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      氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用鑒定基于水酶法制備的虹鱒魚骨油組分

      2017-07-12 05:51張婭金鳳郭子璇吳迪范巍巍
      分析化學(xué) 2017年7期
      關(guān)鍵詞:魚骨魚油

      張婭++金鳳++郭子璇++吳迪++范巍巍++王震宇++杜明

      摘要采用水酶法制備虹鱒魚骨油,單因素分析法優(yōu)化虹鱒魚骨酶解的工藝條件,考察了料液比、pH值、酶解時(shí)間、酶解溫度、加酶量5個(gè)因素對(duì)魚油提取率的影響,采用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用 (GCMS) 技術(shù)對(duì)魚骨油的脂肪酸組成和含量進(jìn)行了分析鑒定。結(jié)果表明,在55℃、pH 7.5、酶解時(shí)間為3 h、料液比為1∶1、加酶量為2000 U/g的條件下,利用堿性蛋白酶提取的虹鱒魚骨油中的油脂含量最高。GCMS分析結(jié)果表明,虹鱒魚骨油中主要成分是不飽和脂肪酸,含量為脂肪酸總量的80.4% (w/w),其中單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸分別約占不飽和脂肪酸的76.9%和23.1% (w/w), DHA和EPA的總量為3.4% (w/w)。本研究優(yōu)化了虹鱒魚油的提取技術(shù),對(duì)虹鱒魚油的主要揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行了分析鑒定,初步確定了其中對(duì)魚油風(fēng)味起主要貢獻(xiàn)的物質(zhì),對(duì)魚油產(chǎn)品的分析與鑒別具有參考價(jià)值。

      關(guān)鍵詞魚骨; 水酶法; 魚油; 不飽和脂肪酸; 氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用

      1引 言

      魚類加工中產(chǎn)生的大量魚骨副產(chǎn)物中富含蛋白質(zhì),目前主要的利用方式是將其加工成飼料,經(jīng)濟(jì)價(jià)值低。虹鱒魚中含有豐富的蛋白質(zhì)、維生素和礦物質(zhì),長期食用能有效防止心血管類疾病,具有降血壓、降血糖、降血脂的功效,被譽(yù)為“水中人參”\[1\]。魚油是魚骨中富含的主要功能性成分之一,其主要成分為Omega3脂肪酸,具有抗炎\[2\]、降血脂、預(yù)防心血管疾?。躘3,4\]等作用,是一種具有良好功能的食品原料。

      目前,生產(chǎn)魚油的主要方法有蒸煮法\[5\]、淡堿液清洗法\[6,7\]、溶劑提取法\[8\]、水酶法\[9,10\]和超臨界流體萃取法\[11,12\]。蒸煮法不能將與蛋白質(zhì)相結(jié)合的脂肪分離,提取率較低,而且蒸煮溫度一般為90℃,會(huì)對(duì)魚油品質(zhì)造成不良影響。淡堿液清洗法和溶劑提取法中溶劑不易回收,并可能造成環(huán)境污染。超臨界流體萃取\[13\]主要是用于萃取含游離脂肪酸較高的成分,難以實(shí)現(xiàn)規(guī)?;肮I(yè)化生產(chǎn)\[14\]。相比之下,水酶法提取效率較高,能有效回收原料中蛋白質(zhì)\[15\],且不污染環(huán)境,表現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。

      不同來源的魚油其脂肪酸組成存在很大差異。目前針對(duì)深海魚類來源的魚油脂肪酸組成分析的研究較多,但針對(duì)淡水魚尤其是虹鱒魚的魚油的脂肪酸組成的研究卻未見報(bào)道。本研究以虹鱒魚骨為原料,采用水酶法制備魚油,并采用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(GCMS) 技術(shù)對(duì)虹鱒魚油的脂肪酸組成及其風(fēng)味進(jìn)行了分析,為魚油的檢測(cè)分析及其開發(fā)利用提供了參考。

