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外周靜脈輸注臍帶間充質(zhì)干細胞致血栓形成臨床研究

陳豐穗1吳志賢1蔡錦全2高霞2譚建明2

目的探討在干細胞的臨床應用中，細胞輸注后因血液介導的炎癥反應，誘發(fā)血栓形成的現(xiàn)象及其治療和預防策略。方法兩例分別為腎移植術(shù)后和慢性腎臟疾病的患者，在輸注臍帶間充質(zhì)干細胞后出現(xiàn)了血栓形成，采集臨床表現(xiàn)和實驗室檢查資料并進行分析。結(jié)果通過外周靜脈輸注干細胞后，患者出現(xiàn)了前臂的疼痛和腫脹。彩超顯示距穿刺部位較遠距離靜脈血栓形成，使用尿激酶和華法林進行溶栓治療后，腫脹和疼痛得到緩解。結(jié)論血栓形成是干細胞臨床治療的一個重要安全性問題，應予以重視并采取充分的預防措施。

間質(zhì)干細胞； 血栓形成； 腎移植； 腎病； 慢性病

人類干細胞具有分化成多種組織細胞、修復受損組織、調(diào)節(jié)免疫力等功能，這些功能在臨床中有良好的應用前景。目前干細胞在移植物抗宿主病、糖尿病、腎移植等疾病有較多的臨床研究取得令人鼓舞的臨床效果[1-5]。但是，安全性的問題仍然是干細胞臨床應用的主要挑戰(zhàn)和障礙之一。目前已經(jīng)有報道一些致命性的并發(fā)癥如肺栓塞等[4]。另外有報道證明，干細胞接觸血液后，會促進血栓的形成。其機制是由于血液介導的炎癥反應（instant blood-mediated in fl ammatory reaction，IBMIR）[5]，肝素等抗凝劑能有效防止血栓形成，增強了干細胞輸注的安全性。然而，仍然需要加強預防干細胞的臨床安全問題。本文中報道了兩例患者輸注干細胞后形成靜脈血栓，通過抗凝治療后好轉(zhuǎn)，并回顧了輸注干細胞后血栓形成機制的文獻。

資料與方法

一、一般資料

患者一，男性，50歲。3年前診斷為慢性腎功能不全，漸進性發(fā)展為終末期腎病。于2011年11月30日行腎移植術(shù)。患者術(shù)后定期接受干細胞輸注治療，目的在于調(diào)節(jié)免疫和優(yōu)化免疫抑制劑方案[3]。2011年12月12日該患者行第1次“外周血干細胞移植術(shù)”，術(shù)前給予低分子量肝素（2 500 IU，皮下注射），甲強龍琥珀酸鈉（40 mg 靜脈滴入）和鹽酸異丙嗪（25 mg肌肉注射）。然后輸注臍帶間充質(zhì)干細胞，細胞數(shù)量為 6.0×107個（1.0×106/kg）。2012年12月 14日進行第2次輸注干細胞。2012年12月28日第3次輸注干細胞之前，體檢發(fā)現(xiàn)右結(jié)膜下出血，因此臨床醫(yī)師向干細胞實驗室建議干細胞保存液不添加普通肝素。在輸注之前，凝血試驗和肢體血管超聲未見明顯異常。

患者二，男性，28歲。2013年10月11日入組，診斷為慢性腎功能不全，肌酐水平為281.6 μmol/L。為了改善慢性腎臟炎癥，患者輸注了細胞數(shù)量為 5.5×107（1.0×106/kg）的臍帶間充質(zhì)干細胞，輸注時在干細胞保存液中加入了肝素。兩例患者輸注之前均無長期使用抗凝或促凝藥物治療的病史。

