呂卓 刁夢雪 高雅雯 王虹蘇

(吉林大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，長春130062)

以濾紙為模板合成新型介孔生物活性玻璃微管材料

呂卓 刁夢雪 高雅雯 王虹蘇＊

(吉林大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，長春130062)

用快速濾紙為生物模板，通過先浸漬后焙燒的方法合成了介孔生物活性玻璃微管材料?？焖贋V紙的管狀結(jié)構(gòu)被完美復(fù)制，其管壁為生成的介孔生物玻璃材料。通過在合成過程中引入鐵元素可以使材料具有一定的磁性。材料的形貌、結(jié)構(gòu)和磁性通過掃描電鏡、粉末X射線衍射、透射電鏡、氮氣吸附-脫附曲線，紅外光譜和磁滯回線進行了表征。并且通過模擬體液浸泡方法考察了其礦化能力，以地塞米松為模型藥物考察其釋藥能力和生物相容性。合成的介孔生物活性玻璃微管材料具有復(fù)雜的管狀多級結(jié)構(gòu)、快速的礦化能力和良好的生物相容性，并具備一定的磁性，是一種不可多得的藥物緩釋材料。

濾紙；介孔的；生物活性玻璃微管；磁性；藥物緩釋

0 引言

介孔生物活性玻璃(MBG)與傳統(tǒng)溶膠-凝膠生物活性玻璃相比，具有高度有序的介孔結(jié)構(gòu)，更大的比表面積，在藥物輸送領(lǐng)域有著更廣闊的應(yīng)用前景[1-2]。但其孔徑只有幾個納米，不利于大分子藥物擔(dān)載、細胞附著和營養(yǎng)物質(zhì)輸送，如何實現(xiàn)藥物的控制釋放也是亟需解決的問題。近年來，已有相當(dāng)數(shù)量的模板誘導(dǎo)合成微納結(jié)構(gòu)材料的文獻報道[3-5]。以生物模板為硬模板合成的不同結(jié)構(gòu)的介孔生物活性玻璃材料的制備和應(yīng)用引起很大關(guān)注[6-8]。在過去的幾年里，不同形態(tài)和結(jié)構(gòu)的生物活性玻璃被合成出來。采用不同的人工或是天然的硬模板可以賦予多孔生物活性玻璃不同的3D結(jié)構(gòu)，而形態(tài)和結(jié)構(gòu)的多樣性又賦予了多孔生物活性玻璃不同的功能[9-14]。其中，纖維狀結(jié)構(gòu)優(yōu)點很多，比如甘蔗的莖中有很多纖維狀結(jié)構(gòu)，能夠上下傳輸水分和養(yǎng)分。翡翠、和田玉中的纖維交織結(jié)構(gòu)賦予材料硬度高、韌性強等特點。牛奶纖維擁有親膚特性，木纖維的透氣性和排汗效果尤為出色，竹纖維的透氣除臭效果好。在眾多的天然或人工模板中，以天然纖維素底物為模板，例如濾紙和蛋殼膜，可以使合成的納米材料擁有纖維狀的納米結(jié)構(gòu)。例如，黃等[15]合成的二氧化硅納米管就是使用濾紙和十六烷基三甲基溴化銨為雙模板，制備出纖維狀結(jié)構(gòu)的納米材料。董等[16]制備的多級孔二氧化鈦材料是采用蛋殼膜為生物模板，通過溶膠-凝膠法經(jīng)煅燒制備而成的材料擁有精細的網(wǎng)狀交聯(lián)結(jié)構(gòu)。我們使用纖維交聯(lián)結(jié)構(gòu)的快速濾紙為硬模板合成介孔生物活性玻璃微管材料，以期其擁有良好的營養(yǎng)輸送和藥物釋放能力。在合成介孔生物活性玻璃微管材料的過程中，適量引入鐵元素，使材料具備一定的磁性，能夠?qū)崿F(xiàn)材料的快速分離和靶向性。

本研究以快速濾紙和聚乙二醇-聚丙三醇-聚乙二醇(P123)介孔模板作為合成介孔生物活性玻璃微管材料的雙模板，采用水熱法合成介孔生物活性玻璃微管，并在合成過程中加入三氯化鐵，焙燒后生成磁性介孔生物活性玻璃微管，進而擔(dān)載地塞米松，研制一種具有藥物緩釋功能的磁性介孔微管材料。該材料與我們采用天然海綿為模板合成的多級孔生物活性玻璃相比[17-18]，該材料除可具有一定磁性外，與天然海綿為模板合成的多級孔生物活性玻璃22天的釋藥時間相比，該材料一維中空微米級管狀的結(jié)構(gòu)使地塞米松的釋藥時間更短，3天的釋藥時間使得該材料也可作為口服藥物的載體。

