新型細(xì)胞活力檢測EZMTT法的研究

張京京，阮奔放

(浙江工業(yè)大學(xué) 綠色制藥協(xié)同創(chuàng)新中心，浙江 杭州 310014)

新型細(xì)胞活力檢測EZMTT法的研究

張京京，阮奔放

(浙江工業(yè)大學(xué) 綠色制藥協(xié)同創(chuàng)新中心，浙江 杭州 310014)

研究四氮唑鹽/甲臜類EZMTT法檢測細(xì)胞活力和增殖的應(yīng)用并評價EZMTT法的優(yōu)勢.評價EZMTT法檢測細(xì)胞增殖的準(zhǔn)確性，對比EZMTT法與WST-8的靈敏度、毒性及細(xì)胞活力長期跟蹤的應(yīng)用.研究表明：細(xì)胞量為3 000～500 000時，在4 h內(nèi)EZMTT法信號值與細(xì)胞量成正比，且較現(xiàn)有產(chǎn)品WST-8檢測試劑，EZMTT法更靈敏、毒性更低，可實現(xiàn)長達(dá)7 d的細(xì)胞活力跟蹤.0.06%十二烷基硫酸鈉或50 μmol/L鹽酸可中止EZMTT反應(yīng).EZMTT法有望成為更為優(yōu)秀的新一代細(xì)胞活力檢測方法.

EZMTT法；四氮唑鹽/甲臜反應(yīng)；細(xì)胞活力檢測

細(xì)胞活力與增殖檢測是細(xì)胞學(xué)研究不可或缺的一部分.其中四氮唑鹽/甲臜類檢測試劑[1]較為常用，其原理是通過檢測細(xì)胞代謝水平，參與NAD(P)+/NAD(P)H氧化還原反應(yīng)而生成有色甲臜，其檢測信號與線粒體活力[2-4]、活細(xì)胞量呈正比，可通過酶標(biāo)儀定量.因EZMTT法操作簡便、成本低和準(zhǔn)確性較高等優(yōu)點(diǎn)一直被廣泛應(yīng)用于醫(yī)療領(lǐng)域的基礎(chǔ)研究[5-6]，尤其是抗癌藥物的細(xì)胞毒性篩選[7].該類產(chǎn)品主要有MTT，MTS，XTT和WST系列.其中MTT是首批四氮唑鹽/甲臜類顯色劑，其缺點(diǎn)為操作繁瑣[8]，且生成難溶性甲臜可刺穿細(xì)胞膜[9]產(chǎn)生細(xì)胞毒性.而升級產(chǎn)品XTT，MTS和WST系列產(chǎn)品可帶負(fù)電荷，可加入電子受體如吩嗪硫酸甲酯(PMS)作為中介轉(zhuǎn)移細(xì)胞質(zhì)或血漿中電子以促進(jìn)四氮唑反應(yīng)生成可溶性有色甲臜[10]，其主要優(yōu)點(diǎn)是無需加入試劑溶解甲臜，步驟較MTT法簡便，但仍存在一定的細(xì)胞毒性，無法滿足長期檢測，且為了防止信號過飽和一般不超過4 h讀數(shù)，其反應(yīng)會受抗氧化劑影響，如谷胱甘肽[11]，可造成假陽性結(jié)果.

EZMTT反應(yīng)原理類似WST-8，在PMS的參與下和NAD(P)+/NAD(P)H反應(yīng)生成水溶性黃色甲臜，該產(chǎn)物在450 nm處有最大吸收值.于分離的NAD(P)H反應(yīng)中，EZMTT，WST-8與NAD(P)H量均呈線性關(guān)系.較WST-8而言，EZMTT檢測有著范圍更寬、抗氧化劑副反應(yīng)更小和儲存更穩(wěn)定的特點(diǎn)[12].筆者將重點(diǎn)研究EZMTT法在細(xì)胞方法學(xué)上的應(yīng)用.

1 材料與方法

1.1 主要材料及試劑

實驗所用T24細(xì)胞株購于上海中科院細(xì)胞庫；熒光GPF-T24細(xì)胞購于上海樂辰生物，傳代15 代以內(nèi)；EZMTT，WST-8(CCK-8)試劑，化合物3B購于杭州健昵福生物科技公司；CellTiter-LumTM化學(xué)發(fā)光法細(xì)胞活力檢測試劑購于碧云天生物有限公司；RPMI 1640培養(yǎng)，0.25%胰酶+0.02% EDTA溶液，臺盼藍(lán)，二甲基亞砜購于杭州吉諾生物科技有限公司；胎牛血清購于美國Hyclone公司；PMS購于東京化學(xué)工業(yè)公司；細(xì)胞培養(yǎng)瓶，96孔板等耗材購于Corning公司；噻唑藍(lán)(MTT)購于美國Sigma公司；Count star細(xì)胞計數(shù)儀，酶標(biāo)儀購于上海睿鈺生物科技有限公司.

