周 宏，謝 瓊，劉長庭

（1.中國人民解放軍總醫(yī)院南樓呼吸科，北京100853；2.泰山醫(yī)學(xué)院，泰安271000；3.中國航天員訓(xùn)練中心醫(yī)監(jiān)醫(yī)保研究室，北京100094）

·基礎(chǔ)研究·

神舟十號飛船下行菌株Microbacterium sp．LCT?H2的基因組測序及分析

周 宏1，2，謝 瓊3，劉長庭1?

（1.中國人民解放軍總醫(yī)院南樓呼吸科，北京100853；2.泰山醫(yī)學(xué)院，泰安271000；3.中國航天員訓(xùn)練中心醫(yī)監(jiān)醫(yī)保研究室，北京100094）

神舟十號飛船返回艙內(nèi)表面分離得到一株下行菌株LCT?H2，顯微觀察和革蘭氏染色結(jié)果為短桿狀的革蘭氏陽性菌，利用葡萄糖、纖維二糖等多種碳源，對該菌進(jìn)行16S rRNA測序，鑒定其為微桿菌屬成員，并命名為Microbacterium sp．LCT?H2。對該下行菌進(jìn)行了全基因組測序和基因功能注釋分析，其基因組大小為3.36 M，包括3235個編碼序列和53個RNA基因，COG數(shù)據(jù)庫比對共注釋到21組COG功能分類。可對研究密閉飛行器內(nèi)微生物種類分布等提供一定幫助。

微桿菌；太空飛行；全基因組測序；功能分類

1 引言

隨著航天技術(shù)的發(fā)展，人類的外太空探索活動越來越頻繁。盡管載人飛船及內(nèi)部物品等經(jīng)過嚴(yán)格的真空消毒，載人航天器密閉環(huán)境條件仍然容易滋生細(xì)菌和真菌等微生物，這些微生物能在密閉艙室內(nèi)的金屬、高分子復(fù)合材料等表面形成生物膜［1］，它們的生長繁殖和代謝會對材料產(chǎn)生腐蝕，嚴(yán)重威脅空間站的長期在軌運(yùn)行安全，縮短空間站的服役時間［2］。研究密閉航天器內(nèi)的微生物種類對于航天器內(nèi)微生物的安全防護(hù)具有重要的意義。

早期人們對許多環(huán)境微生物的認(rèn)識僅來自于對16S rRNA的研究［3］，一些重要的遺傳信息很難獲得。現(xiàn)在越來越多的新型培養(yǎng)方法和分子生物學(xué)方法，如基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、宏基因組學(xué)等，被用來研究新獲得微生物的潛在特征和功能等［4］。

本研究圍繞一株分離自神舟十號載人飛船返回艙內(nèi)冷凝水的細(xì)菌Microbacterium sp．LCT?H2展開。通過16S rRNA測序鑒定該菌菌屬，完成菌株基因組的高通量測序、基因注釋分析和功能分類，研究該菌的表型及生理生化特征。

2 材料和方法

2.1 菌株與培養(yǎng)

菌株Microbacterium sp．LCT?H2為中國航天員訓(xùn)練中心自神舟飛船的返回艙內(nèi)冷凝水分離得到。菌株分別于37℃培養(yǎng)箱或搖床中進(jìn)行靜置或振蕩培養(yǎng)，液體培養(yǎng)基為腦心浸出液培養(yǎng)基（BHI，Oxiod），配方為37 g／L BHI；固體培養(yǎng)基為MH平板。

2.2 基因組DNA的提取

Microbacterium sp．LCT?H2接種至BHI液體培養(yǎng)基，37℃，180 rpm過夜培養(yǎng)，6000 rpm離心5 min收集菌體，棄上清。利用Qiagen公司的基因組DNA提取試劑盒（Code No.51304，詳細(xì)步驟見產(chǎn)品說明書）提取收集的菌體的基因組DNA。

