陳進斌　苗英霞　任華峰

摘要：從天津某海水養(yǎng)殖場底泥中分離篩選好氧反硝化菌，獲得3株具有高效反硝化特性的微生物，分別為MCW148、MCW151和MCW154。采用正交試驗對功能菌進行優(yōu)化組合，研制好氧反硝化復(fù)合菌劑。結(jié)果表明，MCW148、MCW151、MCW154的最優(yōu)配比為3∶2∶1，其在12 h內(nèi)對海水養(yǎng)殖廢水中無機氮的去除率為60.39%。

關(guān)鍵詞：好氧反硝化；菌劑；海水養(yǎng)殖廢水

中圖分類號：X172；X703 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）11-2049-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.11.012

Abstract： Three aerobic denitrifying bacterium were isolated from sediment of one marine aquaculture farm in Tianjin，which were named as MCW148，MCW151 and MCW154. This three aerobic denitrifying bacterium were made into aerobic denitrification microbial agent，the combination ratio was optimized by orthogonal array design. The results showed that the optimal ratio of MCW148，MCW151 and MCW154 was 3∶2∶1，and the reduction rate of inorganic nitrogen for marine aquaculture wastewater in 12 h was 60.39%.

Key words： aerobic denitrification； microbial agent； marine aquaculture wastewater

隨著中國海水養(yǎng)殖業(yè)的高速發(fā)展，海水養(yǎng)殖帶來的環(huán)境污染也日趨嚴(yán)重，不但導(dǎo)致部分海域富營養(yǎng)化嚴(yán)重，而且逐漸影響到中國近海海水養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，成為亟待解決的水環(huán)境污染問題[1-3]。中國于2007年針對海水養(yǎng)殖水的排放進行了規(guī)范，并發(fā)布了國家標(biāo)準(zhǔn)SC/T 9103-2007《海水養(yǎng)殖水排放要求》[4]。因此，尋求一種安全高效、成本低廉的海水養(yǎng)殖廢水處理技術(shù)成為研究熱點。

傳統(tǒng)生物脫氮理論認(rèn)為反硝化作用只能在厭氧條件下完成[5]，1980年Meiberg等[6]發(fā)現(xiàn)反硝化作用在好氧條件下也能實現(xiàn)，隨后Robertson等[7]分離出好氧反硝化菌Thiosphaera pantotropha。此后，越來越多的好氧反硝化菌被分離并報道[8-10]。好氧反硝化菌可以實現(xiàn)同步硝化和反硝化，打破了人們對于傳統(tǒng)脫氮理論的認(rèn)識，使氨化、硝化和反硝化反應(yīng)在海水養(yǎng)殖廢水的好氧環(huán)境中同時發(fā)生，能夠顯著降低海水養(yǎng)殖廢水脫氮的成本，對于在海水養(yǎng)殖廢水處理中構(gòu)建同步脫氮體系具有重要意義[11-13]。

本研究從海水養(yǎng)殖場底泥中篩選出3株具有高效反硝化作用的菌株，將3株菌進行組合，研制高效好氧反硝化復(fù)合菌劑，并將復(fù)合菌劑用于處理海水養(yǎng)殖廢水，以期為好氧反硝化復(fù)合菌劑在海水養(yǎng)殖廢水處理中的應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌株 在天津塘沽某海水養(yǎng)殖場采集海底泥樣品，實驗室分離篩選到3株好氧反硝化菌。

1.1.2 水樣 試驗所用水樣為實驗室錦鯉養(yǎng)殖廢水添加海水晶。

1.1.3 培養(yǎng)基 反硝化培養(yǎng)基（DM）：Na2HPO4 7.9 g；KH2PO4 4.5 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，微量元素2 mL，KNO3 1.0 g，丁二酸鈉9.4 g，海水1 000 mL，pH 7.0～7.5；固體培養(yǎng)基添加20 g瓊脂[14]。

BTB培養(yǎng)基：Na2HPO4 7.9 g，KH2PO4 4.5 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，微量元素2 mL，KNO3 1.0 g，丁二酸鈉9.4 g，BTB（取0.1 g溴百里香酚藍溶于10 mL乙醇）1 mL，海水1 000 mL；pH 7.0；固體培養(yǎng)基添加20 g瓊脂[14]。

微量元素：EDTA 50.0 g，ZnSO4 2.2 g，CaCl2 5.5 g，MnCl2·4H2O 5.06 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 5.0 g，（NH4）6Mo7O2·4H2O 1.1 g，CuSO4·5H2O 1.57 g，CoCl2·6H2O 1.61 g，海水 1 000 mL[14]。