      2實(shí)驗(yàn)部分

      2.1儀器與試劑

      Atomx/7890B/5977A吹掃捕集氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀 (安捷倫科技 (中國) 有限公司);CF16RXⅡ高速離心機(jī) (日本Hitachi公司); PB10 pH計(jì) (賽多利斯科技儀器 (北京) 有限公司);TTLDC多功能氮吹儀 (北京同泰聯(lián)科技術(shù)發(fā)展有限公司);紫外分光光度計(jì) (上海光譜儀器有限公司),NMI20030H1核磁共振儀(上海紐邁電子科技有限公司);微波傳感器 (上海福美斯電子科技有限公司)。

      堿性蛋白酶 (173168 U/g)、風(fēng)味蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶(北京寶希迪有限公司);甲醇 (Methanol,色譜級(jí))、正己烷 (Hexane, 色譜級(jí))、Na2CO3、NaOH、CuSO4、酒石酸鉀鈉、鎢酸鈉、鉬酸鈉、Li2SO4等試劑(大連博諾有限公司)。Agilent 19091S433UI HP5ms Ultra Inert色譜柱(30 m×250 μm×0.25 μm)。虹鱒魚骨由山東悅一生物科技有限公司提供。

      2.2蛋白質(zhì)等組分含量測(cè)定

      蛋白質(zhì)測(cè)定采用Folin酚試劑法\[16\],脂肪含量測(cè)定采用NMR法\[17\],水分測(cè)定采用微波傳感器法\[18\],灰分測(cè)定采用灰化法\[19\]。

      2.3魚骨樣品處理方法

      魚骨切碎成0.3 cm×0.5 cm的小塊,按料液比1∶2 (w/w),加水?dāng)嚢杈鶆?,高壓蒸?(121℃, 30 min)。然后進(jìn)行勻漿 (5000 r/min, 5 min),將勻漿液調(diào)節(jié)到適宜溫度 (參照表1),用1 mol/L NaOH調(diào)至pH值,加酶 (500 U/g) 水解 3 h,100℃滅活酶10 min,10000 r/min離心20 min,取上層魚油,待測(cè)。

      魚油提取率的計(jì)算公式為:

      其中,魚骨中所含魚油質(zhì)量即為粗脂肪含量,采用NMR法進(jìn)行快速測(cè)定。

      2.4蛋白酶的篩選

      本研究選擇5種蛋白酶水解虹鱒魚骨,以魚油提取率為指標(biāo)確定最適合的酶,所選取的各蛋白酶水解條件如表1所示。

      2.5脂肪酸組成分析

      2.5.1樣品甲酯化取0.02 g 酶解后的魚油于樣品瓶中,加入2 mL 0.5 mol/L KOHCH3OH,密封,60℃水浴孵育2 h。冷卻至室溫,用6 mol/L HCl調(diào)至pH 3~4;加入2 mL 正己烷萃取,重復(fù)3次,35℃下氮吹至恒重。加入0.5 mL色譜級(jí)正己烷,混勻,加入2 mL 1% H2SO4CH3OH,70℃水浴1 h,冷卻至室溫,用去離子水調(diào)至中性,靜置分層后,移取正己烷層,加入無水Na2SO4,過夜,備用。

      2.5.2氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析GC條件:Agilent 19091S-433UI HP5ms Ultra Inert毛細(xì)管柱 (30 m×250 μm×0.25 μm);載氣:高純氦氣;分流比:50∶1;流速:1.0 mL/min;進(jìn)樣口溫度:250℃;升溫程序:柱箱初始溫度50℃,保持1 min,以50℃/min 的速度升溫至170℃,再以4℃/min升溫至300℃,保持15 min;進(jìn)樣量1

      SymbolmA@ L。

      MS條件:EI離子源,電離能量70 eV,離子源溫度230℃。通過檢索NIST譜庫,對(duì)脂肪酸進(jìn)行定性分析,通過面積歸一化法確定其相對(duì)百分含量。

