肝寧方對肝細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)分子GRP78蛋白及其mRNA表達的影響

李椿瑩，文 彬，李福英，鄧 鑫*

·論著·

·中醫(yī)·中西醫(yī)結(jié)合研究·

肝寧方對肝細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)分子GRP78蛋白及其mRNA表達的影響

李椿瑩1，文 彬2，李福英1，鄧 鑫2*

目的 探討肝寧方對肝細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)相關(guān)分子葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)蛋白及其mRNA表達的調(diào)控作用及臨床意義。方法 本研究時間為2015年10月—2016年7月。SPF級SD健康大鼠20只用于制備肝寧方血清；衣霉素溶于DMSO溶液，完全溶解后加入含有胎牛血清的培養(yǎng)液制備衣霉素培養(yǎng)液。將HL-7702肝細胞分為正常對照組、ERS模型組、肝寧方治療組。正常對照組予正常培養(yǎng)液培養(yǎng)，ERS模型組予衣霉素培養(yǎng)液培養(yǎng)，肝寧方治療組予含肝寧方血清的衣霉素培養(yǎng)液培養(yǎng)。采用qRT-PCR測定各組肝細胞ERS中GRP78 mRNA表達水平及Western blotting法檢測相應(yīng)蛋白的表達水平。結(jié)果 ERS模型組肝細胞GRP78 mRNA表達水平高于正常對照組(P<0.05)；肝寧方治療組肝細胞GRP78 mRNA表達水平低于ERS模型組(P<0.05)。ERS模型組與肝寧方治療組GRP78蛋白表達水平高于正常對照組(P<0.05)；肝寧方治療組GRP78蛋白表達水平低于ERS模型組(P<0.05)。結(jié)論 肝寧方能夠改善肝功能損傷情況，有效降低肝細胞的凋亡，其機制可能與抑制肝細胞內(nèi)GRP78的表達有關(guān)。

肝細胞；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激；肝寧方；葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78

李椿瑩，文彬，李福英，等.肝寧方對肝細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)分子GRP78蛋白及其mRNA表達的影響[J].中國全科醫(yī)學(xué)，2017，20(21)：2644-2648.[www.chinagp.net]

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內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)是細胞蛋白質(zhì)合成、折疊、分泌、運輸和Ca2+存儲的重要場所，肝細胞內(nèi)含有豐富的ER。近年來內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)調(diào)節(jié)肝臟疾病方面的研究較廣泛[1]。葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)是ER分子伴侶，是促進胞蛋白質(zhì)成熟、維系細胞功能和存活的關(guān)鍵性調(diào)節(jié)蛋白，在ERS的激活過程中發(fā)揮重要作用，是ERS的標志性蛋白[2-3]。課題組的前期研究結(jié)果表明，肝寧方可改善肝臟炎癥狀態(tài)，保護受損肝細胞，有效減輕肝纖維增生程度，提高機體氧化應(yīng)激能力，改善機體代謝，在改善臨床癥狀及肝功能方面均有較好的療效[4-5]。本研究通過采用qRT-PCR、Western blotting法觀察肝寧方對肝細胞ERS相關(guān)分子GRP78蛋白及其mRNA表達的影響，探討肝寧方對肝細胞ERS的調(diào)控作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 本研究時間為2015年10月—2016年7月。SPF級SD健康大鼠20只，6～7周齡，雄性，體質(zhì)量(180±20)g，購自廣西醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心，動物合格證：scxk 桂2015-0008，置于恒溫(25 ℃)，濕度50%的環(huán)境中飼養(yǎng)。

1.2 主要試劑及儀器 Trizol試劑(北京百奧森泰生物技術(shù)有限公司)，RNA提取試劑盒(美國Sigma公司)，四季青胎牛血清(北京索萊寶科技有限公司)，RPMI-1640培養(yǎng)基(美國Gibco公司)，青鏈霉素混合液(北京索萊寶科技有限公司)，DMSO試劑(美國Amresco公司)，DEPC處理水(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，0.25%胰酶及2 mg/ml Ⅰ型膠原酶(北京索萊寶生物科技有限公司)，肝寧方(廣西中醫(yī)/民族醫(yī)藥研發(fā)基地)，衣霉素(美國Sigma 公司)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒及SYBR Green熒光定量染料法試劑盒(美國Thermo fisher 公司)，GRP78多克隆抗體(Abcam美國公司)，β-actin 多克隆抗體(美國Santa Cruz 公司)，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。電泳儀及電轉(zhuǎn)儀(美國伯樂公司)，0-2PE型熒光倒置顯微鏡(日本OLYMPUS 公司)，3-16K高速冷凍離心機(美國Sigma 公司)，PCR擴增儀(德國Eppendoff公司)。