1 實驗部分

1.1 合成介孔MBG微管材料

首先，介孔生物活性玻璃(MBG)母液按照文獻方法合成[1]。以P123為介孔模板劑，取4 g P123加入60 mL乙醇(C2H5OH)和1 mL 0.5 mol·L-1HCl水溶液，攪拌至完全溶解。然后，加入6.7 g正硅酸乙酯(TEOS)，0.73 g磷酸三乙酯(TEP)和1.4 g四水合硝酸鈣(Ca(NO3)2·4H2O)，混合液室溫攪拌24 h。即得到了∶nCa∶nP∶nSi=15∶5∶80的MBG母液。通過在母液合成過程中加入FeCl3來引入鐵元素，分別按nFe∶nCa∶nP∶nSi=5∶10∶5∶80和nFe∶nCa∶nP∶nSi=10∶5∶5∶80的比例來決定鐵的加入。選取市售快速濾紙為大孔模板，剪成2 cm×2 cm見方，浸入含有介孔模板劑(P123)和硅源(TEOS)的MBG母液中，多余的母液用膠頭吸管吸走。濾紙材料干燥后，重復(fù)浸漬，共10次。得到的材料在空氣條件下600℃焙燒6 h以除去P123模板劑。得到的產(chǎn)品按照引入鐵的量分別命名為0Fe-MBG，5Fe-MBG和10Fe-MBG。將MBG母液在空氣中晾干，再焙燒即得介孔生物活性玻璃(MBG)材料。

1.2 體外礦化實驗

我們所制備的模擬體液(SBF)的離子組成與人體體液相似，其中Na+、K+、Ca2+、Mg2+、Cl-、HCO3-、HPO42-和SO42-的物質(zhì)的量之比為142∶5∶2.5∶1.5∶147.8∶4.2∶1∶0.5，模擬體液的pH值為7.4[19]。將上面合成的介孔生物活性玻璃微管分別浸泡在50 mL的模擬體液中，用恒溫氣浴震蕩器在37℃震蕩6、24、72和168 h，用于觀察礦化情況。

1.3 藥物的負載和釋放

將0.2 g煅燒后的10Fe-MBG一直懸浮在濃度為10 mg·mL-1的20 mL DEX溶液中，在室溫條件下攪拌24 h，攪拌完成后分離除去濾液，過濾后的樣品在37℃干燥待用，記為D-10Fe-MBG。取濾液1 mL并適當(dāng)進行稀釋，以確定藥物的負載量，高效液相色譜法(HPLC)測定并計算濾液中剩余的藥品量，以計算出藥品負載在載體上的藥量。藥物緩慢釋放實驗是將0.2 g負載地塞米松藥物的介孔生物活性玻璃微管在37℃溫度條件下浸入到250 mL體液中，分別在6、24、72、120 h取樣并用HPLC測定藥物釋放量，并繪制釋放曲線。

1.4 細胞毒性實驗

使用含有10%血清的(PAA)MEM(Sigma-Aldrich)培養(yǎng)小鼠成骨細胞MC3T3-E1細胞，在96孔板內(nèi)鋪板，使得每孔的細胞數(shù)為1.0×104。將細胞培養(yǎng)板置于含有5%CO2(V/V)的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后，使用不同濃度的材料與細胞共孵育，用MTT法[20]，并使用酶標儀在570 nm讀數(shù)以檢測細胞的存活率。

2 結(jié)果與討論

2.1 表征合成的介孔生物活性玻璃微管材料

圖1為合成的0Fe-MBG，5Fe-MBG和10Fe-MBG材料的粉末XRD圖，可以看到樣品均在2θ= 1.02°存在一個強衍射峰，為介孔生物活性玻璃材料的二維六方結(jié)構(gòu)的(110)晶相峰。

圖1合成的0Fe-MBG,5Fe-MBG和10Fe-MBG材料的小角粉末XRD圖Fig.1Small-angle powder XRD patterns of the synthesized 0Fe-MBG,5Fe-MBG and 10Fe-MBG