1.2 實驗方法

1.2.1 EZMTT法

EZMTT試劑盒由試劑A和試劑B構(gòu)成，保存于-40 ℃.細(xì)胞種于96孔板中，檢測前吸盡培養(yǎng)基，加入200 倍稀釋的試劑A、試劑B的新鮮培養(yǎng)基，每孔100 μL孵育一定時間后于450 nm處檢測光密度值.檢測結(jié)束后加入不同濃度梯度的十二烷基硫酸鈉(調(diào)節(jié)pH=7)或稀鹽酸，繼續(xù)孵育24 h后檢測，并與0 h作對比.細(xì)胞存活率=(受試組光密度值-空白組光密度值)/(對照組光密度值-空白組光密度值)×100%.相對光密度值=受試組光密度值-空白組光密度值.

1.2.2 WST-8法

用新鮮培養(yǎng)基工作液10 倍稀釋W(xué)ST-8試劑，得到WST-8工作液.吸盡96孔板中原有培養(yǎng)基，加入WST-8工作液，每孔100 μL.于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育一定時間后于450 nm處檢測光密度值.細(xì)胞存活率=(受試組光密度值-空白組光密度值)/(對照組光密度值-空白組光密度值)×100%.

1.2.3 噻唑藍(lán)(MTT)法

96孔板中的待測細(xì)胞每孔加入10 μL MTT溶液(5 mg/mL)，于細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h.吸除溶液，且避免吸走紫色甲臜沉淀.每孔加入100 μL DMSO混勻.于570 nm處檢測光密度值.細(xì)胞存活率=(受試組光密度值-空白組光密度值)/(對照組光密度值-空白組光密度值)×100%.

1.2.4 細(xì)胞計數(shù)法

吸盡96孔板中待測細(xì)胞培養(yǎng)基，每孔加50 μL胰酶.孵育5 min后將細(xì)胞吹打均勻，立即加入臺盼藍(lán)溶液(最終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.04%).于細(xì)胞計數(shù)儀下讀取細(xì)胞濃度，并拍照.注意操作時間，胰酶不能消化過頭，臺盼藍(lán)染色時間在3 min以內(nèi).活細(xì)胞率=活細(xì)胞總數(shù)/(活細(xì)胞總數(shù)+死細(xì)胞總數(shù))×100%.

1.2.5 CellTiter-LumTM化學(xué)發(fā)光法檢測EZMTT或WST-8的細(xì)胞毒性

加入EZMTT和WST-8檢測試劑的孔第7天完成檢測后，吸盡檢測劑，PBS清洗一遍，加入新鮮完全培養(yǎng)基50 μL/孔，再加入CellTiter-LumTM工作液50 μL/孔，振蕩2 min后室溫避光靜置10 min.將培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移至全黑96孔板讀取熒光強(qiáng)度(化學(xué)發(fā)光).

2 結(jié)果與討論

2.1 EZMTT的準(zhǔn)確性和靈敏度高

加入EZMTT檢測劑后1, 2, 3, 4 h，相對光密度值與細(xì)胞量有良好的線性關(guān)系(R2=0.99)，如圖1所示.說明EZMTT檢測細(xì)胞增殖的準(zhǔn)確性.反應(yīng)飽和前，隨孵育時間增加，相對光密度值與細(xì)胞量的比值也越大，即檢測的靈敏度增加.檢測時可注意溶液顏色變化，可多次檢測，但注意不要頻繁取出樣品，保證細(xì)胞良好的培養(yǎng)環(huán)境.

對于同一條件處理的細(xì)胞，通過EZMTT法和WST-8法檢測不同時間點(diǎn)的光密度值.由圖2(a)可知：EZMTT反應(yīng)4 h，化合物3B給藥濃度370 nmol/L組與123 nmol/L組光密度值相差0.2；而8 h時兩組光密度值雖均有所上升，但差異縮小至0.05，說明EZMTT反應(yīng)可能達(dá)到飽和，因此取4 h檢測數(shù)據(jù)用以計算抑制率.圖2(b)表明：WST-8法在孵育4 h時信號組間差異較小，化合物3B給藥濃度370 nmol/L組與123 nmol/L組光密度值相差0.1，而在8 h時兩者達(dá)到0.6，說明WST-8法在4 h時信號靈敏度不及8 h，故取后者用以計算抑制率.經(jīng)比較，EMZTT與MTT，WST-8方法檢測的化合物3B[13]抑制T24細(xì)胞生長曲線無顯著性差異(圖3)，這也證明了EZMTT方法的可靠性.與臺盼藍(lán)染色+細(xì)胞計數(shù)法相比較，10, 1, 0.1 μmol/L的3B抑制率也相近(圖4).但細(xì)胞計數(shù)法需消化細(xì)胞，存在一定的誤差.數(shù)據(jù)顯示EZMTT法在4 h時，對于細(xì)胞生長無抑制組(3 nmol/L化合物3B)與完全抑制組(10 μmol/L化合物3B)，WST-8法檢測的光密度值差異約0.4，而EZMTT法的光密度值差異約為0.75，說明EZMTT法反應(yīng)更快(圖2).說明EZMTT法信號準(zhǔn)確度較高的同時，靈敏度較WST-8法高.

