趙忠新郎慧玲劉晟男錢甜甜曹玓王鈺粟劉丹

抑制JNK通路對(duì)Genistein誘導(dǎo)人結(jié)腸癌細(xì)胞S期阻滯的影響

趙忠新1郎慧玲2劉晟男2錢甜甜2曹玓2王鈺粟2劉丹2

目的探討抑制JNK通路對(duì)染料木黃酮（Genistein，Gen）誘導(dǎo)人結(jié)腸癌SW620細(xì)胞S期阻滯的影響。方法采用流式細(xì)胞術(shù)，檢測(cè)Gen不同濃度及抑制JNK通路對(duì)人結(jié)腸癌SW620細(xì)胞周期的影響。結(jié)果 隨Gen濃度的增高，S期阻滯作用增強(qiáng)（P0．01）；抑制JNK通路可增強(qiáng)Gen對(duì)SW620細(xì)胞S期的阻滯作用（P0．01）。結(jié)論 抑制JNK通路可增強(qiáng)Gen誘導(dǎo)SW620細(xì)胞S期阻滯作用。

染料木黃酮；c-Jun氨基末端激酶；結(jié)腸癌；細(xì)胞周期

結(jié)腸癌是普外科常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，最新統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，結(jié)直腸癌居我國(guó)惡性腫瘤發(fā)病的第4位，居我國(guó)惡性腫瘤死亡的第5位[1]，與以往的數(shù)據(jù)[2-3]比較，新發(fā)病人數(shù)、死亡人數(shù)及所占比率逐年上升。Gen是大豆中最具活性的一種單一成分，有明顯的抗腫瘤作用，并且豆類食物的攝入量與結(jié)腸癌的發(fā)生率呈顯著負(fù)相關(guān)，因此研究Gen抗結(jié)腸癌的分子機(jī)制對(duì)探索腫瘤治療靶點(diǎn)具有重要意義。在前期研究基礎(chǔ)上[4]，本文進(jìn)一步探討抑制JNK通路對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞周期的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料、主要藥品與試劑

人結(jié)腸癌SW620細(xì)胞由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)遺傳室饋贈(zèng)；Gen購(gòu)自Sigma公司；SP600125（JNK抑制劑）購(gòu)自Santa Cruz公司；優(yōu)級(jí)胎牛血清購(gòu)自Hyclone公司；1640培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司；胰蛋白酶和DMSO購(gòu)自Amresco公司；細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒購(gòu)自江蘇碧云天有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

培養(yǎng)SW620細(xì)胞，用含10% FBS的1640培養(yǎng)液置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，細(xì)胞貼壁至滿瓶時(shí)，分瓶傳代。實(shí)驗(yàn)分兩個(gè)系列組，（1）對(duì)照組、Gen組（20 μmol/L）、Gen組（40 μmol/L）、Gen組（80 μmol/L）；（2）對(duì)照組、Gen組（40 μmol/L）、聯(lián)用組（先加40 μmol/L的SP600125 1 h后，再加入40 μmol/L的Gen）。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SW620細(xì)胞以1×105個(gè)/孔細(xì)胞濃度接種于12孔板中，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，加入不同系列組的培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞，70%乙醇固定細(xì)胞24 h后，加入PI工作液500 μl，37℃避光溫浴30 min，流式細(xì)胞儀在激發(fā)波長(zhǎng)488 nm處檢測(cè)紅色熒光，以MODIFIT軟件分析細(xì)胞DNA含量及光散射分析，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

Gen低、中、高濃度組比對(duì)照組S期細(xì)胞顯著增多（P0.01），并隨Gen濃度的增加，S期阻滯作用明顯增強(qiáng)（P0.01），提示Gen主要通過(guò)阻滯S期來(lái)抑制SW620細(xì)胞的增殖；聯(lián)用組比對(duì)照組S期細(xì)胞明顯增多（P0.01），Gen組、聯(lián)用組之間比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.01），提示抑制JNK通路可增強(qiáng)Gen對(duì)SW620細(xì)胞S期的阻滯作用，見(jiàn)圖1。

3 討論

圖1 各組細(xì)胞的細(xì)胞周期及分布柱形圖

c-Jun氨基末端激酶（JNK）信號(hào)通路[5]是絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族中的重要一員，大量研究[6-7]表明JNK信號(hào)通路在腫瘤細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡的發(fā)生與發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用。細(xì)胞增殖亦或抑制是以細(xì)胞能否持續(xù)不斷進(jìn)入細(xì)胞周期來(lái)決定，許多抗腫瘤藥物是通過(guò)阻滯細(xì)胞周期來(lái)干擾癌細(xì)胞的增殖。在不同腫瘤細(xì)胞中，Gen可以誘導(dǎo)G0/G1期、S期和G2/M期細(xì)胞阻滯，使細(xì)胞停止增殖，從而控制腫瘤的發(fā)展。調(diào)控細(xì)胞周期的核心是細(xì)胞周期蛋白（Cyclin）和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（Cdk），兩者結(jié)合才能發(fā)揮調(diào)控細(xì)胞周期的作用。G1期蛋白主要包括Cyclin D和Cyclin E，Cyclin D與Cdk 4或Cdk 6結(jié)合，Cyclin E與Cdk 2結(jié)合；S期蛋白為Cyclin A，Cyclin A與Cdk 2結(jié)合；Cyclin B與Cdk 1（Cdc 2）結(jié)合，為G2/M期主要蛋白。孟婭妮等[8]報(bào)道，7-二氟甲氧基-5，4’-二正辛烷氧基金雀異黃素可誘導(dǎo)宮頸癌HeLa細(xì)胞G1期阻滯，下調(diào)Cyclin D、Cyclin E、Cyclin A蛋白表達(dá)，上調(diào)p15和p21蛋白表達(dá)，抑制HeLa細(xì)胞增殖。范玉貞等[9]研究發(fā)現(xiàn)，Gen能誘導(dǎo)p21WAF1/CIP1（Cdk抑制劑）表達(dá)的增強(qiáng)，調(diào)控細(xì)胞周期。吳晶等[10]提出，金雀異黃素通過(guò)阻滯G2/M期來(lái)抑制結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT-116細(xì)胞增殖。

