金賢武，張繼紅，黃道明

（江西省上饒市食品藥品檢驗所，江西上饒334000）

·檢驗檢測·

高效液相色譜法同時測定消炎利膽膠囊中綠原酸和迷迭香酸含量

金賢武，張繼紅，黃道明

（江西省上饒市食品藥品檢驗所，江西上饒334000）

目的建立同時測定消炎利膽膠囊中綠原酸和迷迭香酸含量的高效液相色譜（HPLC）法。方法采用Phenomonex C18柱（250 mm×4.6 mm，5 m），以乙腈（A）－0.1%磷酸溶液（B）為流動相進行梯度洗脫，流速為1.0 m L／min，柱溫為30℃，檢測波長為330 nm。結果綠原酸、迷迭香酸質(zhì)量濃度分別在1.37～68.50，0.87～43.60 g／mL范圍內(nèi)與峰面積線性關系良好，加樣回收率分別為101.04%和98.78%，RSD分別為2.11%和1.68%(n＝6)。結論該試驗所建立的方法準確、可靠、重復性好，可為消炎利膽膠囊的質(zhì)量控制提供科學依據(jù)。

高效液相色譜法；消炎利膽膠囊；綠原酸；迷迭香酸；含量測定；質(zhì)量控制

消炎利膽膠囊為市售中藥復方制劑，屬國家中藥保護品種。該制劑由穿心蓮、溪黃草、苦木3味中藥經(jīng)加工提取制成，具有清熱、祛濕、消炎利膽之功效[1]，用于治療由肝膽濕熱引起的口苦、脅痛、急性膽囊炎、膽管炎，療效較好[2]。據(jù)報道，穿心蓮中含有綠原酸等酚酸類成分[3]，溪黃草中含有咖啡酸、迷迭香酸等酚酸類成分[4]，苦木中含有生物堿類成分[5]。藥理活性研究表明，綠原酸具有廣泛的抗菌、消炎、止血作用，可顯著刺激膽汁的分泌，具有利膽之功效[6]；迷迭香酸具有抗炎、抗菌、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)等生物活性[7]，常作為中藥及制劑質(zhì)量控制的指標成分[8－11]。目前，消炎利膽膠囊的質(zhì)量控制方法為國家食品藥品監(jiān)督管理局標準WS3－135（Z－135）－2002Z－2011[12]。標準中采用薄層色譜（TLC）法對制劑中穿心蓮、溪黃草、苦木藥材進行定性鑒別，采用高效液相色譜（HPLC）法對方中穿心蓮的主要成分——穿心蓮內(nèi)酯和脫水穿心蓮內(nèi)酯的含量進行測定[13]。由于中藥復方所含化學成分多樣復雜，各成分之間具有協(xié)同作用，僅以一種或單類有效成分無法全面表征中藥制劑的物質(zhì)基礎，難以全面控制其內(nèi)在質(zhì)量[14]。故本試驗中以穿心蓮中的綠原酸和溪黃草中的迷迭香酸為指標性成分，建立其HPLC含量測定方法，為消炎利膽膠囊制劑的質(zhì)量控制和評價提供依據(jù)?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters2695型高效液相色譜儀，包括Waterse2489檢測器，Empower工作站（美國Waters公司）；CPA225D型電子天平（德國賽多利斯公司）；KQ－500DE型超聲波清洗機（昆山市超聲儀器有限公司）；純水儀（易普易達科技有限公司）。

1.2 試藥

綠原酸對照品（批號為110831～201204）、迷迭香酸對照品（批號為111871～201404）均購自中國食品藥品檢定研究院，純度均不小于98%；消炎利膽膠囊（哈爾濱一洲制藥有限公司，批號為150904，141205，150609，141007、131003，141004）；甲醇(Merck公司)為色譜純；磷酸、分析甲醇為北京化工產(chǎn)品；水為去離子水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Phenomonex?C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：流動相A為乙腈，流動相B為0.1%磷酸溶液；流速：1.0 m L／min；柱溫：30℃；檢測波長：330 nm；進樣量：10μL。流動相采用如下梯度洗脫程序：0～26 min，6%～22%A；26～58 min，22%～26%A。

2.2 溶液制備

對照品溶液：稱取綠原酸、迷迭香酸對照品適量，精密稱定，加甲醇制成質(zhì)量濃度分別為68.5，43.6μg／mL的混合對照品溶液，搖勻，即得。

供試品溶液：取消炎利膽膠囊10粒，混勻，研細，取約1.0 g，精密稱定，置100 m L容量瓶中，加入70%甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理30min，冷卻，用70%甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，即得。

陰性對照品溶液：依據(jù)處方制備缺穿心蓮、溪黃草的陰性對照樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對照品溶液。

2.3 方法學考察

專屬性試驗：分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液、陰性對照品溶液各10μL，注入HPLC儀，按2.1項下色譜條件分析，結果見圖1。結果表明，2種被測成分能完全分離，陰性對照無干擾。