      3結(jié)果與討論

      3.1虹鱒魚骨中主要成分含量

      虹鱒魚骨是一種高蛋白、高脂肪的原料,測(cè)得虹鱒魚骨中蛋白質(zhì)含量為15.9% (w/w),脂肪含量為17.7% (w/w)。

      3.2魚骨水解條件的優(yōu)化

      3.2.1水解蛋白酶的選擇5種蛋白酶酶解提取魚油的結(jié)果如圖1所示,其中堿性蛋白酶酶解虹鱒魚骨的油脂提取率明顯高于其它酶,因此選擇用堿性蛋白酶進(jìn)行酶解,并對(duì)虹鱒魚油的提取條件進(jìn)行優(yōu)化。

      3.2.2酶解溫度對(duì)魚油提取率的影響如圖2所示,溫度升高,魚油提取率逐漸增加,在55℃時(shí)達(dá)到最大。這是因?yàn)闇囟壬?,酶的活力增?qiáng),酶解速率加快,當(dāng)溫度達(dá)到一定值后,隨著溫度的升高,酶逐漸失活,提取率下降;同時(shí),溫度過高會(huì)導(dǎo)致油脂品質(zhì)下降。因此,選取55℃為酶解的最佳溫度。

      3.2.3酶解時(shí)間對(duì)魚油提取率的影響如圖3所示,酶解時(shí)間少于3 h時(shí),油脂提取率隨時(shí)間延長而增大;當(dāng)酶解時(shí)間達(dá)到3 h后,油脂提取率增長速度變慢;同時(shí),酶解時(shí)間延長,油脂中的不飽和脂肪酸容易氧化變質(zhì)\[19\],因此,選擇3 h為虹鱒魚骨酶解的最佳時(shí)間。

      3.2.4pH值對(duì)魚油提取率的影響在最適pH時(shí),酶表現(xiàn)出最大活性,pH值過低或過高,都會(huì)使酶活性降低,甚至失活。如圖4所示,隨著水解體系pH值增加,魚油提取率先增加后降低,在pH 7.5時(shí),虹鱒魚骨的油脂提取率到達(dá)最大值。因此本研究選擇pH 7.5為魚骨酶解的初始pH值。

      3.2.5加酶量對(duì)魚油提取率的影響如圖5所示,隨著蛋白酶加入量增加,魚油提取率逐漸增大,酶加入量為2000 U/g時(shí),提取率最大;當(dāng)酶過量時(shí),酶自身的水解增強(qiáng),魚油提取率反而降低\[20\]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,2000 U/g為酶的最適加入量。由于酶加入量為500 U/g與2000 U/g時(shí)魚油提取率的差別不大,考慮到成本,選取500 U/g進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

      3.2.6料液比對(duì)魚油提取率的影響如圖6所示,當(dāng)料液比為1∶1時(shí),油脂提取率最大,之后隨著水加入量增加,提取率逐漸降低,這可能是由于水加入量增加,底物濃度降低,酶的濃度也減小,導(dǎo)致提取率降低。

      綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果,虹鱒魚骨油的最佳提取條件為:在55℃、pH 7.5、酶解時(shí)間為3 h、料液比為1∶1、加酶量為500 U/g。在此條件下,利用堿性蛋白酶提取的虹鱒魚骨中的油脂含量最高,提取得到的粗魚油呈橘紅色,油體清澈、透明,魚油香味純正。

      3.3虹鱒魚骨脂肪酸組成分析

      將提取的虹鱒魚油進(jìn)行氣相色譜質(zhì)譜分析,所得譜圖見圖7,脂肪酸組成見表2。從表2可知,本研究測(cè)得的虹鱒魚骨油中的脂肪酸共25種,主要在C12~C22之間。其中飽和脂肪酸7種,含量為總脂肪酸的20% (w/w);其余為不飽和脂肪酸, 占脂肪酸總量的80% (w/w),單不飽和脂肪酸占不飽和脂肪酸的76.9%,多不飽和脂肪酸占23.1%,高于羅非魚內(nèi)臟的63.31% (單不飽和脂肪酸和多不飽和脂肪酸分別占脂肪酸總量的3813%和25.18% (w/w))。在不飽和脂肪酸中,含量最高的為油酸,其次為亞油酸。脂肪酸是風(fēng)味化合物的重要前體,是揮發(fā)性化合物的主要來源。Caprino等\[21\]研究了