1.3 藥物制備

1.3.1 完全培養(yǎng)液配制 每100 ml的RPMI-1640培養(yǎng)基中加入10%胎牛血清、1%的青鏈霉素混合液，放置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 肝寧方血清制備 SPF級SD大鼠20只，按照大鼠體質(zhì)量灌胃給予肝寧方，25 g·kg-1·d-1，2次/d，連續(xù)給藥7 d，最后1 d禁食24 h。末次給足全天藥量2 h后，腹腔內(nèi)注射乳化異氟烷麻醉，解剖，腹主動脈取血，37 ℃水浴60 min，高速離心機，3 000 r/min離心15 min(離心半徑為5 cm)，然后取上清液，56 ℃水浴30 min滅活補體，過濾除菌，-57 ℃條件下真空干燥48 h形成干燥粉末，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 衣霉素培養(yǎng)液制備 將1 mg衣霉素溶于200 μl的DMSO試劑，待衣霉素完全溶解后加入含有胎牛血清的完全培養(yǎng)液，配成50 ml含有衣霉素的培養(yǎng)液，置放于-20 ℃冰箱凍存?zhèn)溆?，使用前置? ℃冰箱溶解。

1.4 實驗方法

1.4.1 人正常肝細胞株HL-7702細胞培養(yǎng) 將人正常肝細胞株HL-7702(購自中國科學(xué)院細胞庫)置于25 cm2的培養(yǎng)瓶中，加入含5 ml的完全培養(yǎng)液，無菌條件下置于5 ℃ CO2恒溫孵育箱內(nèi)培養(yǎng)，溫度為37 ℃，飽和濕度，每2 d換液一次，常規(guī)培養(yǎng)48 h，倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)、貼壁情況和生長狀況，取對數(shù)生長期細胞用于實驗檢測。

1.4.2 實驗分組 將HL-7702肝細胞分別設(shè)置為正常對照組、ERS模型組、肝寧方治療組，每組細胞分別置于25 cm2的細胞培養(yǎng)瓶中，正常對照組予正常培養(yǎng)液培養(yǎng)，ERS模型組予衣霉素培養(yǎng)液培養(yǎng)，肝寧方治療組予含肝寧方血清的衣霉素培養(yǎng)液培養(yǎng)。3組細胞培養(yǎng)72 h后分離提取細胞。

1.5 ERS模型組細胞培養(yǎng) 取對數(shù)生長期的HL-7702肝細胞常規(guī)培養(yǎng)24 h后，在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)、貼壁情況和生長狀況，待細胞生長至50%時，將含有0.30 μg/ml濃度的衣霉素培養(yǎng)液加入到常規(guī)培養(yǎng)的HL-7702肝細胞培養(yǎng)瓶內(nèi)干預(yù)，放入恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)48 h(衣霉素濃度及培養(yǎng)時間根據(jù)不同的實驗?zāi)康亩?，本研究選擇對細胞生長有抑制作用，但不會使大量細胞凋亡的濃度作為誘導(dǎo)形成ERS的適宜濃度和時間)，培養(yǎng)48 h后更換常規(guī)培養(yǎng)液，在37 ℃、5%CO2、95%濕度條件下再繼續(xù)培養(yǎng)6 h。

1.6 肝寧方治療組細胞培養(yǎng) 將滅菌后的大鼠含藥血清按照10 μg/ml濃度加入含有胎牛血清的完全培養(yǎng)液中備用。肝寧方治療組在ERS模型組完成的基礎(chǔ)上加入含有10 μg/ml含藥血清培養(yǎng)液，培養(yǎng)72 h后分離細胞。