1.綠原酸2.迷迭香酸A.對照品溶液B.供試品溶液C.陰性對照品溶液圖1高效液相色譜圖

線性關系考察：分別精密吸取2.2項下混合對照品溶液0.2，0.5，1.0，2.0，5.0，10.0mL，置10mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度。分別精密吸取10μL注入HPLC儀分析，以峰面積(Y)對質(zhì)量濃度(X)進行線性回歸。結果綠原酸進樣質(zhì)量濃度在1.37～68.50μg／m L范圍內(nèi)與峰面積線性關系良好，回歸方程為Y＝33 270X－3 394，r＝0.999 9(n＝6)；迷迭香酸進樣質(zhì)量濃度在0.872～43.60μg／mL范圍內(nèi)與峰面積線性關系良好，回歸方程為Y＝32 918X＋5 116，r＝0.999 8 (n＝6)。

精密度試驗：精密吸取2.2項下混合對照品溶液，按2.1項下色譜條件連續(xù)進樣6次，記錄峰面積并計算RSD。結果綠原酸、迷迭香酸的RSD分別為0.82%和1.66%(n＝6)，表明儀器精密度良好。詳見表1。

穩(wěn)定性試驗：取同一批供試品溶液，按2.1項下色譜條件分別于0，2，4，6，8，12，24 h時進樣分析，記錄峰面積并計算RSD。結果，綠原酸、迷迭香酸的RSD分別為1.03%和1.24%(n＝7)，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。詳見表2。

重復性試驗：取同一批樣品，按2.2項下方法平行制備6份供試品溶液，按2.1項下色譜條件分析，記錄峰面積并計算RSD。結果綠原酸、迷迭香酸的RSD分別為1.18%和1.98%(n＝6)，表明方法重復性良好。詳見表3。

加樣回收試驗：取已知含量的樣品6份，每份約0.5 g，按1∶1的比例加入對照品，按2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件分析，計算回收率。結果見表4。

2.4 樣品含量測定

取不同批次樣品約1.0 g，每個批次平行取3份，按2.2項下方法制備供試品溶液，按2.1項下色譜條件分析，以外標法計算含量。結果見表5。

表1 精密度試驗結果（n＝6）

表2 穩(wěn)定性試驗結果(n＝7)

表3 重復性試驗結果（n＝6）

表4 加樣回收試驗結果(n＝6)

表5 樣品含量測定結果（， g／g，n＝3）

表5 樣品含量測定結果（， g／g，n＝3）

含量（mg／g）迷迭香酸0.3891±0.007 0.3369±0.008 0.2012±0.005 0.3245±0.004 0.4556±0.005 0.2274±0.006批號150904 141205 150609 141007 131003 141004綠原酸1.2087±0.023 1.5364±0.031 0.7894±0.018 0.9645±0.024 1.1439±0.032 0.5347±0.011

3 討論

3.1 指標性成分選擇

綠原酸為穿心蓮藥材中的有效成分，具有廣泛的抗菌、消炎作用，可顯著刺激膽汁分泌，具有利膽之功效。迷迭香酸為溪黃草藥材中的主要有效成分，藥理活性研究表明其具有顯著的抗炎、抗菌、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)等活性。2種成分是消炎利膽膠囊發(fā)揮消炎利膽功效的主要活性成分，含量的高低會影響臨床療效，故選擇綠原酸和迷迭香酸作為指標性成分，能有效反映消炎利膽膠囊的質(zhì)量，為消炎利膽膠囊制劑的質(zhì)量控制提供科學依據(jù)。

3.2 檢測波長選擇

全波長掃描結果顯示，綠原酸最大吸收波長為327 nm，迷迭香酸最大吸收波長為330 nm。本研究中，在采用330 nm作為檢測波長時，綠原酸和迷迭香酸能同時成為主要吸收峰，分離度較好，峰形良好，且其他物質(zhì)對綠原酸和迷迭香酸的測定無干擾，能達到測定要求，故選擇330 nm作為檢測波長。

3.3 流動相選擇

綠原酸和迷迭香酸均為弱酸性成分，在流動相中加入一定的酸能抑制其電離，改善峰型。參照文獻[15－16]，本試驗中考察了甲醇－酸水，乙腈－酸水2種流動相。結果表明，乙腈較甲醇更能使被測成分達到完全分離，且柱壓小、基線平，各色譜峰的分離度和理論板數(shù)均能達到要求，故最終選擇乙腈－0.1%磷酸為流動相。

3.4 提取條件選擇

本試驗中先對甲醇和乙醇2種提取溶劑進行考察，結果顯示甲醇的提取效率高于乙醇。鑒于綠原酸和迷迭香酸中均含有羥基等親水性取代基，具有一定的水溶性，故本試驗中考察了50%甲醇、70%甲醇、100%甲醇3種不同濃度的甲醇溶劑。結果顯示，當甲醇溶液體積分數(shù)為70%時，2種被測成分提取率最高；同時本試驗中還對提取方法（超聲、回流）、提取時間（30，45，60min）、料液比（1∶25，1∶50）進行了考察。最終選擇以50倍量70%甲醇超聲提取30min，被測成分提取完全，且耗時少。