圖2 為濾紙模板和合成的0Fe-MBG材料的掃描電鏡表征。圖2a，2b是濾紙模板的原始形貌，從圖2a可清晰看見濾紙纖維素的管狀形貌，圖2b可看到濾紙片為纖維交聯(lián)的形貌，上面布滿小管。圖2c為采用濾紙為模板通過浸漬法制備介孔生物活性玻璃微管材料0Fe-MBG的照片，可以看出煅燒后的材料完整的保持了濾紙材料的片狀，表明煅燒后的介孔生物活性玻璃微管材料具有一定的韌性，這與濾紙模板的纖維素網(wǎng)狀交聯(lián)結(jié)構(gòu)有很大的關(guān)系。圖2d掃描電鏡圖為0Fe-MBG的整體形貌圖，與圖2b形貌相似，表明合成的0Fe-MBG材料復(fù)制了大孔模板快速濾紙的纖維素網(wǎng)絡(luò)狀形貌。圖2e可以看出合成的0Fe-MBG復(fù)制了濾紙模板的纖維管狀結(jié)構(gòu)，寬度約為3 μm。圖2f可以看到0Fe-MBG纖維管狀結(jié)構(gòu)內(nèi)部為復(fù)雜的空心結(jié)構(gòu)。

圖2濾紙掃描電鏡圖(a,b)和焙燒后的以濾紙為模板的介孔生物活性玻璃微管(0Fe-MBG)的照片(c)和其掃描電鏡圖(d,e,f)Fig.2SEM images of filter paper(a,b),image of the after burning mesoporous bioactive glass microtubes(0Fe-MBG)using filter paper as the biotemplate(c)and SEM images of the after burning mesoporous bioactive glass microtubes (0Fe-MBG)(d,e,f)

圖3 為合成的5Fe-MBG和10Fe-MBG材料的掃描電鏡表征。圖3a可以看到5Fe-MBG材料也呈現(xiàn)纖維管狀結(jié)構(gòu)，圖3b可觀察到材料表面有一些球形粒子，此為鐵磁粒子。圖3c可見10Fe-MBG材料仍然保持纖維管狀形貌，并可以看見其為空心管。圖3d可以看到10Fe-MBG材料與5Fe-MBG材料一樣表面有一些小的球形粒子。

圖3 焙燒后的以濾紙為模板的介孔生物活性玻璃微管的掃描電鏡圖5Fe-MBG(a,b)和10Fe-MBG(c,d)Fig.3SEM images of the after burning mesoporous bioactive glass microtubes 5Fe-MBG(a,b)and 10Fe-MBG(c,d)

在以氯化鐵為鐵氧化物的前驅(qū)體時，鐵離子會發(fā)生水解反應(yīng)，先生成鐵的含氧氫氧化物(FeOOH)，再經(jīng)過加熱和相變，會進一步生成Fe2O3[21]。為了進一步明確生成的鐵磁粒子的形式和晶型，我們進行了廣角XRD衍射分析。從圖4中可以看出，隨著鐵含量的增加，特征峰的峰高有明顯變化。其中2θ= 21.10°和36.55°的衍射峰為FeOOH的特征衍射峰[22]。樣品最高峰出現(xiàn)在2θ=26.80°，為γ-Fe2O3晶型的特征衍射峰[23]，由此說明樣品中的鐵為FeOOH和γ-Fe2O3的混合相。

圖40Fe-MBG,5Fe-MBG和10Fe-MBG的XRD圖Fig.4XRD patterns of 0Fe-MBG,5Fe-MBG and 10Fe-MBG

圖5 為引入鐵元素的介孔生物活性玻璃微管10Fe-MBG材料的磁滯回線圖，材料經(jīng)過焙燒處理后，得到的磁滯回線為矩形滯回線，呈現(xiàn)鐵磁性特征。內(nèi)插圖照片可以看到10Fe-MBG具有一定的磁性，能夠被磁鐵吸引。

圖510 Fe-MBG的磁滯回線圖和照片(內(nèi)插圖)Fig.5Magnetization curves and image(inset)of 10Fe-MBG

圖6 焙燒后的介孔生物活性玻璃微管的透射電鏡圖0Fe-MBG(a,b),5Fe-MBG(c,d)和10Fe-MBG(e,f)Fig.6TEM images of the after burning mesoporous bioactive glass microtubes 0Fe-MBG(a,b), 5Fe-MBG(c,d)and 10Fe-MBG(e,f)

圖7介孔生物活性玻璃微管材料0Fe-MBG,5Fe-MBG,10Fe-MBG的氮氣吸附-脫附等溫線(a)及相應(yīng)的孔徑分布(b)Fig.7Nitrogen adsorption-desorption isotherms of the MBG materials 0Fe-MBG,5Fe-MBG,10Fe-MBG(a)and the corresponding pore size distribution(b)

