陳欣欣,劉珠媛,顧寰宇,周蕾

(南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心臟內(nèi)科,南京 210029)

?精準(zhǔn)與轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)?

人類胚胎干細(xì)胞來源的心肌細(xì)胞模型的建立及系統(tǒng)鑒定方案

陳欣欣,劉珠媛,顧寰宇,周蕾

(南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心臟內(nèi)科,南京 210029)

心肌細(xì)胞是研究心血管疾病的重要工具之一,但是人類心肌細(xì)胞較難獲得和培養(yǎng).為人類胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化成心肌細(xì)胞提供一個(gè)有用的實(shí)驗(yàn)方法和鑒定方案.人胚胎干細(xì)胞以其多向分化的特性為體外研究提供了細(xì)胞資源.在人胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞的過程中,通過熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),在分化過程中干細(xì)胞標(biāo)記物Cripto,Dnmt3b,Wnt3,KIF4,Oct4,SOX2和Nanog表達(dá)下降,心肌特異性結(jié)構(gòu)蛋白cTnT和α-actinin以及心臟前體細(xì)胞分化標(biāo)記物Nkx2.5表達(dá)上升.分化完成后用免疫熒光檢測(cè)心肌特異性結(jié)構(gòu)蛋白TnnT2和α-actinin,通過分析TnnT2陽(yáng)性細(xì)胞的比例, α-actinin陽(yáng)性細(xì)胞的比例,以及TnnT2和α-actinin雙陽(yáng)性細(xì)胞的比例發(fā)現(xiàn),在所提出的胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化體系中,三者比例分別為90.80%,91.00%,90.91%,表明在此誘導(dǎo)分化條件下人胚胎干細(xì)胞可成功分化成為心肌細(xì)胞.成功建立了人胚胎干細(xì)胞來源的心肌細(xì)胞模型以及基于標(biāo)記物熒光定量PCR及免疫熒光系統(tǒng)檢測(cè)的鑒定方案,為未來心血管疾病的基礎(chǔ)研究及心臟毒性藥物檢測(cè)奠定了一定的基礎(chǔ).

人胚胎干細(xì)胞;細(xì)胞分化;心肌細(xì)胞

心血管疾病已成為21世紀(jì)人類健康的首要?dú)⑹?針對(duì)心血管疾病的基礎(chǔ)研究是研發(fā)此類疾病治療方法的基本手段.但遺憾的是,人類心肌細(xì)胞的獲取和培養(yǎng)都極其困難,而基于人類心肌細(xì)胞的研究相較大鼠心肌細(xì)胞更有助于模擬人類心血管疾病.人胚胎干細(xì)胞(human embryonic stem cells,hESCs)具有分化全能性,可誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞[1-3].分化后的心肌細(xì)胞在形態(tài)結(jié)構(gòu)[4]、基因表達(dá)[5]、電生理特性[6]、離子通道[7]等特征上均和人體內(nèi)心肌細(xì)胞相同.隨著胚胎干細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展,人胚胎干細(xì)胞可以被誘導(dǎo)生成人類心肌細(xì)胞,但是缺乏簡(jiǎn)單可靠的方案[8-9].

近年來,人胚胎干細(xì)胞在藥物研發(fā)及藥物安全性評(píng)價(jià)研究中的作用越來越受到人們的重視[9-10],美國(guó)國(guó)家研究委員會(huì)提出的“21世紀(jì)毒性測(cè)試新策略”將基于人胚胎干細(xì)胞的新的藥物心臟毒性評(píng)價(jià)模型納入其中[11],歐洲替代法驗(yàn)證中心(European Centre for the Validation of Alternative Methods,ECVAM)也正式批準(zhǔn)胚胎干細(xì)胞為體外藥物和化合物毒性篩選的替代方法,并制定了相應(yīng)的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[12].但是,進(jìn)行藥物心臟毒性研究時(shí)采用人胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)的人類心肌細(xì)胞效果更佳.此外,開發(fā)人胚胎干細(xì)胞來源的心肌細(xì)胞可避免動(dòng)物模型的種屬差異,縮短研發(fā)周期,降低模式動(dòng)物的消耗,減少研發(fā)費(fèi)用,是大規(guī)模篩選心臟疾病相關(guān)藥物的理想手段[13].但遺憾的是,目前人胚胎干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化的比率并不高[14],且對(duì)于分化完成后心肌細(xì)胞的鑒定方案單一,局限于鏡下觀察或?qū)ι倭繕?biāo)記物的檢測(cè),缺少系統(tǒng)完善的鑒定體系[15-17].本實(shí)驗(yàn)對(duì)在體外定向誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞向心肌細(xì)胞的分化方法進(jìn)行了優(yōu)化,并對(duì)干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記物和心肌細(xì)胞標(biāo)記物進(jìn)行鑒定,建立了一種人類胚胎干細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞的優(yōu)化方法,同時(shí)為該來源的心肌細(xì)胞模型建立提供了系統(tǒng)的評(píng)價(jià)方法,為更好地服務(wù)體外心臟毒性實(shí)驗(yàn)、心肌細(xì)胞實(shí)驗(yàn)等研究提供一定的理論基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料

