莫小林，伍小燕 ，龔敏陽(yáng)，陳曉明，韋振源

（廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西南寧530023）

·檢驗(yàn)檢測(cè)·

壯藥清解霧化液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

莫小林，伍小燕 ，龔敏陽(yáng)，陳曉明，韋振源

（廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西南寧530023）

目的建立清解霧化液的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法采用薄層色譜法（TLC）對(duì)清解霧化液中的桑葉、一點(diǎn)紅、崗梅根進(jìn)行定性鑒定。采用高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定清解霧化液中蘆丁的含量，色譜柱為Discovery C18柱（250 mm×4.6 mm，5 m），流動(dòng)相為甲醇－0.1%磷酸溶液（35∶65），檢測(cè)波長(zhǎng)為356 nm，流速為1.0mL／min，柱溫為35℃。結(jié)果桑葉、一點(diǎn)紅、崗梅根薄層色譜斑點(diǎn)清晰，陰性對(duì)照無(wú)干擾；蘆丁質(zhì)量濃度在2～20 g／mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好，r＝0.999 6，平均回收率為99.92%，RSD為0.99%（n＝6）。結(jié)論該方法操作簡(jiǎn)單、專屬性和重復(fù)性良好，可作為該制劑的質(zhì)量控制方法。

清解霧化液；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；薄層色譜法；高效液相色譜法；蘆丁

壯藥清解霧化液為廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院在研醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑，由醫(yī)院兒科李偉偉主任醫(yī)師于廣西壯鄉(xiāng)民間挖掘整理而成。全方由桑葉（壯語(yǔ)名Mbawsang）、千里光（壯語(yǔ)名Gogoujleixmingz）、崗梅根（壯語(yǔ)名Raggodiem jcaengh）、一點(diǎn)紅（壯語(yǔ)名Gemh onh）等壯藥材組方，具有疏風(fēng)清熱、解毒利咽的功效[1]，用于治療兒童呼吸道感染性疾病，已有10多年的臨床應(yīng)用經(jīng)驗(yàn)，并取得了一定的臨床療效，但目前尚無(wú)清解霧化液的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。本研究小組欲將其申報(bào)為醫(yī)院制劑，為了確保其質(zhì)量穩(wěn)定性和臨床有效性，本研究中建立了桑葉、崗梅根、一點(diǎn)紅的薄層色譜（TLC）鑒別方法，同時(shí)建立了制劑中桑葉有效成分蘆丁的含量測(cè)定方法?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC－20AT型高效液相色譜儀，包括DGU－20A泵和SPD－20A型紫外檢測(cè)器(日本島津公司）；HCT－360型柱溫箱（天津市恒科技發(fā)展有限公司）；YOKOCS型紫外線透射反射成像儀（武漢藥科新技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司）；GH－25型電子分析天平（精度為十萬(wàn)分之一，德國(guó)Sartorius公司）；KQ3200DE型數(shù)控超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；CD－UPT－Ⅱ－10L型超純水制造系統(tǒng)（成都超純科技有限公司）；HHW型三用恒溫水箱（金壇市大自動(dòng)儀器廠）；硅膠G（青島海洋化工有限公司）。

1.2 試藥

桑葉對(duì)照藥材（批號(hào)為121123－201305），一點(diǎn)紅對(duì)照藥材（批號(hào)為121359－200703）；崗梅根對(duì)照藥材（批號(hào)為121152－201103）；蘆丁對(duì)照品（批號(hào)為100080－201409），以上對(duì)照品和對(duì)照藥材均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；水為超純水，甲醇和磷酸為色譜純，其余試劑均為分析純；清解霧化液樣品（批號(hào)分別為20140403，20140713，20140726，廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑室）。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別[2]

2.1.1 桑葉

取本品40 mL，加甲醇50m L，加熱回流1 h，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0m L，使溶解，加氯仿液30m L振搖，棄去氯仿液，水溶液用水飽和的正丁醇振搖，提取2次，每次20mL，合并正丁醇提取液，正丁醇提取液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。另取桑葉對(duì)照藥材2 g，加乙醇30 mL，回流提取2 h，過(guò)濾，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 m L使溶解，用氯仿振搖，提取3次，每次30 m L，合并氯仿液，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状?m L使溶解，作為對(duì)照藥材溶液。再取缺桑葉的陰性樣品40 mL，按供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照品溶液。照薄層色譜法2015年版《中國(guó)藥典（一部)》附錄ⅥB試驗(yàn)，吸取上述3種溶液各5μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以氯仿－甲醇（13∶1）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置紫外燈下（365 nm）檢視。供試品溶液色譜中，在與桑葉對(duì)照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無(wú)干擾(圖1)。