圖6 為樣品的透射電鏡表征，從圖6a中可見樣品0Fe-MBG內(nèi)部的形貌，從圖6b可以清晰觀察到介孔的孔徑在6 nm左右[1,24]。圖6c，6d為5Fe-MBG樣品的透射電鏡圖，圖6e，6f為10Fe-MBG樣品的透射電鏡圖。從6c，6e圖可見材料中鐵磁粒子為球形結(jié)構(gòu)，粒徑分布較均勻。圖6d，6f圖可以進一步看清楚粒徑在5納米左右，并可見明顯的晶格線，說明鐵磁粒子為晶體結(jié)構(gòu)。

圖7a為介孔生物活性玻璃微管材料的N2吸附-脫附等溫曲線，根據(jù)吸附-脫附曲線可以看出0Fe-MBG材料在相對壓力比為0.45處存在一個拐點，其為Ⅳ型吸附脫附等溫線，存在H3型滯后環(huán)，表明樣品具有良好的介孔結(jié)構(gòu)。5Fe-MBG的吸附脫附曲線與0Fe-MBG的相比有了一定的變化，也為Ⅳ型吸附脫附等溫線。在相對壓力為0.5處存在拐點，滯后環(huán)到相對壓力比為1.0左右才閉合，形狀也有較大改變。存在兩次明顯的毛細管凝聚，相對低壓部分為介孔管壁引起的，相對高壓部分的毛細管凝聚現(xiàn)象表明樣品存在相對較大的孔。10Fe-MBG的吸附脫附曲線看出拐點右移更為明顯，在相對壓強為0.8處存在拐點，大孔部分孔吸附非常明顯。圖7b為3種材料的孔徑分布圖，從圖中看出0Fe-MBG材料的介孔的孔徑在6 nm左右，與其透射電鏡結(jié)果十分吻合。5Fe-MBG材料存在2種大小的介孔，孔徑分別為5 nm左右和20多納米。10Fe-MBG的孔徑分布圖顯示在20多納米處有非常明顯的大的介孔，說明樣品為介孔結(jié)構(gòu)。材料中小的介孔為合成的材料的介孔生物活性玻璃微管管壁上的介孔，大些的介孔為焙燒濾紙模板后產(chǎn)生的介孔。

2.2 體外礦化實驗

圖8a為0Fe-MBG材料浸泡在模擬體液后的掃描電鏡照片。從照片中可以看到，浸泡后，在支架的表面由于礦化先出現(xiàn)一些橢圓狀顆粒沉積，這些顆粒狀物質(zhì)為羥基磷灰石顆粒。沉積24 h和72 h后從圖8b和8c看到羥基磷灰石的形貌并無明顯變化，但羥基磷灰石顆粒體積明顯增大。5Fe-MBG和10Fe-MBG材料浸泡在模擬體液后的掃描電鏡照片與0Fe-MBG材料并無明顯變化。為了進一步考察0Fe-MBG，5Fe-MBG和10Fe-MBG材料的礦化程度，我們又做了3種材料浸泡在模擬體液中不同時間后的紅外表征。在圖9所示的紅外譜圖中，605和566 cm-1的出現(xiàn)的振動峰為羥基磷灰石的P-O特征振動峰，可以看出隨浸泡時間的延長，上述3種材料在605和566 cm-1的P-O振動峰均有所增強。說明隨著礦化時間的延長，羥基磷灰石的礦化程度逐漸增大。

圖80 Fe-HMBG被浸泡在SBF中6 h(a),24 h(b)和72 h(c)后的掃描電鏡圖Fig.8SEM images of 0Fe-HMBG soaked in SBF for 6 h (a),24 h(b)and 72 h(c)

圖9 (a)0Fe-MBG,(b)5Fe-MBG,(c)10Fe-MBG分別浸泡在SBF中6、24和72 h的傅里葉紅外光譜圖Fig.9FT-IR spectra of(a)0Fe-MBG,(b)5Fe-MBG,(c)10Fe-MBG soaked in SBF for 6,24 and 72 h,respectively