二、臍帶間充質(zhì)干細胞的制備

根據(jù)已發(fā)表文獻[3]的方法進行細胞制備，冷凍臍帶間充質(zhì)干細胞為第2代傳代細胞。輸注前10 ～ 14 d，將細胞解凍并擴增至第4代或第5代。在輸注當天，將臍帶間充質(zhì)干細胞混懸于含有10 U/ml肝素鈉的生理鹽水中用于輸注，在輸注前取保存液樣品行細菌、支原體、真菌培養(yǎng)和內(nèi)毒素檢測。

對于腎移植的受者，需要在輸注后觀察免疫抑制劑劑量和檢查腎功能。對于慢性腎臟疾病患者，需要觀察腎功能和尿常規(guī)。重點觀察是否出現(xiàn)發(fā)熱、外周靜脈血栓形成、肺栓塞和全血細胞計數(shù)和凝血功能。

結(jié) 果

干細胞輸注后的第3天，患者一出現(xiàn)了前臂腫脹和疼痛。彩超檢查顯示在右肱靜脈的遠心端處有一個52.6 mm×5.0 mm的低回聲無流動區(qū)域（圖1a）。距穿刺部位距離大于40 cm，考慮與穿刺無關，與干細胞輸注后血栓形成有關。輸注前凝血試驗顯示凝血酶原時間為11.5 s，活化部分凝血活酶時間24.4 s，凝血酶時間17 s，纖維蛋白原3.12 g/L，D-二聚體陰性。輸注后發(fā)生腫脹，查凝血試驗除了D-二聚體升高（7.89 mg/L）外，與血栓形成前無明顯差異。診斷干細胞輸注誘導靜脈血栓形成。給予尿激酶（2×105U，每天2次，靜脈輸注）、華法林（2.5 g，每天1次，口服）進行溶栓治療后，腫脹和疼痛逐漸緩解。治療過程中未出現(xiàn)顱內(nèi)或胃腸道出血、皮下瘀斑。10 d后彩超提示血栓減小為28.5×3.6 mm，證明上述治療有效，溶栓治療維持了10 d后該患者右前臂腫脹完全消退。后期隨訪未發(fā)現(xiàn)右臂再次出現(xiàn)腫脹疼痛等異常。

患者二在輸注細胞2 d后同樣出現(xiàn)右前臂腫脹和疼痛。彩超檢查發(fā)現(xiàn)在右肱靜脈下1/3段有一個大小約為37.5 mm×4.0 mm低回聲無流動區(qū)域（圖1b），與穿刺點距離40 cm以上。凝血試驗顯示凝血酶原時間為12.3 s，活化部分凝血活酶時間26.8 s，國際標準化率1.05，凝血酶時間為16.2 s，纖維蛋白原3.05 g/L，D-二聚體活性下降，腫脹發(fā)生后凝血試驗唯一的改變是D-二聚體水平升高（12.4 mg/L）。該患者最終診斷為靜脈血栓形成，用尿激酶聯(lián)合抗凝治療7 d后血栓溶解。

圖1 彩超下觀察二例患者右肱靜脈

討 論

混合淋巴細胞反應顯示人間充質(zhì)干細胞可以抑制淋巴細胞的同種異體反應活性，其機制與人類白細胞抗原無關[8-10]。靜脈輸注間充質(zhì)干細胞可以促進腎、神經(jīng)和肺損傷的修復，其機制主要是干細胞發(fā)揮旁分泌作用，產(chǎn)生抗炎細胞因子[11-12]。一項大樣本的臨床試驗發(fā)現(xiàn)，腎移植應用自體間充質(zhì)干細胞可以明顯減少急性排斥反應，獲得更好的腎功能，明顯減少腎移植術(shù)后不良事件[3]。

研究發(fā)現(xiàn)細胞靜脈輸注可誘導IBMIR，IBMIR被廣泛證實能夠破壞移植的胰島細胞[13]，從而迫使臨床1型糖尿病患者增加移植的胰島細胞數(shù)量[14]。機制研究表明補體途徑和凝血途徑的激活在IBMIR中扮演了重要的角色，這兩種途徑引起血凝塊的形成從而導致移植細胞受損。最近發(fā)現(xiàn)IBMIR現(xiàn)象同樣發(fā)生于肝細胞移植和間充質(zhì)干細胞治療中[15]。另有研究表明，間充質(zhì)干細胞暴露于ABO血型相容的人類血液后，觸發(fā)了補體活化[16]。因此，以上研究提示了非直接接觸血液的細胞在進入血液循環(huán)后可以誘導IBMIR。