3.5 方法評價

HPLC法同時測定消炎利膽膠囊中綠原酸和迷迭香酸的含量，方法穩(wěn)定可行，靈敏度高，重復性好，分離效果強，其他組分干擾小，回收率高，且操作簡便、快速，可為消炎利膽膠囊的質(zhì)量評價和質(zhì)量標準的提高提供理論依據(jù)。含量測定結果表明，不同批次的消炎利膽膠囊中綠原酸和迷迭香酸的含量存在顯著差異，進一步說明僅以穿心蓮內(nèi)酯類成分進行質(zhì)量控制并不能完全保證消炎利膽膠囊制劑的質(zhì)量。

[1]田軍，孫備，楊士友，等.消炎利膽膠囊藥效學研究[J].時珍國醫(yī)國藥，1999，10（10）：724－725.

[2]龍子江，方金紅，高建.等.消炎利膽膠囊利膽抗炎的實驗研究[J].中國中西醫(yī)脾胃雜志，2000，8（1）：34－35.

[3]靳鑫，時圣明，張東方，等.穿心蓮化學成分的研究[J].中草藥，2012，43（1）：164－169.

[4]朱德全，黃松，陳建南，等.不同品種、不同產(chǎn)地溪黃草咖啡酸與迷迭香酸的含量測定[J].中國實驗方劑學雜志，2013，19（2）：114－117

[5]陳猛，范華英，戴勝軍，等.苦木生物堿的化學成分研究[J].中草藥，2007，38（6）：807－810.

[6]趙金娟，戴雪梅，曲永勝，等.綠原酸藥效學研究進展[J].中國野生植物資源，2013，32（4）：1－5.

[7]吳建章，郁建平，趙東亮.迷迭香酸的研究進展[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2005，17（3）：383－387.

[8]余晟嵐，徐果.反相高效液相色譜法測定金嗓口服液中綠原酸含量[J].中國藥業(yè)，2015，24（10）：65－66.

[9]李永偉，何兵，周德兵，等.高效液相色譜法同時測定魚腥草中綠原酸和金絲桃苷含量[J].中國藥業(yè)，2015，24（7）：49－51.

[10]陳琴華，熊琳，李鵬.HPLC測定五靈膠囊中迷迭香酸的含量[J].中國藥師，2015，18（12）：2182－2184.

[11]孫菲，孫欣，金榮.反相高效液相色譜法測定香菊膠囊中迷迭香酸含量[J].中國藥業(yè)，2016，25（7）：43－45.

[12]WS3－135（Z－135）－2002（Z）2004，國家食品藥品監(jiān)督管理局國家藥品標準[S].

[13]陳華.HPLC法測定消炎利膽膠囊中脫水穿心蓮內(nèi)酯、穿心蓮內(nèi)酯的含量[J].醫(yī)學美學美容，2013（12）：44－45.

[14]邵建強.中藥指紋圖譜的研究進展[J].中草藥，2009，40（6）：994－998.

[15]靳如義，安萬學，潘相華.HPLC法測定夏枯草口服液中迷迭香酸的含量[J].藥物分析雜志，2009，29（6）：1010－1012.

[16]劉煥霞，王冬梅，苗秋艷.HPLC法同時測定神康寧丸中4種成分的含量[J].沈陽藥科大學學報，2016，33（3）：226－231.

Content Determ ination of Chlorogenic Acid and Rosm arinic Acid in Xiaoyan lidan Capsules by HPLC

Jin Xianwu，Zhang Jihong，Huang Daoming
（Shangrao Food and Drug Inspection，Shangrao，Jiangxi，China 334000）

Objective To establish an HPLC method for content determination of chlorogenic acid and rosmarinic acid in Xiaoyanlidan Capsules.M ethod The phenomonex?－C18column（250 mm×4.6 mm，5μm）was adopted，the mobile phase was composed of acetonitrile（A）－0.1%phosphoric acid（B）solution with gradient elution，the flow rate was 1.0 m L／min，the column temperature was 30℃，the detecting wavelength was set at 330 nm.Results The ranges of calibration curve of chlorogenic acid and rosmarinic acid were 1.37－68.50，0.87－43.60μg／mL，with the average recoveries of 101.04%and 98.78%，RSDs were 2.11%and 1.68%，respectively（n＝6）.Conciusion The method is accurate，reliable and repeatable，which can provide a more comprehensive basis for quality control of Xiaoyanlidan Capsules.

HPLC；Xiaoyanlidan Capsules；chlorogenic acid；rosmarinic acid；content determination；quality control

R927.2；R975＋.5

A

1006－4931(2017)10－0031－04

2017－02－15)

10.3969／j.issn.1006－4931.2017.10.008

江西省上饒市科技局支撐項目[20162CZD12]。

金賢武，男，大學本科，主管藥師，研究方向為藥物質(zhì)量分析，（電子信箱）jinxianwu2016＠163.com。

黃道明，男，大學本科，副教授，研究方向為藥物質(zhì)量分析，（電子信箱）737259639＠qq.com。