人胚胎干細(xì)胞購(gòu)自Wicell公司.

人胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)及分化：DMEM/F12,RPMI1640/B27,胎牛血清,8 000 U/mL青霉素和8 mg/mL鏈霉素混合液,0.25%Trypsin-EDTA(1X)購(gòu)于Gibco公司,CHIR99021(GSK3抑制劑)和IWP2(Wnt抑制劑)購(gòu)于Selleck公司,堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子/bFGF購(gòu)于Peprotech公司.

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)及熒光定量PCR相關(guān)試劑：trizol購(gòu)于Takara公司,反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于BioRad公司,PCR引物購(gòu)于華大基因公司,SYBR Green熒光定量PCR試劑盒購(gòu)于BioRad公司,96/384孔熒光定量PCR板及配套貼膜購(gòu)于Abcam公司.

免疫熒光檢測(cè)相關(guān)試劑：載玻片購(gòu)于南通天盛公司,免疫熒光用特異性單克隆一抗TnnT2,α-actinin購(gòu)于Abcam公司,熒光二抗購(gòu)于Jackson公司,Hoechst購(gòu)于凱基公司.

1.2 方法

1.2.1 人胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)

人胚胎干細(xì)胞飼養(yǎng)于小鼠滋養(yǎng)層細(xì)胞上,且用添加堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor,bFGF,4 ng/mL)的無血清培養(yǎng)基(DMEM/F12+20%KSR)進(jìn)行培養(yǎng).待人胚胎干細(xì)胞克隆長(zhǎng)至足夠大小后(大約5 d),吸去培養(yǎng)基,用DMEM/F12洗一遍,然后加入1 mL Dispase于37?C消化3 min,再次加入DMEM/F12,洗一遍后吸去Dispase和DMEM/F12.后用移液管將人胚胎干細(xì)胞克隆機(jī)械分割成直徑約200μm的細(xì)胞團(tuán)塊, 100×g離心1 min.用含有bFGF的培養(yǎng)基重懸至小鼠滋養(yǎng)層細(xì)胞(預(yù)先用DMEM/F12洗去小鼠滋養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)基中的血清)上.次日,全換液,接下來每天換液時(shí)留下前一天的0.5 mL培養(yǎng)液(以保留少量滋養(yǎng)層細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子).等到第五天左右傳代.