組織因子是引起凝血途徑的啟動因子，間充質(zhì)干細胞細胞表面可廣泛表達組織因子[17]。實驗研究證實抗組織因子抗體和Ⅴ、Ⅷ因子血漿可抑制間充質(zhì)干細胞的促凝血反應。未培養(yǎng)的干細胞無促凝血反應功能，說明細胞培養(yǎng)是間充質(zhì)干細胞細胞表面表達組織因子的重要誘因。因此，在間充質(zhì)干細胞的臨床應用中，使用抗凝血藥抑制組織因子活性可能使患者獲益。

患者一輸注的干細胞保存液中未加入肝素，很可能因此導致了血栓的形成。但患者二使用了常規(guī)劑量的肝素，也發(fā)生了靜脈血栓。肝素是最常用于間充質(zhì)干細胞保存液的有效抗凝方法之一，而研究表明它的抗凝效果不如凝血酶拮抗劑[18]。Tatsumi等[17]提出凝血因子表達需要的肝素依賴（非依賴）這兩條途徑都可以被凝血酶拮抗劑抑制，因此目前臨床上迫切需要更加有效的拮抗劑。

慢性腎臟疾病患者血液容易形成血栓，但是目前很少有文獻報道慢性腎臟疾病患者輸注人干細胞后的不良事件。有研究報道將干細胞直接注射到狼瘡性腎炎患者的腎實質(zhì)后，發(fā)生了血管肉瘤增生性病變[20]。因此還需要進一步收集慢性腎臟疾病患者應用干細胞的安全性數(shù)據(jù)。

總之，注入臍帶間充質(zhì)干細胞的促凝血反應活性可導致臨床輸注后不良事件，應進一步研究更為安全有效的抗凝血預防用藥方案。

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Thromboembolism induced by umbilical cord mesenchymal stem cell infusion

Chen Fengsui1,Wu Zhixian1, Cai Jinquan2, Gao Xia2, Tan Jianming2.
1Department of Hepatobiliary Disease,2Department of Urology, Fuzhou General Hospital, Fuzhou 350025, China

Tan Jianming, Email:doctortjm@yahoo.com

ObjectiveTo investigate the thromboembolism induced by blood-mediated inflammatory reactions against infused cells during the clinical application of stem cells.MethodsTwo patients with renal transplantation and chronic kidney disease, respectively experienced thromboembolism after umbilical cord mesenchymal stem cell（UCMSC）infusion. The clinical manifestations and the laboratory test results were collected and analyzed.ResultsThe patients

stem cell infusion through the peripheral veins and presented with a swollen and painful forearm post-infusion. Doppler ultrasound showed venous clots at the proximal end of the puncture site. Urokinase and warfarin were used for thrombolytic therapy. The swelling and pain were relieved and cured.ConclusionThromboembolism in stem cell therapy should be prevented appropriately

Mesenchymal stem cell; Thromboembolism; Renal transplantation;kidney disease; Chronic disease

2016-11-16）

（本文編輯：陳媛媛）

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2017.03.007

中國博士后基金（2016M590597）；福建省自然科學基金面上項目（2016J01583）；福建省科技創(chuàng)新聯(lián)合資金項目（2016Y9063）

350025 福州總醫(yī)院肝膽內(nèi)科1，泌尿外科2

譚建明，Email：doctortjm@yahoo.com

陳豐穗，吳志賢，蔡錦全，等.外周靜脈輸注臍帶間充質(zhì)干細胞致血栓形成臨床研究[J/CD].中華細胞與干細胞雜志（電子版），2017，7（3）：159-161.