百泰克生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，PCR 擴增儀為 Bio-Rad DNA Engine Peltier Thermal Cycle。

1.2生物信息學(xué)網(wǎng)站和軟件 運用UCSC基因組在線軟件工具(http://genome.ucsc.edu/)分析has-miR-410在人類基因組中的位置及保守性。運用Targetscan (http://www.targetscanorg/)在線網(wǎng)站預(yù)測has-miR-410調(diào)控的靶基因分子，Genecards數(shù)據(jù)庫(http://www.genecards.org/)查詢與SLE發(fā)病相關(guān)的疾病基因。采用DAVID數(shù)據(jù)庫(http://david.abcc.ncifcrf.gov/)對has-miR-410預(yù)測靶基因集合進行功能富集分析(GO分析) 和基于KEGG數(shù)據(jù)庫(http：//www.genome.jp/)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路富集分析(Pathway分析)。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，得到基因集合相對于背景具有統(tǒng)計學(xué)意義的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及疾病通路。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理 統(tǒng)計分析采用 SPSS16.0 軟件進行對miR-410定量RT-PCR結(jié)果進行分析，組間比較分析采用t檢驗，P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1miR-410在人類基因組中的位置及保守性分析用 通過UCSC基因組在線瀏覽工具獲得miR-410在人類基因組中的位置(圖1),miR-410定位于人類14q32.31人染色體上101065912-101065991位置,長度共80 bp，其核苷酸序列在人、獼猴、小鼠、狗、大象五種個體中呈高度保守。

2.2miR-410在SLE患者中的表達 對22例SLE患者及20例正常對照人群的外周血經(jīng)淋巴細胞分離液分離，提取單個核細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄后，經(jīng)熒光定量PCR檢測miR-410在外周血單個核細胞中的表達，結(jié)果顯示，miR-410在SLE患者中的表達水平較正常對照人群明顯減低(圖2)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.3篩選與SLE發(fā)病相關(guān)的miR-410靶基因 對人miR-410通過使用Targetscan在線預(yù)測分別獲得601個潛在調(diào)控靶基因。此外，在Genecards數(shù)據(jù)庫中查詢與SLE發(fā)病相關(guān)的疾病基因共2 446個。將兩個數(shù)據(jù)庫所得基因進行對比分析取其交集,結(jié)果顯示在兩個數(shù)據(jù)庫同時出現(xiàn)有FASLG、CSF2、IFNAR2、MAPK1、PLCG2、IL4等共61個基因，它們在細胞內(nèi)信號傳導(dǎo)通路中扮演重要角色，與細胞生長增殖、分化、凋亡等活動密切相關(guān)(表1)。

圖1 miR-410在基因組位置和保守性分析Fig.1 Genomic location and conservation analysis of miR-410

2.4miR-410預(yù)測靶基因的GO分類富集分析 對miR-410潛在調(diào)控靶基因和Genecards數(shù)據(jù)庫中交集出現(xiàn)的61個基因進一步進行GO注釋信息富集分析。GO注釋信息中分子功能項顯示,miR-410 靶基因存在于細胞程序性死亡、細胞增殖、粒細胞分化、磷酸化反應(yīng)、造血和淋巴器官的發(fā)育和免疫系統(tǒng)發(fā)育等多個細胞生物學(xué)過程中(表2) 。

2.5miR-410預(yù)測靶基因的KEGG信號通路分析

圖2 miR-410在SLE和正常人群的表達Fig.2 Expression of miR-410 in SLE patients and healthy controlsNote: *.P<0.05.

表1 miR-410預(yù)測靶基因GO富集分析結(jié)果

表2 miR-410預(yù)測靶基因KEGG信號通路分析

圖3 miR-410靶基因在 TGF-β 信號通路中的分布Fig.3 Distribution of predicted target genes of miR-410 in TGF-β signaling pathway

利用DAVID在線軟件對miR-410預(yù)測的靶基因和SLE患者Genecard數(shù)據(jù)庫的疾病相關(guān)基因集合進行對比分析獲得的61個基因進行信號通路分析。KEGG 信號通路分析顯示,這61個交集基因顯著富集于腫瘤通路、細胞因子-細胞因子受體相互作用、膠質(zhì)瘤、黑色素瘤、TGF-β、JAK-STAT 信號通路等，詳情見表3，我們選取了TGF-β信號通路途徑中靶基因繪制分布示意圖舉例說明(圖3)。