2.3 體外釋藥實驗

我們選擇抗炎、抗過敏藥物地塞米松(DEX)為模型藥物，通過HPLC測試可以計算出1 g的10Fe-MBG材料可以負載756.3 mg的DEX。藥物緩釋結(jié)果可以從圖10的HPLC結(jié)果看出，隨著釋藥時間的逐漸延長，地塞米松緩慢釋放，在72 h基本全部釋放。這一結(jié)果與我們以前以天然海綿為模板合成的多級孔生物活性玻璃支架相比[17-18]，地塞米松的釋放要快的多。我們認為這與合成材料的微管結(jié)構(gòu)有很大關(guān)系。以快速濾紙為模板合成的介孔生物活性玻璃微管，存在一維中空微米管道結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)使藥物進入和溶出經(jīng)過的路徑較短，因此所需時間也較短，藥物只需要3 d就能全部釋放出來。3 d的時間恰恰與人的消化周期相吻合，因此，這種介孔生物活性玻璃微管材料也可用作一種很好的口服藥物緩釋載體。

圖10 DEX從D-10Fe-MBG中隨時間變化圖Fig.10Release profile of DEX as a function of time from D-10Fe-MBG

2.4 細胞毒性實驗

圖11 將M3T3-E1細胞分別與不同濃度的(0.1～100 μg·mL-1)的MBG(a)、10Fe-MBG(b)和D-10Fe-MBG(c)共同培養(yǎng),在第一天和第三天檢測MTT值Fig.11MTT assay of MC3T3-E1 cells cultured on different concentrations of MBG(a),10Fe-MBG(b)and D-10Fe-MBG(c) ranging from 0.1 to 100 μg·mL-1in 1st day and 3rd day,respectively,Data are displayed as the means from three independent experiments

為了考察材料10Fe-MBG和D-10Fe-MBG對細胞的毒性，我們選取介孔生物活性玻璃(MBG)為對照，通過細胞毒性實驗進行了表征。如圖11所示，上述3種材料均對細胞無毒害作用，不影響細胞活性，安全性好，在0.1～100 μg·mL-1濃度的范圍內(nèi)，隨著材料濃度的增高，顯示出促進細胞生長的作用。其中載藥介孔材料D-10Fe-MBG促進細胞生長的作用最好。

3 結(jié)論

將快速濾紙和P123作為制備介孔生物活性玻璃微管的雙模板制備了新型介孔生物活性玻璃微管材料。該材料能夠復(fù)制濾紙模板的纖維狀交聯(lián)結(jié)構(gòu)，生成中空微米管。通過在合成中加入三氯化鐵，焙燒后生成鐵氧化物，使材料能具有一定的磁性。通過藥物釋放和細胞毒性實驗，證明該材料能對藥物起到緩釋作用并且無細胞毒性、安全性好，有望開發(fā)新型具有抗炎功效的口服緩釋藥物系統(tǒng)。

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Synthesis of New Mesoporous Bioactive Glass Microtubes by Biotemplate of Filter Paper

Lü ZhuoDIAO Meng-XueGAO Ya-WenWANG Hong-Su＊
(College of Food Science and Engineering,Jilin University,Changchun 130062,China)

Mesoporous bioactive glass microtubes were successfully prepared through a surface sol-gel process followed by a calcination treatment and using filter paper as the biotemplate.The tubular structures of rapid filter paper were replicated with the walls containing highly ordered mesoporous bioactive glasses as well.This simple biotemplate method provided a cost-effective and eco-friendly route to obtain advanced self-assembling mesoporous bioactive glass microtubes.By introducing FeCl3,mesoporous bioactive glass microtubes had not only delicate multichannel tubular structures,but also magnetic properties.As-synthesized mesoporous bioactive glass microtubes were characterized by scanning electron microscope(SEM),powder X-ray diffraction(XRD), transmissionelectronmicroscope(TEM)andnitrogenadsorption/desorption,fourier transform IR(FTIR) spectroscopy,and magnetization curves.The in vitro mineralization ability of mesoporous bioactive glass microtubes was tested in SBF to monitor the formation of hydroxycarbonate apatite(HCA).Dexamethasone(DEX) was employed as a model drug and the release profiles showed that the porous materials had a sustained drug delivery capability.The one-dimensional hollow tubular structure of the materials allowed the shorter release time of the DEX.The materials of three-day release time could also be used as carriers for oral drug.The biocompatibilities were also evaluated by culturing the MC3T3-E1 cells on mesoporous bioactive glass microtubes.The results showed that the materials had excellent potential applications in the field of sustained drug delivery.

filter papers;mesoporous;bioactive glass microtubes;magnetic properties;drug delivery

O61

A

1001-4861(2017)06-0947-07

10.11862/CJIC.2017.092

2016-09-01。收修改稿日期：2017-03-22。

國家自然科學(xué)基金(No.31402251)和教育部高等學(xué)校博士學(xué)科點專項科研基金(No.20130061120116)資助項目。

＊通信聯(lián)系人。E-mail：wanghs@jlu.edu.cn