圖1 EZMTT反應(yīng)光密度值與細(xì)胞量的關(guān)系Fig.1 The relationship between OD value of EZMTT assay and cell amount

(a) EZMTT法

(b) WST-8法圖2 EZMTT法和WST-8法檢測化合物3B的細(xì)胞抑制作用Fig.2 Test inhibition of compound 3B by EZMTT and WST-8 assays

圖3 MTT，WST-8和EZMTT法對化合物3B的抑制曲線Fig.3 Inhibition curves of compound 3B that tested by MTT, WST-8 and EZMTT assays

圖4 細(xì)胞計數(shù)法和EZMTT法對化合物3B的抑制曲線 Fig.4 Inhibition bars of compound 3B that tested by cell counting and EZMTT assays

2.2 EZMTT的毒性較低

EZMTT的一大優(yōu)點(diǎn)為低毒性，可滿足長期細(xì)胞檢測.相同條件下，WST-8檢測細(xì)胞量3 000～10 000的孔，信號在24 h后達(dá)到平臺期(圖5b)，而EZMTT法則可持續(xù)長達(dá)7 d的跟蹤(圖5a)，說明其檢測劑的細(xì)胞毒性較低，并未影響細(xì)胞活力及增殖.且7 d后檢測接種3 000細(xì)胞量的孔，WST-8和EZMTT檢測劑對其細(xì)胞活力的影響相差近200 倍(圖6).

2.3 EZMTT方法的終止試劑

由于EZMTT法的低毒性，導(dǎo)致細(xì)胞反應(yīng)無法自然終止，為防止反應(yīng)過飽和，因此可選擇加入終止試劑.數(shù)據(jù)顯示：0.06%十二烷基硫酸鈉(pH=7)(圖7a)或50 μmol/L鹽酸(圖7b)可終止反應(yīng)且光密度值在24 h內(nèi)無顯著性差異.

(a) EZMTT法

(b) WST-8法圖5 EZMTT法和WST-8法跟蹤細(xì)胞活力Fig.5 Cell viability tracking of EZMTT and WST-8 assays

圖6 CellTiter-LumTM法檢測WST-8法與EZMTT法的細(xì)胞毒性Fig.6 Test cellular toxicity of WST-8 and EZMTT assays by CellTiter-LumTM assay

(a) 十二烷基硫酸鈉

(b) 鹽酸圖7 不同濃度十二烷基硫酸鈉和鹽酸對EZMTT反應(yīng)的終止 Fig.7 SDS and HCL of different concentrations that stop EZMTT reactions

3 結(jié) 論

作為四氮唑/甲臜類檢測劑，EZMTT保持了該類檢測劑一貫的優(yōu)點(diǎn)：檢測方便且準(zhǔn)確性高，且生成的甲臜為水溶性，無需加入有機(jī)溶劑溶解，并可根據(jù)試劑的顏色變化追蹤讀數(shù).較CellTiter-LumTM檢測劑等熒光產(chǎn)物的信號檢測成本更低，使用耗材更廉價，適用于高通量篩選.而較同類檢測劑WST-8，EZMTT也有著明顯的優(yōu)勢：反應(yīng)更靈敏，試劑毒性更低.EZMTT的極低毒性可實現(xiàn)長期跟蹤的細(xì)胞活力檢測，且可進(jìn)行后續(xù)反應(yīng)，而WST-8在24 h后對細(xì)胞生長有抑制.因此EZMTT有望成為更為優(yōu)秀的細(xì)胞活力檢測試劑，為細(xì)胞學(xué)研究和藥物活性篩選提供更有利的手段.

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(責(zé)任編輯：朱小惠)

Research on novel cell viability EZMTT assay

ZHANG Jingjing, RUAN Benfang

(Collaborative Innovation Center of Yangtze River Delta Region Green Pharmaceuticals, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China)

This study focused on the application of EZMTT assay based on tetrazolium salts/formazans reaction for cell viability, as well as its superiority evaluation. The accuracy of EZMTT assay was evaluated on efficiency and toxicity. When the cell number is 3 000 to 500 000, the linear dose response can be achieved within 4 hours. The EZMTT assay exhibited higher sensibility and effectiveness compared with WST-8 assay in cell viability test. Besides, the low toxicity allows EZMTT track cell growth in long-term, and the EZMTT reaction could be stopped by 0.06 % SDS or 50 μmol/L HCL. The high efficiency and low toxicity demonstrated the great potential of EZMTT assay for cell viability test.

EZMTT assay; tetrazolium salts/formazans reaction; cell viability assay

2017-04-10

浙江省創(chuàng)新人才啟動金(414800129)

張京京(1993—)，女，四川成都人，碩士研究生，研究方向為細(xì)胞生物學(xué)，E-mail：zhang-jingjing@outlook.com. 通信作者：阮奔放教授，E-mail：ruanbf@zjut.edu.cn.

Q2-33

A

1674-2214(2017)02-0088-04