3 討論

研究表明miR與生物體細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)節(jié)密切相關(guān)，它不僅可以通過調(diào)控單一或多個信號通路中的上下游靶基因蛋白的表達，還可以選擇調(diào)控基因網(wǎng)絡(luò)中的調(diào)節(jié)子如轉(zhuǎn)錄因子等，從而實現(xiàn)對細胞特定功能和表型的有效調(diào)控。本研究對miR-410在多個物種間成熟序列比對分析發(fā)現(xiàn)物種間其序列呈高度保守，表明該基因在不同物種中可能發(fā)揮重要的調(diào)控作用。本課題組對SLE患者和正常對照患者的外周血單個核細胞中miR-410基因表達檢測發(fā)現(xiàn)在SLE患者其表達水平較正常人群明顯降低(P<0.05)，提示其在SLE疾病的發(fā)生發(fā)展過程中可能扮演重要作用。國內(nèi)學(xué)者Lin課題組最新的研究報道在SLE患者外周血CD3+/CD4+T淋巴細胞中miR-410表達較正常對照人群顯著減低[7,8]，其在胞內(nèi)基因表達情況與本實驗的結(jié)果一致。已有大量研究發(fā)現(xiàn)miR-410是胞內(nèi)一個重要的抑癌基因，它可以通過調(diào)控Snial、Bak1、VEGF、MDM2等靶基因的調(diào)節(jié)多種腫瘤細胞的增殖、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移等各種細胞生物學(xué)活動[5，6，9，10]。

對 miR靶基因的尋找往往基于生物信息學(xué)分析，用于miRNA靶基因預(yù)測的軟件種類很多，包括TargetScan、miRanda、TarBase、miRBase等。雖然現(xiàn)有的幾種預(yù)測程序在技術(shù)細節(jié)上有所不同，但它們預(yù)測的基本原理相似，都是基于miRNAs與靶標(biāo)的結(jié)合機制，本實驗選用的TargetScan軟件為了在預(yù)測的開始過程排除假陽性，首先要求seed嚴(yán)格配對，延伸序列直到不配對的區(qū)域，然后根據(jù)保守性原則，淘汰不具有3′UTRs保守序列的分子，最后運用RNAFold進行熱力學(xué)穩(wěn)定性篩選，因而其預(yù)測結(jié)果的準(zhǔn)確性較高，也是最為常用的miR靶基因預(yù)測軟件。近年來很多運用生物信息學(xué)方法預(yù)測miR靶基因再聯(lián)合疾病Genecards數(shù)據(jù)庫對疾病相關(guān)分子的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進行前瞻性分析，都為后續(xù)實驗驗證獲得的大量非常有價值的線索[11,12]。本研究分析Genecards數(shù)據(jù)庫中與SLE相關(guān)的疾病基因與TargetScan預(yù)測得到的miR-410潛在靶基因交集包括FASLG、CSF2、IFNAR2、MAPK1、PLCG2、IL4等基因。FASLG基因表達產(chǎn)物是FAS的配體，F(xiàn)as/FASL信號通路是調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)必不可少的，包括誘導(dǎo)活化的T細胞和細胞毒性T淋巴細胞誘導(dǎo)的細胞死亡，F(xiàn)as/FASL異常表達與SLE患者的疾病發(fā)生密切相關(guān)[13,14]。MAPK1在SLE患者外周血單個核細胞中表達增高，并與輔助性T細胞轉(zhuǎn)錄因子基因共同調(diào)節(jié)T細胞功能，調(diào)控機體內(nèi)炎癥活動[15]。信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)是細胞內(nèi)重要的信號因子，與腫瘤發(fā)生的報道較多。然而，最近Lin等[8]報道在SLE患者中miR-410是一個非常重要的調(diào)節(jié)因子，它可通過靶向結(jié)合STAT3基因3′UTR調(diào)控其基因表達，繼而通過胞內(nèi)信號傳導(dǎo)影響細胞IL-10基因表達，在SLE疾病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。