1－3.供試品溶液4.桑葉對(duì)照藥材溶液5.陰性對(duì)照品溶液圖1桑葉薄層色譜鑒別圖

2.1.2 一點(diǎn)紅

取本品20 m L，加入乙醚20m L，超聲處理30min，過(guò)濾，濾液蒸干，殘?jiān)?0 mL水使溶解，用氯仿提取2次，每次20 m L，合并氯仿液，超聲處理30 min，過(guò)濾，濾液蒸干，殘?jiān)?m L氯仿溶解，作為供試品溶液。稱取一點(diǎn)紅對(duì)照藥材5 g，加80%乙醇80mL，回流提取1 h，過(guò)濾，濾液蒸干，殘?jiān)?0mL水使溶解；加入乙醚20m L，超聲處理30min，過(guò)濾，濾液蒸干，殘?jiān)?0m L水溶解，用氯仿提取2次，每次20 mL，合并氯仿液，超聲處理30min，過(guò)濾，濾液蒸干，殘?jiān)?m L氯仿溶解，制成對(duì)照藥材溶液。另取處方中無(wú)一點(diǎn)紅的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。照薄層色譜法，分別吸取上述3種溶液各5μL，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以甲苯－石油醚－乙酸乙酯（13∶5∶1）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置紫外燈（365 nm）下檢視。供試品色譜中，在與一點(diǎn)紅對(duì)照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無(wú)干擾(圖2)。

1－3.供試品溶液4.一點(diǎn)紅對(duì)照藥材溶液5.陰性對(duì)照品溶液圖2一點(diǎn)紅薄層色譜鑒別圖

2.1.3 崗梅根

取本品20mL，加乙酸乙酯萃取2次，每次25mL，合并乙酸乙酯液，置水浴上濃縮至1m L，作為供試品溶液。稱取崗梅根對(duì)照藥材5 g，加水60 mL，加熱回流提取2 h，過(guò)濾，濾液濃縮至20m L，加乙酸乙酯萃取2次，每次25mL，合并乙酸乙酯液，置水浴上濃縮至1mL，即得崗梅根對(duì)照藥材溶液。另取處方中無(wú)崗梅根的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照品溶液。照薄層色譜法，分別吸取上述3種溶液各5μL，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以甲苯－乙酸乙酯－冰乙酸（5∶2∶1）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置紫外燈（365 nm）下檢視，供試品溶液色譜中，在與崗梅根對(duì)照藥材溶液色譜相應(yīng)位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無(wú)干擾(圖3)。

2.2 桑葉中蘆丁含量測(cè)定(高效液相色譜法)

2.2.1 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Discovery C18柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇－0.1%磷酸溶液（35∶65）；檢測(cè)波長(zhǎng)：356 nm；柱溫：35℃；流速：1.0mL／min；進(jìn)樣量：20μL。理論板數(shù)大于2 000。

2.2.2 溶液制備

對(duì)照品溶液：稱取經(jīng)120℃干燥至恒重的蘆丁對(duì)照品2.50mg，精密稱定，置25m L容量瓶中，加50%甲醇定容至刻度，搖勻，即得（0.100 0mg／m L）。

1－3.供試品溶液4.崗梅根對(duì)照藥材溶液5.陰性對(duì)照品溶液圖3崗梅根薄層色譜鑒別圖

供試品溶液：精密量取本品20mL，于水浴上蒸干，殘?jiān)?0%甲醇20mL溶解，置50mL具塞錐形瓶中，稱定質(zhì)量，超聲提取30min，冷卻至室溫，補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，轉(zhuǎn)移至25m L容量瓶中，加50%甲醇至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

陰性對(duì)照品溶液：精密量取缺桑葉的陰性對(duì)照品溶液20 mL，按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。