本研究結(jié)果提示，隨Gen濃度的增加，S期阻滯作用明顯增強(qiáng)，且抑制JNK通路可增強(qiáng)Gen對(duì)SW620細(xì)胞S期的阻滯作用。在不同腫瘤的不同細(xì)胞中，JNK的作用可以激活，亦可以抑制，因細(xì)胞種類和其所在不同環(huán)境中活化的機(jī)制而不同。Gen如何通過(guò)JNK通路調(diào)控腫瘤細(xì)胞周期，JNK的活性對(duì)于預(yù)測(cè)Gen的療效又有怎樣的作用，還需要進(jìn)一步探索和研究。

[1]陳萬(wàn)青，鄭榮壽，張思維，等．2013年中國(guó)惡性腫瘤發(fā)病和死亡分析[J]．中國(guó)腫瘤，2017，26（1）：1-7．

[2]陳萬(wàn)青，鄭榮壽，張思維，等．2012年中國(guó)惡性腫瘤發(fā)病和死亡分析[J]．中國(guó)腫瘤，2016，25（1）：1-8．

[3]陳萬(wàn)青，鄭榮壽，曾紅梅，等．2011年中國(guó)惡性腫瘤發(fā)病和死亡分析[J]．中國(guó)腫瘤，2015，24（1）：1-10．

[4]梅慶步，趙忠新，鄭立紅，等．染料木黃酮對(duì)人結(jié)腸癌SW620細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制[J]．世界華人消化雜志，2013，21（7）： 619-623．

[5]陳譽(yù)華．醫(yī)學(xué)細(xì)胞生物學(xué) [M]．5版．北京：人民衛(wèi)生出版社，2013：290-291．

[6]劉云，李曉飛，鄒倩倩，等．斑蝥素酸鎂阻斷MAPK信號(hào)通路抑制SMMC-7721人肝癌細(xì)胞增殖[J]．細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2017，33（3）：347-351．

[7]王宏婷，王存琴．27-o-（e）-香豆?；?烏索酸通過(guò)調(diào)控jnk/sapk通路誘導(dǎo)人乳腺癌細(xì)胞mda-mb-231細(xì)胞凋亡[J]．中國(guó)中藥雜志，2015，40（4）：722-726．

[8]孟婭妮，于海倫，白軍．7-二氟甲氧基-5，4'-二正辛烷氧基金雀異黃素鈍化Pim-1對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖和侵襲的抑制作用[J]．中國(guó)現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2016，33（8）：1010-1016．

[9]范玉貞，李國(guó)輝，王玉華，等．金雀異黃素的體內(nèi)與體外抗結(jié)腸癌作用及其機(jī)制[J]．中華腫瘤雜志，2010，32（1）：4-9．

[10]吳晶，徐加英，韓淑芬，等．金雀異黃素誘導(dǎo)結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞凋亡及其機(jī)制研究[J]．衛(wèi)生研究，2014，43（1）：1-5．

Effect of Genistein Inducing S Arrest in Human Colon Cancer SW620 Cells Through Inhibiting JNK Pathway

ZHAO Zhongxin1LANG Huiling2LIU Shengnan2QIAN Tiantian2CAO Di2WANG Yusu2LIU Dan21 Department of General Surgery, The First Affiliated Hospital of Qiqihar Medical University, Qiqihar Heilongjiang 161041, China; 2 Basic Medical College, Qiqihar Medical College, Qiqihar Heilongjiang 161006, China

Genistein; JNK; colon cancer; cell cycle

R329

A

1674-9308（2017）13-0194-03

10．3969/j．issn．1674-9308．2017．13．108

黑龍江省教育廳基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)基礎(chǔ)研究項(xiàng)目（2016-KYYWF-0878）

基金項(xiàng)目：黑龍江省衛(wèi)計(jì)委科研課題（2010-226）

基金項(xiàng)目：齊齊哈爾市科技局計(jì)劃項(xiàng)目

基金項(xiàng)目：黑龍江省教育廳大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練重點(diǎn)項(xiàng)目（201611230010）

基金項(xiàng)目：黑龍江省高等教育學(xué)會(huì)“十三五”規(guī)劃課題（16G268）

基金項(xiàng)目：齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院大學(xué)生課外科技活動(dòng)項(xiàng)目

1 齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院普外科，黑龍江 齊齊哈爾161041；2 齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006

劉丹

[Abstract]ObjectiveTo investigate the effects of Genistein (Gen) inducing S arrest in human colon cancer SW620 cells through inhibiting JNK pathway.Methods Cell cycles of the different groups included the low and high concentration of Gen and inhibition of JNK pathway groups were detected by fl ow cytometry.ResultsWith concentration of Gen increasing, the effects of S arrest enhanced (P0.01). Inhibition of JNK pathway could strengthen Gen S arrest in SW620 cells (P0.01).ConclusionEffects of Gen inducing S arrest enhances in SW620 cells through inhibiting JNK pathway.