采用信息學(xué)預(yù)測方法能夠快速尋找miRNA與疾病相關(guān)的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。Gene Ontology(GO)和KEGG信號通路富集分析是預(yù)測和尋找與疾病發(fā)生相關(guān)的靶分子及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的重要方法[16-18]。本實驗結(jié)果提示miR-410的潛在靶基因可能通過腫瘤通路、細胞因子-細胞因子受體相互作用、膠質(zhì)瘤、黑色素瘤、TGF-β、JAK-STAT信號通路等參與SLE疾病發(fā)生過程中。有研究報道，JAK/STAT信號通路異常與SLE疾病發(fā)生密切相關(guān)，通過抑制JAK/STAT、NF-κB和MAPK活性，可以減輕SLE模型中腎臟的損傷程度[19,20]。Moulton等[21]報道T細胞受體通路異常導(dǎo)致T細胞的正常功能缺失，在SLE發(fā)病過程中扮演至關(guān)重要的角色，T細胞受體(TCR/CD3)介導(dǎo)的SLE患者T細胞的刺激顯示增加蛋白酪氨酸磷酸化的更快的動力學(xué)細胞蛋白質(zhì)，增加鈣離子通量的響應(yīng)，并降低IL-2的產(chǎn)生。此外，自然殺傷細胞介導(dǎo)的細胞毒性通路與SLE發(fā)生的關(guān)系也被證實[22,23]。

綜上所述，生物信息學(xué)預(yù)測所得信息能對miR與疾病發(fā)生關(guān)系的研究起到很好的前瞻性作用。本研究通過對miR-410進行序列分析、靶基因預(yù)測、GO分析和KEGG信號通路分析，結(jié)果顯示在SLE發(fā)病過程中miR-410可能通過調(diào)控多個與SLE發(fā)病相關(guān)的靶基因，并可能參與多條信號通路的調(diào)節(jié)。上述分析揭示miR-410與靶基因信號通路可作為頗有研究價值的生物學(xué)靶標(biāo)，為闡明miR-410在SLE發(fā)病過程中所涉及的靶分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供理論基礎(chǔ)，并為進一步深入研究其分子生物功能驗證的實驗指明方向。

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[收稿2016-10-12 修回2016-11-17]

(編輯 許四平)

miR-410expressionandbioinformaticsanalysisofitspredictedtargetgenesinsystemiclupuserythematosus

ZHANGJi,OUDa-Ming,HUANGLi-Fang，OUYang-Lin，ZOULi-Heng.DepartmentofRheumatism，theFirstAffiliatedHospitalofUniversityofSouthChina,Hengyang421001,China

Objective:To detect expression level of miR-410 in patients with systemic lupus erythematosus (SLE),and to expose the role of miR-410 and its target genes by bioinformatics methods.Methods:Expression level of miR-410 were detected by quantitative RT-PCR in peripheral blood mononuclear cells of SLE patients,and miR-410 sequence,its target genes and Genecards database were analyzed,and analysis of GO enrichment and KEGG Pathway was further performed.Results:miR-410 expression was significantly reduced in SLE patients,and its nucleotide sequence was highly conserved among species.These genes that were predicted to be regulated by miR-410 and associated with LE pathogenesis,included FASLG,CSF2,IFNAR2,MAPK1,PLCG2,IL4 and other genes.Analysis of GO enrichment revealed that miR-410′s target genes were involved in cell growth,proliferation,programmed cell death,cell differentiation,immune system development and other biological activities.Analysis of KEGG Pathway showed that the target genes of miR-410 were significantly enriched in a series of signaling pathways including pathways in cancer,cytokine-cytokine receptor interaction,glioma,melanoma,TGF-β and JAK-STAT signaling pathway.Conclusion:miR-410 maybe directly regulate its target molecules,mediate various signal pathway networks,thus participate in the occurrence and development of SLE.

miR-410;SLE;Target gene;GO enrichment;KEGG pathway

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.06.016

①本文為國家自然科學(xué)青年基金(No.81301774)和湖南省自然科學(xué)基金(No.2016JJ2108)。

張 濟(1979年-)，男，博士，副教授，主要從事臨床自身免疫性和血液系統(tǒng)疾病發(fā)病機制研究，E-mail:zhang_ji001@126.com。

R593.2

A

1000-484X(2017)06-0884-05