1.7 qRT-PCR測定GRP78 mRNA的表達 根據(jù)實驗分組的不同方法，PBS沖洗2次后，棄去PBS，每瓶細胞內(nèi)加入1 ml Trizol試劑，反復(fù)吹打使細胞裂解后移入離心管，加入200 μl CCl4，混勻，4 ℃高速離心機，12 000 r/min離心15 min(離心半徑為12 cm)后取上清液，加入200 μl異丙醇，冰上放置10 min，4 ℃高速離心機，12 000 r/min離心10 min(離心半徑為12 cm)后去上清液，加入預(yù)冷的 1 ml 75%乙醇，4 ℃高速離心機，8 000 r/min離心5 min(離心半徑為7 cm)后去上清，加入20 μl DEPC處理水溶解RNA沉淀；紫外分光光度儀檢測RNA純度和濃度；采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的肝細胞總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA后進行qRT-PCR檢測，反應(yīng)體系配制及反應(yīng)條件嚴格按照SYBR Green熒光定量染料法試劑盒說明書進行操作，以SYBR Green熒光染料法進行qRT-PCR檢測GRP78 mRNA表達水平。以GAPDH作為內(nèi)參照，PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性3 min；擴增40個循環(huán)：95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s。上述實驗重復(fù)3次。用2-ΔΔCt法計算各組肝細胞中GRP78 mRNA表達水平。

1.8 Western blotting法檢測GRP78 蛋白表達 按實驗分組收集各組細胞，PBS沖洗2次，分別加入500 μl的RIPA細胞裂解液，用移液槍吹打均勻后置于冰上裂解30 min ，然后于4 ℃高速離心機，12 000 r/min離心15 min(離心半徑為12 cm)，取上清液，此為細胞總蛋白，用BCA 法檢測蛋白濃度。按5∶1比例將細胞總蛋白與6×蛋白電泳上樣緩沖液混合，95 ℃水浴變性5 min，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，電轉(zhuǎn)移法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF濾膜上。轉(zhuǎn)膜后用5%的脫脂牛奶封閉1 h后去封閉液，加入按1∶1 000稀釋后的一抗，于4 ℃孵育過夜，再予1∶2 000的HRP標記的辣根過氧化物酶標記IgG 室溫孵育1 h，ECL顯色，Quantity One 軟件測定分析結(jié)果。采用GAPDH作為內(nèi)參照，分別以相應(yīng)蛋白與GAPDH光密度比值表示該蛋白相對表達水平。

2 結(jié)果

2.1RNA純度及PCR擴增曲線 提取總RNA用超微量分光光度計測定OD260/OD280為1.8～2.0，RNA純度符合擴增要求；產(chǎn)物熔解曲線呈銳利的單一峰，熔解溫度(Tm)均一，說明PCR產(chǎn)物特異性高，無雜帶。GAPDH、GRP78qRT-PCR擴增曲線呈S型，基線平滑，將檢測臨界點定在Ct值，即PCR產(chǎn)物進入指數(shù)增長期的起始點(見圖1)。

2.2 肝細胞ERS相關(guān)分子GRP78mRNA表達水平 3組GRP78mRNA表達水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。ERS模型組肝細胞GRP78mRNA表達水平高于正常對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；肝寧方治療組肝細胞GRP78mRNA表達水平低于ERS模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見表1)。

2.3 肝細胞ERS相關(guān)分子GRP78蛋白表達水平 各組肝細胞GRP78與內(nèi)參GAPDH平均灰度值比值分別為:正常對照組為(17.93±3.40)%，ERS模型組為(80.21±14.43)%，肝寧方治療組為(51.05±6.94)%。3組GRP78蛋白表達水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=34.43，P<0.05)。ERS模型組與肝寧方治療組在GRP78蛋白表達水平高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；肝寧方治療組GRP78蛋白表達水平低于ERS模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，見圖2)。

Table1ExpressionlevelsofGRP78mRNAassociatedwithERPinhepatocytesinthethreegroups

組別GRP78mRNA正常對照組1.00±0.10ERS模型組1.84±0.19a肝寧方治療組1.34±0.43bF值64.79P值<0.01

注：GRP78=葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78，ERS=內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激；與正常對照組比較，aP<0.05；與ERS模型組比較，bP<0.05

圖2 各組肝細胞GRP78、GAPDH蛋白表達水平

Figure 2 GRP78 and GAPDH protein expression levels in hepatocytes in the three groups