2.3 菌種鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

以Microbacterium sp．LCT?H2的基因組DNA為模板，利用細(xì)菌16SrRNA通用測序引物27F（5’?AGAGTTTGATCCTGGCTCAG?3’）和1492R（5’?TACGGCTACCTTGTTACGACTT?3’）擴(kuò)增其16S rRNA片段并測序，得到其堿基序列。用CLUSTALW［5］進(jìn)行多序列比對，并用MEGA 5.0構(gòu)建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹［6］。

參照Chen等[21]的方法，采用透析測定樣品的釋放情況。取10 mL樣品于透析袋(分子截留量8 000～14 000 Da)中，密封好后浸沒于200 mL的pH 7.0的PBST緩沖溶液中(吐溫-20，0.5% v/v)。游離的丁香酚可透過透析袋進(jìn)入到緩沖溶液中，而酪蛋白酸鈉穩(wěn)定微乳則被截留在透析袋中。在預(yù)定時間內(nèi)，取出適量透析液，用相同的緩沖溶液稀釋至適當(dāng)濃度，280 nm下測定其吸光度并計(jì)算丁香酚釋放的量，繪制釋放曲線。

2.4 菌株性態(tài)及生理特性

2.4.1 菌體形態(tài)觀察

采用革蘭氏染色試劑盒（Code No.G1060，Solarbio）對LCT?H2菌體進(jìn)行染色。BHI液體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)菌體，將菌液滴于載玻片中央，在酒精燈上略加溫，使之迅速干燥。結(jié)晶紫、沙黃染色液對干燥菌體一次染色脫色，詳細(xì)步驟見產(chǎn)品說明書。染色完成并晾干后，置于光學(xué)顯微鏡下觀察染色情況。

分別在透射電子顯微鏡（TEM）和掃描電子顯微鏡（SEM）下觀察菌體形態(tài)。1 ml培養(yǎng)至穩(wěn)定前期的菌液，6000 rpm離心5 min收集菌體，棄上清；PBS緩沖液洗滌一次后將菌體懸浮至合適濃度。菌懸液等體積與4%多聚甲醛＋0.5%戊二醛溶液混合，滴在有支持膜的銅網(wǎng)上，15min后用濾紙吸取未吸附樣品；吸取磷鎢酸染液小心滴在銅網(wǎng)上，染色1 min后用濾紙吸取未吸附的樣品；樣品干燥后在Philips EM 400T型透射電子顯微鏡（TEM）下觀察菌體形態(tài)。首先用2.5%戊二醛、PBS緩沖液以及1%鋨酸清洗菌體，乙醇梯度脫水并乙酸異戊酯置換，樣品干燥后做噴金處理［7］，處理好的樣品置于FEIQuanta 200型掃描電鏡下觀察。

2.4.2 BIOLOG板分析

Biolog微孔板（Biolog GENIIIMicroPlate，Bi?olog）用來對LCT?H2菌株進(jìn)行94種表型檢測，其中包括71種碳源利用率分析和23種化學(xué)敏感性分析。Microbacterium sp．LCT?H2接種至BHI液體培養(yǎng)基，37℃，180 rpm過夜培養(yǎng)，6000 rpm離心5 min收集菌體，棄上清。將菌體用IF?B接種液懸浮并調(diào)節(jié)至適當(dāng)濃度（OD600約為0.8），分別取100μL接種液加入Biolog微孔板的96個孔中，將微孔板放置在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，用酶標(biāo)儀測定590 nm各孔的吸光度值（OD590）［8］。

2.5 基因組測序、組裝及注釋

基因組DNA樣品委托美吉生物有限公司進(jìn)行全基因組序列測定、基因預(yù)測、基因功能注釋、非編碼RNA預(yù)測等工作，序列分析工作委托美吉生物有限公司和上海瀚宇生物科技有限公司共同完成。