1.2.2 人胚胎干細(xì)胞向心肌細(xì)胞的定向誘導(dǎo)分化

人胚胎干細(xì)胞向心肌細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化前一天傳代時(shí),將細(xì)胞克隆機(jī)械分割成100～150μm的細(xì)胞團(tuán)塊.第五天,提前3 h用rock抑制劑Y27632(5μmol/L)處理,后吸去培養(yǎng)基,先用2 mL 0.05%Trypsin清洗,中和殘余培養(yǎng)基,再加入2 mL 0.05%Trypsin,于37?C消化3 min,吸去Trypsin后置于37?C再消化3～5 min,直至大部分細(xì)胞克隆消化成單細(xì)胞.然后用培養(yǎng)基重懸,50×g離心30 s去除未消化成單細(xì)胞的細(xì)胞團(tuán)塊.取上清液1 000×g離心2 min,去上清液用培養(yǎng)基重懸洗滌2次后計(jì)數(shù).用含5μmol/L rock抑制劑Y27632和4 ng/mL bFGF的3 mL培養(yǎng)基,將40～60萬細(xì)胞接種于鋪有低密度滋養(yǎng)層細(xì)胞的6孔板(預(yù)先用DMEM/F12洗去小鼠滋養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)基中的血清)中.第五天處理后每天換液,換液時(shí)不添加Y27632.第八天換液時(shí)用3 mL含12μmol/L CHIR99021(GSK3抑制劑)的RPMI1640/B27(不含胰島素)培養(yǎng)基,以便誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞形成中胚層細(xì)胞.第九天,用不含CHIR99021的RPMI1640/B27(不含胰島素)培養(yǎng)基.第十天換成3 mL含5μmol/L IWP2(Wnt抑制劑)的RPMI1640/B27(不含胰島素)培養(yǎng)基,以便誘導(dǎo)形成心肌中胚層.第十二天后,用不含IWP2的RPMI1640/B27(不含胰島素)培養(yǎng)基.

1.2.3 免疫熒光

將分化完成的人胚胎干細(xì)胞以20萬/mL鋪于24孔板.將培養(yǎng)基吸棄,用4%多聚甲醛固定15 min,0.5%Triton X-100破膜25 min,5%牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)室溫封閉1 h.用5%BSA稀釋一抗：α-actinin(1∶200),TnnT2(1∶100),4?C孵育過夜.次日,吸棄抗體孵育液,磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)清洗,用5%BSA配制相應(yīng)熒光二抗(1∶200),室溫避光孵育2 h.PBS清洗,用Hoechst染細(xì)胞核.最后,每孔加入100μL PBS,于熒光顯微鏡下拍照.

1.2.4 熒光定量PCR檢測(cè)

采用熒光定量PCR檢測(cè)Cripto,Dnmt3b,Wnt3,KIF4,Oct4,SOX2,Nanog,cTnT, α-actinin和Nkx2.5的表達(dá),引物序列如表1所示.

從培養(yǎng)箱中取出6孔板,在每孔中加入700μL Trizol,裂解3 min,室溫放置5 min,收集每孔的裂解到1.5 mL離心管中,在每個(gè)離心管中加入140 mL氯仿,渦旋30 s,室溫放置3 min,4?C,12 000×g離心15 min,Trizol∶氯仿=5∶1(體積比),吸取上層無色水相到新的1.5 mL離心管中,加入等體積異丙醇混勻,室溫放置10 min,在管底可見微量RNA沉淀,棄上清,加入75%乙醇700μL(75%乙醇用DEPC水配),4?C,7 500×g離心10 min,棄上清液,通風(fēng)櫥內(nèi)干燥5～10 min,將沉淀溶于20μL DEPC水中,測(cè)RNA濃度.逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系如下：5×iScript Reaction mix 4μL,iScript Reverse Transcriptase 1μL,總RNA 2.0μg, Nuclease free H2O的體積為7.5μL減去RNA體積,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA.利用合成的cDNA和對(duì)應(yīng)的PCR引物檢測(cè)目的基因的表達(dá)水平.

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.2.5 統(tǒng)計(jì)方法

運(yùn)用SPSS21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析.選用單因素方差分析進(jìn)行組間比較,并以Bonferroni作兩兩比較.P<0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異.

2 結(jié)果

2.1 干細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)變化

分別在分化的0,1,5,8 d用熒光定量PCR檢測(cè)干細(xì)胞相關(guān)基因Cripto,Dnmt3b,Wnt3, KIF4,Oct4,SOX2,Nanog,結(jié)果顯示,在分化過程中上述基因表達(dá)依次下調(diào),說明在本工作的分化體系下,干細(xì)胞逐漸失去干性,開始分化(見圖1).圖1中,相對(duì)于0 d,?為P<0.05,??為P<0.01,???為P<0. 001;相對(duì)于1 d,#為P<0.05,##為P<0.01,##為P<0. 001;相對(duì)于5 d,$為P<0.05,$$為P<0.01,$$$為P<0.001,n=4.