3 討論

肝臟是人體最大且功能復(fù)雜的代謝器官，是外源性產(chǎn)物及代謝產(chǎn)物攻擊的主要靶器官[6]。目前許多研究證明肝臟疾病的發(fā)病機制與ERS相關(guān)[7-8]。ER是真核細胞重要的細胞器，細胞內(nèi)最大的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，其具有蛋白質(zhì)合成、修飾與加工，脂類和糖類的合成，水和電解質(zhì)代謝，Ca2+儲存及調(diào)節(jié)功能，還參與物質(zhì)運輸、物質(zhì)交換、解毒作用以及對細胞的機械支持，保持ER穩(wěn)態(tài)是維持細胞正常生理狀態(tài)的重要因素。ERS是在缺氧、藥物、病毒感染、氧化應(yīng)激、代謝障礙等刺激下，細胞ER鈣穩(wěn)態(tài)失衡，蛋白質(zhì)錯誤折疊，未折疊的蛋白堆積使細胞處于應(yīng)激狀態(tài)，由此導(dǎo)致的一系列反應(yīng)[9-10]。近年來研究顯示，ERS可能是肝損傷發(fā)生過程中的重要環(huán)節(jié)[11-12]。ERS發(fā)生后主要是通過活化轉(zhuǎn)錄因子6(ATF6)、肌醇依賴酶1(IRE1)和PERK 3種跨膜蛋白傳遞信號，調(diào)節(jié)ER功能，其能夠引起細胞凋亡又能最大限度清除過度損傷的細胞[13]。GRP78是ERS的標志性蛋白，主要分布于細胞ER中，參與ERS相關(guān)的多種生物學(xué)過程。GRP78作為ER中的分子伴侶，在維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮著重要作用，被認為是ER穩(wěn)態(tài)的中心調(diào)節(jié)劑，且當ER功能異常情況時，GRP78大量表達以維持ER穩(wěn)定，具有保護細胞的作用，被認為是發(fā)生ERS的標志[14]。本實驗通過用衣霉素誘導(dǎo)HL-7702肝細胞建立ERS模型，經(jīng)肝寧方干預(yù)后與ERS模型組相比，各種細胞內(nèi)GRP78的表達水平均較模型組降低，由此可見肝寧方能夠有效抑制ERS的強度，對緩解肝細胞受損具有一定的療效。

注：A表示GAPDH擴增曲線，B表示GAPDH溶解曲線，C表示葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)擴增曲線，D表示GRP78溶解曲線

圖1 GAPDH、GRP78擴增和溶解曲線圖

Figure 1 Amplification and dissolution curves of GAPDH and GRP78

我國是乙型肝炎病毒(HBV)感染的高發(fā)地區(qū)，HBV感染患者大部分轉(zhuǎn)化為慢性感染，從而導(dǎo)致肝細胞免疫系統(tǒng)損害以致發(fā)展成肝硬化甚至肝癌[15]。中藥在治療肝臟疾病上具有較好的前景，肝寧方是結(jié)合中醫(yī)、瑤醫(yī)、壯醫(yī)藥理理論優(yōu)勢整合的方劑，由澤蘭、鱉甲、猛老虎、葫蘆茶、黃芪、白芍、白術(shù)、當歸組成。方中黃芪、白芍、白術(shù)、當歸健脾益氣,兼以養(yǎng)血；澤蘭、鱉甲、猛老虎、葫蘆茶活血化瘀通絡(luò),兼以利水。方中猛老虎為廣西瑤藥，具有散瘀消腫作用；葫蘆茶為廣西壯藥，具有消滯利水的作用；以上兩藥是廣西民間醫(yī)師治療急慢性肝炎、肝硬化的常用藥。綜合全方具有攻補兼施，扶正祛邪，以健脾益氣、祛瘀通絡(luò)為主，兼以清熱解毒。結(jié)合前期研究表明，肝寧方可以降低肝纖維化透明質(zhì)酸(HA)、Ⅳ型膠原(Ⅳ-C)水平，增強機體抗氧化損傷能力，減輕肝硬化患者癥狀，降低門脈壓力及HBV-DNA病毒載量，抑制HBV病毒復(fù)制，且對中醫(yī)臨床癥狀具有明顯的改善作用等[16-17]。