基因組DNA提取后進(jìn)行質(zhì)量鑒定，在濃度和純度達(dá)到測序要求后進(jìn)行全基因組測序。利用Covaris進(jìn)行基因組DNA片段化，構(gòu)建插入片段約300～500 bp的基因組測序文庫，通過橋式PCR擴(kuò)增得到DNA簇，然后采用Illumina Hiseq 2000測序技術(shù)完成該菌株的基因組掃描測序，獲得約1 Gb的原始測序數(shù)據(jù)。Illumina HiSeq2000測序得到的原始圖像數(shù)據(jù)經(jīng)過Base Calling轉(zhuǎn)化為序列數(shù)據(jù)，結(jié)果以FASTQ文件格式來存儲，包含測序read的序列信息以及測序質(zhì)量信息［9］；原始數(shù)據(jù)經(jīng)過預(yù)處理去除接頭、引物及低質(zhì)量數(shù)據(jù)后，利用SOAPdenovo［10］拼接軟件對優(yōu)化序列進(jìn)行多個Kmer參數(shù)的拼接，得到最優(yōu)的組裝結(jié)果，并運(yùn)用Gap Closer軟件對組裝結(jié)果進(jìn)行局部內(nèi)洞填充和堿基校正；分別利用RNAmmer和tRNAscan?SE軟件對基因組中包含的rRNA和tRNA進(jìn)行預(yù)測［11］；利用Glimmer 3.0軟件進(jìn)行基因預(yù)測［12?14］；利用各種數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因功能注釋和分類。

3 結(jié)果與分析

菌株LCT?H2可在MH固體平板上形成無色、表面光滑且邊緣整齊菌落。革蘭氏染色后在光鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)菌體被染成紫色，為革蘭氏陽性菌特征（圖1（a））。在透射電鏡及掃描電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，菌體呈桿狀，分散排布，表面沒有鞭毛、菌毛等結(jié)構(gòu)（圖1（b）、（c））。

3.2 Microbacterium sp．LCT?H2菌株鑒定

利用通用引物測序得到的16S rRNA基因序列，構(gòu)建多株細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2），顯示與Microbacterium屬多個菌株位于一個大的系統(tǒng)分支，且與Microbacterium paraoxydans進(jìn)化關(guān)系最近。Biolog微孔板結(jié)果表明LCT?H2菌株可利用多種碳源，包括單糖（葡萄糖、果糖、甘露糖等）、二糖（纖維二糖、龍膽二糖、蔗糖等），多糖（果膠、糊精等）以及多種無機(jī)碳源等，對醋竹桃霉素（Troleandomycin）、硫酸四癸鈉（Niaproof 4）、二甲胺四環(huán)素（Minocycline）等敏感（圖3）。綜合該菌在生理生化特征、16S rRNA基因同源性和化學(xué)指標(biāo)等方面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定菌株LCT?H2是微桿菌屬，命名為Microbacterium sp．LCT?H2。

3.3 基因組測序與分析

3.3.1 基因組序列基本信息

通過Illumin Hiseq2000平臺測序，基于測序數(shù)據(jù)組裝得到LCT?H2基因組大小為3 356 231 bp，GC含量為70.5%，共30個scaffold，46個contig?；蚪M組分分析發(fā)現(xiàn)，LCT?H2預(yù)測出3235個編碼基因，總長度為3 084 376 bp，占基因組全長的91.9%。tRNA 50個，rRNA 3個。LCT?H2菌株的基因組序列具體信息詳見表1。

3.3.2 基因組序列基本信息

用Glimmer 3.0軟件對LCT?H2基因組的ORF進(jìn)行預(yù)測，獲得3235個編碼基因，依據(jù)COG分類標(biāo)準(zhǔn)將1575個基因劃分為21類，以英文大寫字母表示每一類的代碼，每一類基因的數(shù)量和功能見表2：RNA形成及修飾（A），共1個基因；能量產(chǎn)生和轉(zhuǎn)化（C），共96個基因；細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞分裂、染色體分割（D），共15個基因；氨基酸運(yùn)輸代謝（E），共204個基因；核苷酸運(yùn)輸代謝（F），共57個基因；糖類運(yùn)輸代謝（G），共135個基因；輔酶運(yùn)輸代謝（H），共56個基因；脂質(zhì)運(yùn)輸代謝（I），共66個基因；翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物合成（J），共121個基因；轉(zhuǎn)錄（K），共108個基因；復(fù)制、重組、修復(fù)（L），共80個基因；細(xì)胞壁、細(xì)胞膜合成（M），共59個基因；細(xì)胞運(yùn)動（N），共11個基因；蛋白質(zhì)修飾和折疊（O），共48個基因；無機(jī)離子運(yùn)輸代謝（P），共134個基因；次生產(chǎn)物合成、轉(zhuǎn)運(yùn)和分解（Q），共39個基因；一般功能預(yù)測（R），175個基因；功能未知（S），77個基因；信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制（T），共48個基因；細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)，分泌和膜泡運(yùn)輸（U），共23個基因；防御機(jī)制（V），共22個基因；還有1660個未能找到對應(yīng)的COG分類。