2.2 心肌細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)

分別在分化的0,1,5,8 d用熒光定量PCR檢測(cè)心肌特異性結(jié)構(gòu)蛋白cTnT和α-actinin,以及心臟前體細(xì)胞分化標(biāo)記物Nkx2.5.結(jié)果顯示,在分化過程中,cTnT,α-actinin和Nkx2.5表達(dá)逐漸上升,說明人類胚胎干細(xì)胞逐漸向心肌細(xì)胞分化(見圖2).

在分化完成的胚胎干細(xì)胞中,運(yùn)用免疫熒光檢測(cè)心肌特異性結(jié)構(gòu)蛋白TnnT2和α-actinin(見圖3),通過分析TnnT2陽(yáng)性細(xì)胞的比例,α-actinin陽(yáng)性細(xì)胞的比例,以及TnnT2和α-actinin雙陽(yáng)性細(xì)胞的比例發(fā)現(xiàn),在本工作提出的胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化體系中,三者比例分別為90.80%,91.00%,90.91%(見圖4).

圖1 熒光定量PCR檢測(cè)人胚胎干細(xì)胞干性相關(guān)基因Fig.1 Fluorescent quantitative PCRs determines genes related to pluripotency state of hESCs

圖2 熒光定量PCR檢測(cè)心肌細(xì)胞分化標(biāo)志物Fig.2 Fluorescent quantitative PCRs determines markers of cardiomyocytes differentiation

圖3 免疫熒光檢測(cè)心肌特異性結(jié)構(gòu)蛋白TnnT2和α-actininFig.3 Immunofluorescence stainings for TnnT2 and α-actinin

圖4 免疫熒光檢測(cè)人胚胎干細(xì)胞分化效率Fig.4 Immunofluorescence stainings for the differentiation efficiency

3 討論

人胚胎干細(xì)胞具有多向分化的能力,在不同的誘導(dǎo)條件下可以分化為神經(jīng)細(xì)胞、成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和心肌細(xì)胞等多種細(xì)胞,在體外可長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)、傳代.本工作在既往研究的基礎(chǔ)上總結(jié)經(jīng)驗(yàn),成功建立了一種將人類胚胎干細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞的優(yōu)化方法,并建立了全面系統(tǒng)的鑒定體系.

通過熒光定量PCR檢測(cè)人胚胎干細(xì)胞在誘導(dǎo)分化后干性基因和心肌分化標(biāo)志物基因的表達(dá)情況.結(jié)果表明,Cripto,Dnmt3b,Wnt3,KIF4,Oct4,SOX2,Nanog是未分化人胚胎干細(xì)胞中特異表達(dá)基因.這些基因經(jīng)誘導(dǎo)后在人胚胎干細(xì)胞的表達(dá)逐漸下降,提示人胚胎干細(xì)胞不再維持自身的未分化狀態(tài),而細(xì)胞逐漸分化并失去干性.Nkx2.5在心肌發(fā)育過程中發(fā)揮關(guān)鍵性作用,是心臟前體細(xì)胞特異性表達(dá)的重要轉(zhuǎn)錄因子,其激活常常意味著心肌細(xì)胞分化程序的啟動(dòng).熒光定量PCR結(jié)果顯示,人胚胎干細(xì)胞經(jīng)過誘導(dǎo)后,Nkx2.5表達(dá)并逐漸升高,說明心肌細(xì)胞的分化程序已被啟動(dòng).cTnT和α-actinin是心肌特異性結(jié)構(gòu)蛋白,同樣在誘導(dǎo)后表達(dá)逐漸升高,這提示在本工作的誘導(dǎo)分化模型中，人胚胎干細(xì)胞已被定向分化為人心肌細(xì)胞.通過對(duì)干細(xì)胞標(biāo)記物表達(dá)和心肌細(xì)胞標(biāo)記物表達(dá)兩方面的動(dòng)態(tài)檢測(cè),對(duì)人源性胚胎干細(xì)胞分化成心肌細(xì)胞進(jìn)行了驗(yàn)證.