      白鱘魚的脂肪酸組成及其風(fēng)味化合物,脂肪酸主要是棕櫚酸和油酸,其次是DHA和EPA;主要風(fēng)味化合物是醛類,占揮發(fā)性化合物的60%,對(duì)其風(fēng)味起主要作用的己醛和壬醛是由亞油酸氧化形成的;庚醛和辛醛來源于油酸和亞油酸的氧化。龍斌等\[22\]以川鯰為原料,對(duì)其腹部和背部的脂肪酸及揮發(fā)性化合物進(jìn)行測(cè)定。羥基化合物和羰基化合物是最重要的風(fēng)味化合物,尤其是醛類,其中己醛、庚醛、辛醛、壬醛、2,5辛二酮、1辛烯3醇對(duì)川鯰的風(fēng)味影響最為顯著;大多數(shù)醛是不飽和脂肪酸氧化形成,其進(jìn)一步氧化反應(yīng)生成短鏈醛。該研究進(jìn)一步驗(yàn)證了脂肪酸對(duì)揮發(fā)性風(fēng)味化合物的形成至關(guān)重要。脂肪酸降解后能生成醛類、醇類、烷烴、烯烴等揮發(fā)性風(fēng)味化合物。因此,本研究以提取的虹鱒魚骨油為原料,采用SPMEGCMS對(duì)其揮發(fā)性化合物進(jìn)行了測(cè)定。虹鱒魚油中共檢測(cè)出醇類占14.78%、烷烴34.23%、醛類28.05%、酮類1.96%、苯0.46%、吡嗪10.76%、酸0.63%、酯1.38%、烯烴6.36%、萘0.27%、炔烴1.49%等,其中,醛類、吡嗪是魚油嗅感的主要物質(zhì)。辛烯醛是導(dǎo)致魚油產(chǎn)生腥味的最主要物質(zhì),它是一種重要的有機(jī)中間體,是生產(chǎn)丁辛醇、香料的重要中間體\[23\]。 醛類的氣味閾值較低,是魚油中的多不飽和脂肪酸在酶和微生物的作用下發(fā)生氧化降解而生成的\[24\]。在虹鱒魚油揮發(fā)性化合物中,另一個(gè)含量較高的物質(zhì)是N(2丙炔基) 吡咯烷,是由脂肪酸氧自由基均裂產(chǎn)生的,但由于其閾值較高,其對(duì)魚油風(fēng)味的形成直接貢獻(xiàn)不大。在虹鱒魚骨中檢測(cè)出吡嗪類物質(zhì),包括2乙基5甲基吡嗪 (草味,堅(jiān)果味) 和2,5二甲基吡嗪 (烘烤堅(jiān)果味)\[25\],其中2乙基5甲基吡嗪含量較高,占1.86% (w/w),在虹鱒魚油的風(fēng)味形成中起重要作用。

      4結(jié) 論

      本研究以虹鱒魚骨為原料,采用水酶法提取魚油,對(duì)提取條件進(jìn)行了優(yōu)化。GCMS的分析結(jié)果表明,水酶法所提取的魚油中不飽和脂肪酸占絕大部分(80.4%),其中單不飽和脂肪酸占不飽和脂肪酸的76.9%,多不飽和脂肪酸占不飽和脂肪酸的23.1%, DHA和EPA占總脂肪酸的3.4%。本研究對(duì)魚油產(chǎn)品的分析與鑒別具有參考價(jià)值。

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