表1 M icrobacterium sp．LCT?H2菌株基因組的核苷酸含量和基因計(jì)數(shù)水平Table 1 Nucleotide content and gene count levels of the genome

4 討論

空間環(huán)境具有地面環(huán)境不存在的一些特殊環(huán)境因素，如微重力、高真空、離子輻射、電磁輻射和極度溫差等，這些因素除了可以誘導(dǎo)空間環(huán)境微生物發(fā)生基因水平的改變，進(jìn)而影響微生物的生物學(xué)性狀和功能外，還會影響航天器材料、艙室環(huán)境等。

微桿菌屬是一類廣泛存在于土壤、昆蟲、海洋、病患、植物等多種環(huán)境中的微生物［15］，曾有報(bào)道微桿菌屬菌種可以引起人類、動物和植物疾病［16?18］。在神舟十號船返回艙內(nèi)分離得的微桿菌屬M(fèi)icrobacterium sp．LCT?H2，參與氨基酸運(yùn)輸代謝，糖類運(yùn)輸代謝，翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物合成等相關(guān)功能。

表2 LCT?H2基因組21個COG分類的基因數(shù)統(tǒng)計(jì)Table 2 Number of genes associated w ith the 21 general COG functional categories

5 結(jié)論

1）LCT?H2菌株經(jīng)本研究鑒定為微桿菌屬，并命名為Microbacterium sp．LCT?H2，為短桿狀的革蘭氏陽性菌。

2）Microbacterium sp．LCT?H2基因組大小為3.36 M，包括3235個編碼序列和53個RNA基因，COG數(shù)據(jù)庫比對共注釋到21組COG功能分類。

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Draft Genome Sequencing and Analysis of Strain M icrobacterium sp．LCT?H2 Isolated from ShenzhouⅩReturn Capsule

ZHOU Hong1，2，XIE Qiong3，LIU Changting1?
（1.Nanlou Respiratory Disease Department，The 301 Hospital，Beijing 100853，China；2.Taishan Medical College，Taian 271000，China；3.Department of Medical Monitoring and Medical Support，China Astronaut Research and Training Center，Beijing 100094，China）

Microbacterium sp．LCT?H2 strain was a short?rod，Gram?negative strain isolated from in?side of the ShenzhouⅩreturn capsule，which could utilizemany carbon sources including glucose and cellobiose.LCT?H2 was identified as amember of the Microbacterium according to the sequence of 16S rRNA and the draftgenome sequence.The total size of the genomewas3，356，231bp with 3，235 protein?coding and 50 RNA genes.21 COG functional categorieswere annotated based on COG database.The resultsmay be helpful to the study ofmicrobial species distribution inside the space?craft.

Microbacterium；space flight；whole?genome sequencing；functional category

R856

A

1674?5825（2017）01?0109?05

2015?12?02；

2016?12?21

國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃（973）（2014CB744400）；載人航天預(yù)先研究項(xiàng)目（040203）；全軍醫(yī)學(xué)科研“十二五”課題重點(diǎn)項(xiàng)目（BWS12J046）

周宏，女，博士，講師，在站博士后，研究方向?yàn)槲⑸锷c分子生物學(xué)。E?mail：hongzhoujy＠hotmail.com

?通訊作者：劉長庭，男，碩士，教授，研究方向?yàn)榭臻g生命科學(xué)。E?mail：changtingliu＠sohu.com