DM培養(yǎng)基用于好氧反硝化菌的富集培養(yǎng)及好氧反硝化性能測試，BTB培養(yǎng)基用于好氧反硝化菌的篩選。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株的分離 稱取適量海底泥，加入到DM培養(yǎng)基中，在30 ℃、160 r/min下富集培養(yǎng)24 h。將富集后的菌液采用稀釋涂布法分離，劃線純化，最后挑取單菌落至斜面保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 菌株的好氧反硝化性能測試 將篩選出的菌株液體培養(yǎng)至對數(shù)期后，按照1%的接種量將菌液接種至DM培養(yǎng)基中，置于30 ℃、160 r/min下培養(yǎng)12 h，然后測定培養(yǎng)基中NO3--N的濃度。

1.2.3 菌株的鑒定 試劑盒提取菌株的基因組DNA，進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)，PCR產(chǎn)物送往上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司進行測序[15，16]。

1.2.4 菌劑中功能菌組合比例優(yōu)化 選擇MCW148、MCW151、MCW154三株菌進行菌劑復(fù)配，通過正交試驗確定菌劑中各株菌的添加比例，采用L9（33）正交表，以MCW148、MCW151、MCW154作為A、B、C 3個考察因素，選取3個添加量水平（配比）配制菌劑（表1）。將優(yōu)化后的混合菌劑按照1%的量添加到海水養(yǎng)殖廢水中進行反硝化試驗，12 h后測定海水養(yǎng)殖廢水中的NH4+-N、NO3--N和NO2--N含量，以12 h時菌劑對海水養(yǎng)殖廢水中無機氮的去除率為指標(biāo)考察菌劑的反硝化效果，同時以不加菌劑組作為對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的好氧反硝化性能測試

從海水養(yǎng)殖場底泥中共分離篩選到3株具有高效反硝化特性的微生物，3株菌在12 h內(nèi)的好氧反硝化性能測試結(jié)果顯示，培養(yǎng)基中NO3--N的去除率均能達到99.9%以上。

2.2 好氧反硝化菌的鑒定

經(jīng)16S rDNA序列分析，MCW148、MCW151、MCW154分別為巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）、弧菌（Vibrio sp.）和弧菌（Vibrio sp.）。

2.3 菌劑配比優(yōu)化

按照表1的正交因素水平設(shè)計正交試驗，結(jié)果如表2所示。由表2可以看出，極差C>B>A，即3株菌對無機氮去除的影響由大到小依次為MCW154、MCW151、MCW148。在試驗設(shè)計范圍內(nèi)，優(yōu)化得到好氧反硝化菌劑的最佳配方為C1B2A3，與直接觀察法得到的結(jié)果相同。因此，MCW148、MCW151、MCW154的添加比例為3∶2∶1時菌劑對海水養(yǎng)殖廢水中無機氮的去除率最高，此時對海水養(yǎng)殖廢水中無機氮的去除率為60.39%。

2.4 NH4+-N的去除效果

菌劑在12 h時對NH4+-N的去除效果如圖1所示，菌劑對NH4+-N的去除率為43.91%。從圖1可以看出，試驗組NH4+-N含量明顯低于對照組，證明好氧反硝化復(fù)合菌劑也具有硝化作用，將海水養(yǎng)殖廢水中的NH4+-N轉(zhuǎn)化為NO3--N，從而降低了海水養(yǎng)殖廢水中的NH4+-N含量。

2.5 NO3--N的去除效果

菌劑在12 h時對NO3--N的去除效果如圖2所示，菌劑對NO3--N的去除率為60.45%。好氧反硝化復(fù)合菌劑對海水養(yǎng)殖廢水中NO3--N的去除效果較為顯著，去除量達到59.069 mg/L，與菌株對DM培養(yǎng)基中NO3--N的去除效果相比仍存在很大差距，這是由于海水養(yǎng)殖廢水中營養(yǎng)較為貧瘠，碳源較少，不適宜好氧反硝化菌的生長所致。

2.6 NO2--N的去除效果

菌劑在12 h時對NO2--N的去除效果如圖3所示，菌劑對NO2--N的去除率為67.44%。從圖3可以看出，好氧反硝化復(fù)合菌劑在處理海水養(yǎng)殖廢水的過程中基本沒有亞硝氮積累，說明3株菌在協(xié)同作用下，菌株內(nèi)的亞硝酸鹽還原酶活性較高，能夠迅速還原菌株反硝化過程中產(chǎn)生的NO2--N，從而使海水養(yǎng)殖廢水中的NO2--N含量維持在較低水平。

3 小結(jié)

本研究共篩選到3株具有高效反硝化作用的微生物，其中巨大芽孢桿菌1株、弧菌2株。通過正交試驗確定好氧反硝化菌劑中MCW148、MCW151、MCW154的最適比例為3∶2∶1，此時菌劑在12 h內(nèi)對海水養(yǎng)殖廢水中銨氮、硝氮、亞硝氮和無機氮的去除率分別為43.91%、60.45%、67.44%和60.39%。

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