2.2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：分別精密吸取供試品溶液、對(duì)照品溶液和陰性對(duì)照品溶液各20μL，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果表明，供試品溶液與蘆丁對(duì)照品溶液色譜在相同保留時(shí)間處有色譜峰，陰性對(duì)照品溶液色譜在此保留時(shí)間處無(wú)色譜峰(圖4)，陰性無(wú)干擾，表明方法具有專屬性。

線性關(guān)系考察：精密吸取蘆丁對(duì)照品溶液（0.100 0 g／L）0.2，0.3，0.4，0.5，1.0，2.0 m L，分別置10 m L容量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得2，3，4，5，10，20μg／mL 6個(gè)質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。按擬訂色譜條件，分別進(jìn)樣20μL，以峰面積(A)對(duì)質(zhì)量濃度(C)進(jìn)行回歸分析，得回歸方程A＝24 093C－10 173，r＝0.999 6 (n＝6)。結(jié)果表明，蘆丁質(zhì)量濃度在2～20μg／m L范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：取蘆丁對(duì)照品溶液（0.100 0 g／L）重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積。結(jié)果的RSD為0.90%（n＝6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一供試品溶液，分別置于0，2，4，8，12，24 h時(shí)進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果峰面積的RSD為2.25%（n＝6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

A.對(duì)照品溶液B.供試品溶液C.陰性對(duì)照品溶液圖4高效液相色譜圖

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批樣品，按2.2.2項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，按擬訂色譜條件測(cè)定。結(jié)果蘆丁的含量平均為15.49μg／mL，RSD為1.35%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：精密量取已知含量的樣品（批號(hào)為20140713）5 m L，各6份，分別精密加入蘆丁對(duì)照品溶液，加低、中、高濃度各3份，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定含量，計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2.4 樣品含量測(cè)定

取3批樣品，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密吸取樣品溶液各20μL，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算樣品中蘆丁的含量。結(jié)果見(jiàn)表2。

3 討論

清解霧化液中的桑葉、崗梅根、一點(diǎn)紅、千里光為主產(chǎn)于廣西的道地藥材，資源廣泛，在廣西民間應(yīng)用廣泛。其中桑葉可祛風(fēng)毒、解痧毒、清熱毒，用于痧病、埃?。人裕⑻m奔(眩暈)、火眼(急性結(jié)膜炎)[3]等；崗梅能解熱毒、通龍路，用于貧痧（感冒）、貨煙媽（咽痛）、埃?。人裕?、肺癰[4]等；一點(diǎn)紅具有通龍路火路、清熱毒、祛風(fēng)毒、除濕毒的功效，民間用于發(fā)旺（風(fēng)濕骨痛）、笨?。ㄋ[）、埃病（咳嗽）、貧痧（感冒）、火眼、貨煙媽（咽痛）、唄農(nóng)（癰腫）[4]等，與中醫(yī)藥理論相符。桑葉對(duì)金黃色葡萄球菌等多種致病菌有抑制作用，桑葉含有揮發(fā)油，對(duì)散熱有良好的療效[5]。從崗梅根中分離得到的10個(gè)三萜及其皂苷類化合物，具有顯著的抗炎、抗菌作用[6－7]。千里光具有抗炎、抗菌、抗急性肝損傷、抗癌等顯著的藥理活性[8－10]。

表1 清解霧化液中蘆丁加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n＝6)

表2 樣品測(cè)定結(jié)果(n＝3)

建立薄層色譜鑒別法時(shí)，對(duì)桑葉的薄層色譜鑒別分別考察了展開(kāi)系統(tǒng)甲苯－乙酸乙酯－甲酸（5∶3∶1）[11]、甲苯－乙酸乙酯－甲酸（8∶2∶1）[12]和氯仿－甲醇（13∶1），展開(kāi)系統(tǒng)氯仿－甲醇（13∶1）分離效果好，斑點(diǎn)清晰，陰性無(wú)干擾。對(duì)一點(diǎn)紅的薄層色譜鑒別分別考察了展開(kāi)系統(tǒng)氯仿－甲醇－甲酸（30∶1∶0.1）、甲苯－乙酸乙酯－甲醇－甲酸（5∶4∶1∶1）、甲苯－石油醚－乙酸乙酯（13∶5∶1），結(jié)果甲苯－石油醚－乙酸乙酯（13∶5∶1）展開(kāi)系統(tǒng)Rf值適中，因此采用此系統(tǒng)。對(duì)崗梅根的薄層色譜鑒別分別考察了甲苯－乙酸乙酯－冰醋酸酸（10∶3∶1）、甲苯－乙酸乙酯－冰醋酸酸（5∶2∶1），后者展開(kāi)效果較好，分離斑點(diǎn)清晰。