為了進(jìn)一步證實(shí)本工作提出的細(xì)胞分化體系可以獲得成熟的人心肌細(xì)胞,用免疫熒光方法檢測(cè)了分化完成的細(xì)胞.通過分析TnnT2陽(yáng)性細(xì)胞的比例,α-actinin陽(yáng)性細(xì)胞的比例,以及TnnT2和α-actinin雙陽(yáng)性細(xì)胞的比例發(fā)現(xiàn),在優(yōu)化后的胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化體系中,三者比例分別為90.80%,91.00%,90.91%.通過熒光定量PCR和免疫熒光兩種檢測(cè)方式對(duì)人源性胚胎干細(xì)胞分化成心肌細(xì)胞進(jìn)行了驗(yàn)證.基于此,本工作建立了對(duì)人胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化的過程中心肌細(xì)胞標(biāo)記物和干細(xì)胞標(biāo)記物兩方面驗(yàn)證;并在分化完成后對(duì)心肌細(xì)胞標(biāo)記物和干細(xì)胞標(biāo)記物通過熒光定量PCR和免疫熒光兩種檢測(cè)方式驗(yàn)證系統(tǒng)鑒定方案.

人胚胎干細(xì)胞可以在不同的誘導(dǎo)條件下分化成各種類型的終末細(xì)胞,這種能力為進(jìn)行靶細(xì)胞、靶器官特異性毒性評(píng)價(jià)提供了條件.完善高純度、穩(wěn)定的人胚胎干細(xì)胞定向誘導(dǎo)心肌細(xì)胞體系是構(gòu)建藥物心臟毒性評(píng)價(jià)模型等心臟疾病相關(guān)基礎(chǔ)研究的一個(gè)重要思路,也是藥物大規(guī)模篩選的理想平臺(tái),能夠?qū)崿F(xiàn)藥物研發(fā)及安全性評(píng)價(jià)的個(gè)性化,提高藥物治療、藥物研發(fā)的針對(duì)性,避免動(dòng)物實(shí)驗(yàn)帶來的種屬差異,減少藥物研發(fā)費(fèi)用,縮短研發(fā)周期.

本工作初步建立了一個(gè)高效、簡(jiǎn)便的定向誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞的優(yōu)化模型,同時(shí)建立了一種綜合全面的鑒定方案,為細(xì)胞模型建立提供了系統(tǒng)的評(píng)價(jià)方法,為體外心臟毒性評(píng)價(jià)方法的發(fā)展提供了方向,為今后將大量純化人胚胎干細(xì)胞來源的心肌細(xì)胞用于心臟疾病的科學(xué)研究打下了扎實(shí)基礎(chǔ).

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Human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes model establishment and systemic identification scheme

CHEN Xinxin,LIU Zhuyuan,GU Huanyu,ZHOU Lei
(Department of Cardiology,First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University, Nanjing 210029,China)

Cardiomyocytes is useful in the study of many cardiovascular diseases,while human cardiomyocytes are difficult to obtain and culture.With multi-directional differentiation properties,human embryonic stem cells can provide cell resources in vitro.This study aims to establish a useful protocol to induce the differentiation of human embryonic stem cells into cardiomyocytes,and observe identification of human cardiomyocytes. Expression of stem cell markers including Cripto,Dnmt3b,Wnt3,KIF4,Oct4,SOX2 and Nanog decrease during differentiation while cardiac progenitor cell marker Nkx2.5 andcardiomyocytes specific markers TnnT2 and α-actinin increase.Ratios of TnnT2 positive cells,α-actinin positive cells,TnnT2 and α-actinin double positive cells are 90.80%,91.00%, and 90.91%.These results indicate that human embryonic stem cells can be efficiently induced into cardiomyocytes in the proposed protocol.In conclusion,differentiation of human embryonic stem cells into cardiomyocytes has been successfully induced and an identification scheme has been established,and markers have been detected through quantitative PCR and immunofluorescence stainings.The protocol will facilitate better understanding of pathogenesis of cardiovascular diseases and enable better cardiotoxicity drug screening. Key words：human embryonic stem cell;cell differentiation;cardiomyocytes

Q 25

A

1007-2861(2017)03-0378-09

10.12066/j.issn.1007-2861.1939

2017-04-03

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81370280,81570332)

周蕾(1970—),女,教授,主任醫(yī)師,博士生導(dǎo)師,博士,研究方向?yàn)樾牧λソ? E-mail：zhouleinjmu@163.com