本實驗qRT-PCR和Western blotting顯示，以濃度為0.30 μg/ml的衣霉素誘導(dǎo)ERS模型，ERS模型組GRP78 mRNA及其蛋白表達水平顯著高于正常對照組，肝寧方治療組在降低GRP78 mRNA及其蛋白表達水平方面優(yōu)于模型組，說明正常狀態(tài)下，ER分子伴侶GRP78處于無活性狀態(tài)，ERS模型組在經(jīng)過衣霉素誘導(dǎo)后在肝細胞內(nèi)形成ERS效應(yīng)，顯著提高GRP78表達水平，經(jīng)肝寧方藥物干預(yù)后，GRP78表達水平較ERS模型組有所降低，可見當ERS發(fā)生時，ER腔內(nèi)未折疊或錯誤折疊的蛋白增多，GRP78則從跨膜蛋白上解離，促進蛋白折疊。同時也證明了ER功能正常的情況下，GRP78的表達水平較低，而發(fā)生ERS時，其表達水平顯著升高。此外，當GRP78表達上調(diào)時，提示發(fā)生ERS，當肝寧方干預(yù)后GRP78表達下調(diào)，提示ERS得到了一定程度的緩解。中藥肝寧方可抑制肝細胞內(nèi)GRP78的過度表達，減少ERS激造成的肝臟損傷，進而起到保護肝細胞的作用。

綜上所述，肝寧方能夠改善肝功能損傷情況，有效降低肝細胞的凋亡，其機制可能與抑制肝細胞內(nèi)GRP78的表達有關(guān)，但肝寧方在對肝細胞ERS相關(guān)分子GRP78的作用及機制有待醫(yī)學(xué)工作者更深一步的探討研究，本研究通過下調(diào)GRP78的表達水平降低對肝細胞的損害，減少肝細胞的凋亡作用，這也為中醫(yī)藥研究防治肝臟疾病提供了新的思路和方向。

作者貢獻：李椿瑩進行研究設(shè)計與實施、資料收集整理、撰寫論文并對文章負責(zé)；文彬、李福英進行研究實施、評估、資料收集；鄧鑫進行質(zhì)量控制及審校。

本文無利益沖突。

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(本文編輯：崔莎)

Effect of Ganning Decoction on the mRNA and Protein Expression Levels of GRP78 Associated with Hepatic Endoplasmic Reticulum Stress

LIChun-ying1,WENBin2,LIFu-ying1,DENGXin2*

1.GuangxiUniversityofChineseMedicine,Nanning530000,China2.RuikangHospitalAffiliatedtoGuangxiUniversityofChineseMedicine,Nanning530011,China

*Correspondingauthor:DENGXin,Post-doctoral;E-mail：3379806575@qq.com

Objective To investigate the effect and significance of Ganning Decoction on the mRNA and protein expression levels of GRP78 associated with hepatic endoplasmic reticulum stress(ERS).Methods This study was conducted from October 2015 to July 2016.We prepared the serum with Ganning Decoction by using the abdominal aortic blood taken from 20 intervened SPF grade healthy SD rats,and tunicamycin culture medium by adding culture medium containing fetal bovine serum to the DMSO solution with completely dissolved tunicamycin.HL-7702 hepatocytes were divided into normal control group,ERS model group,and Ganning Decoction treatment group,cultured with normal culture medium,tunicamycin culture medium,tunicamycin culture medium containing serum with Ganning Decoction,respectively.The mRNA and protein expression levels of GRP78 associated with hepatic ERS in all the groups were detected by qRT-PCR,and western blotting,respectively.Results The expression level of GRP78 mRNA in hepatocytes of ERS model group was higher than that in the normal control group(P<0.05).The expression level of GRP78 mRNA in hepatocytes of Ganning Decoction treatment group was lower than that in the ERS model group(P<0.05).The normal control group had lower expression level of GRP78 protein than the other two groups(P<0.05).Ganning Decoction treatment group had lower expression level of GRP78 protein than the ERS model group(P<0.05).Conclusion Ganning Decoction can effectively improve the impaired liver function and reduce the apoptosis of hepatocytes.The mechanism may be related to the inhibition of the expressions of GRP78 in hepatocytes.

Hepatocytes;Endoplasmic reticulum stress;Ganning Decoction;Glucose-regulated protein 78

國家自然科學(xué)基金資助項目(81360532)；廣西八桂學(xué)者資助，廣西特聘專家資助

R 329.24

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2017.21.017

2017-01-15；

2017-05-05)

1.530000廣西南寧市，廣西中醫(yī)藥大學(xué)

2.530011廣西南寧市，廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院

*通信作者：鄧鑫，博士后；E-mail：3379806575@qq.com