建立高效液相色譜法時(shí)，根據(jù)蘆丁可溶于熱水、甲醇、乙醇的性能，本試驗(yàn)中采用了不同溶劑水、50%甲醇、80%甲醇、甲醇、50%乙醇、70%乙醇、95%乙醇提取蘆丁，發(fā)現(xiàn)以50%甲醇提取最完全，樣品分離最好，雜峰少。比較了超聲提取時(shí)間（20，30，40，60min），發(fā)現(xiàn)超聲提取30min即可提取完全，為了節(jié)省時(shí)間，選擇提取時(shí)間為30 min。比較了甲醇－水、甲醇－醋酸和甲醇－磷酸等流動(dòng)相系統(tǒng)及其比例，結(jié)果以甲醇－0.1%磷酸溶液（37∶63）得到的色譜峰分離度最好，基線平整，峰塔板數(shù)高，適合該制劑的測(cè)定。

本研究中對(duì)清解霧化液中的桑葉、崗梅根、一點(diǎn)紅薄層色譜鑒別進(jìn)行了提取方法和展開(kāi)劑的篩選，得到的斑點(diǎn)清晰，可用于該制劑的藥材鑒別。采用高效液相色譜法建立了制劑中蘆丁的含量測(cè)定方法，操作簡(jiǎn)單，準(zhǔn)確可靠，為建立清解霧化液的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)奠定了基礎(chǔ)。

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[4]廣西壯族自治區(qū)食品藥品監(jiān)督管理局.廣西壯族自治區(qū)壯藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(第一卷)[M].南寧：廣西科學(xué)技術(shù)出版社，2008：120.

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Quality Standard of Qingjie A tom ized Liquid

Mo Xiaolin，Wu Xiaoyan，Gong Minyang，Chen Xiaoming，Wei Zhenyuan
（First Affiliated Hospital of Guangxi Traditional Chinese Medicine University，Nanning，Guangxi，China 530023）

Objective To establish the quality standard of Qingjie Atomized Liquid.M ethods The Morus Alba，Emilia Sonchifolia and Radix Ilicis Asprellae in the Qingjie Atomized Liquid were identified by thin layer chromatography（TLC）.The content of rutin in the Qingjie Atomized Liquid was determined by high performance liquid chromatography（HPLC）.The column was Discovery C18column（250 mm×4.6 mm，5μm）with mobile phase of methanol－0.1%phosphoric acid solution（35∶65），the detection wavelength was 356 nm，the flow rate was 1.0 m L／min，the column temperature was 35℃.Resu lts The TLC spots of Morus Alba，Emilia Sonchifolia and Radix Ilicis Asprellae were clear and showed negative control without interference.The concentration of rutin is linear in the range of 2－20 g／mL and had a good linear relationship with the peak area，r＝0.999 6，the average recovery was 99.92%，RSD was 0.99%（n＝6）.Conclusion The method is simple，specific and reproducible，which can be used for the quality control of Qingjie Atomized Liquid.

Qingjie Atomized Liquid；quality standard；TLC；HPLC；rutin

R284.1

A

1006－4931(2017)10－0027－04

2017－02－08)

10.3969／j.issn.1006－4931.2017.10.007

廣西壯族自治區(qū)衛(wèi)生廳中醫(yī)藥科技專項(xiàng)制劑類課題資助項(xiàng)目和醫(yī)院制劑遴選課題[GZYZ1104]；全國(guó)中藥特色技術(shù)傳承人才培訓(xùn)項(xiàng)目[J20164811007]。

莫小林，副主任中藥師，研究方向?yàn)橹苿╅_(kāi)發(fā)和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，（電話）0771－5645433（電子信箱）moxiaolin＠163.com。

伍小燕，主任中藥師，研究方向?yàn)橹兴庤b定和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，（電話）0771－5848631（電子信箱）yxbwxy＠163.com。