王睿哲+唐俊

摘要：通過在營養(yǎng)液中投加不同濃度（0-20mg/L）Fe2+形成根表鐵膜，探討抗生素植物富集作用及根表鐵膜對植物吸收抗生素的影響與效果。結(jié)果表明，沙星類和四環(huán)素類抗生素植物富集作用明顯，根部富集強(qiáng)力霉素能力最大（濃度達(dá)660.03mg/kg），地上部分富集環(huán)丙沙星能力最高（9.31mg/kg）；Fe2+誘導(dǎo)空心菜根表形成鐵膜可以有效降低根部富集抗生素濃度（降低率達(dá)26.56%-84.15%）和地上部位富集抗生素濃度（29.03%-67.38%），且鐵膜對磺胺類抗生素富集阻滯作用最明顯。

關(guān)鍵詞：根表鐵膜；抗生素；空心菜；富集；抑制

中圖分類號：V216.5+1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：2095-672X（2017）04-0119-04

DOI：10.16647/j.cnki.cn15-1369/X.2017.04.056

Abstract： The effects of antibiotic plant enrichment and root iron membrane on plant uptake of antibiotics were studied by adding different concentrations （0-20mg / L） Fe2 + to form root iron membrane. The results showed that the enrichment effect of tetracycline and tetracycline antibiotics was obvious， and the ability of enrichment of doxycycline was the highest （concentration 660.03mg / kg）， and the highest enrichment of ciprofloxacin （9.31mg / kg） （29.03% -67.38%） and the enrichment of antibiotic concentration （29.03% -67.38%） on the aerial parts of the aerial surface， and the iron film was enriched with sulfonamides， and the concentration of antibiotics was reduced Blocking the most obvious effect.

Key words：Root surface iron film； Antibiotics； Spinach； Enrichment； Inhibition

我國是全球抗生素的生產(chǎn)和使用大國，每年生產(chǎn)抗生素原料超過21萬t，人均年消費(fèi)量是美國人的10倍。由于抗生素難以被動物腸胃吸收，約30%-90%以母體化合物的形式隨糞便排出進(jìn)入環(huán)境中（Chee-Sanford et al.， 2009），由此導(dǎo)致的抗生素污染[1]及其生態(tài)毒理效應(yīng)已成為我國乃至全球所面臨的重大環(huán)境問題之一（李偉明等， 2012）?？股卦谝鹚w環(huán)境污染的同時，其在水生植物體內(nèi)遷移與富集逐漸引起人們重視。廖杰等（2015）采用養(yǎng)豬場廢水培養(yǎng)水芹，發(fā)現(xiàn)四環(huán)素等抗生素冬季在水芹葉部富集能力最高達(dá)到7.33mg/kg；王瑾等（2008）在長期施用規(guī)模養(yǎng)殖場豬糞的土壤[2]中種植韭菜后，在其根部檢測出土霉素及金霉素，說明抗生素植物富集能力較高，易通過食物鏈危害人體健康。

空心菜（拉丁文名：Ipomoea aquatic Forsk），是番薯屬光萼組植物，原產(chǎn)中國，現(xiàn)已作為一種蔬菜廣泛栽培?？招牟耸且活惣瓤缮钣诤档赜挚缮钣谒锏乃憙蓷灾参铮€是水分較多時生長旺盛，最適宜在肥水田或畜舍附近的經(jīng)常排糞水的田中種植。因此空心菜對水中殘留抗生素，特別是養(yǎng)殖場排放的糞水中高濃度抗生素的富集問題日益引起社會關(guān)注。

水生植物的根系作為外界污染物進(jìn)入植物體內(nèi)的主要通道，其表面廣泛存在的鐵膜，對植物吸收養(yǎng)分和污染物起著重要的門戶作用（劉文菊， 2005）。根表鐵膜是植物為適應(yīng)淹水環(huán)境，根系生成大量通氣組織，將大氣中的氧氣通過葉片輸送到根系，改變根際環(huán)境，形成大量還原性物質(zhì)，如Fe2+，使其在根表沉積形成鐵氧化膠膜（劉春英，2014）。根表鐵膜可對重金屬元素的吸收與運(yùn)輸起到阻礙作用，如紅樹林根表鐵膜可將鎘截留在根表（Du et al.， 2013），水稻根表鐵膜可以對Sb產(chǎn)生截留作用（黃艷超，2015），與As發(fā)生吸附和共沉淀作用而降低水稻等作物根系吸收As的量 （胡瑩，2013）。另外，鐵膜的氧化作用可將As3+轉(zhuǎn)化成毒性較小的As5+，從而使得植物獲得去除砷毒害的能力（Otte et al.， 1991）。

現(xiàn)有針對根表鐵膜對植物吸收有機(jī)污染物的研究報道較少，馬微等（2015）研究表明，隨著諾氟沙星濃度增加根表鐵膜量逐漸減少，但鐵膜富集的諾氟沙星含量遠(yuǎn)超過根內(nèi)及地上部分含量。綜合以上研究可見，根表鐵膜對諾氟沙星這類兩性化合物具有較強(qiáng)的吸附作用，諾氟沙星在一定程度上抑制了根表鐵膜的形成，而鐵膜對抗生素植物富集的影響尚未明確，現(xiàn)有研究多集中于鐵膜氧化性對金屬價態(tài)的影響，而關(guān)于根際微域氧化性[3]對有機(jī)污染物代謝轉(zhuǎn)化作用的報道甚少。

為此，本項(xiàng)目擬選取空心菜為供試材料，通過室內(nèi)水培實(shí)驗(yàn)，利用添加Fe2+誘導(dǎo)根表形成鐵膜，研究根表鐵膜對磺胺類抗生素（磺胺嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺二甲嘧啶）、氟喹諾酮類抗生素（環(huán)丙沙星、氧氟沙星）和四環(huán)素類抗生素（強(qiáng)力霉素、四環(huán)素、土霉素）植物富集的影響，以期為抗生素在水生蔬菜體內(nèi)富集調(diào)控提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器設(shè)備

Xevo TQ MS超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：美國Waters公司；

固相萃取裝置：十二孔，美國Supelco公司；

超聲波清洗器：KQ-5200型，昆山市超聲儀器有限公司；

氮吹儀：N-EVAPTM 112，Organomation Associates， Jnc；

pH計(jì)：PHS-3C 型，上海精密科學(xué)儀器有限公司；

電子天平：FA2104A型，上海精天儀器有限公司。

1.2 試劑及材料

磺胺嘧啶（Sulfadiazine，SDZ）、磺胺甲噁唑（Sulfamethoxazole，SMZ）、磺胺二甲嘧啶（Sulfamethazine，SM2）、氧氟沙星（Ofloxacin， OFX）、環(huán)丙沙星（Ciprofloxacin， CIP），純度≥99%，Sigma公司；

四環(huán)素（Tetracycline，TC）、土霉素（Oxytetracycline，OTC）、強(qiáng)力霉素（Doxycycline， DOC）標(biāo)準(zhǔn)品，純度≥95%，BIO BASIC INC公司；

乙二胺四乙酸二鈉，優(yōu)級純，國藥化工有限公司；

甲醇，色譜純，天津市四友精細(xì)化工有限公司；

甲酸，優(yōu)級純，天津市四友精細(xì)化工有限公司；

Oasis HLB固相萃取小柱 （200mg/6mL ），美國Waters公司；

實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.3 空心菜培養(yǎng)

選用空心菜（Ipomoea aquatica）飽滿的種子，用純水浸泡10h，再用1%次氯酸鈉溶液浸泡消毒20min，純水洗滌5次。將種子置于蛭石中放在培養(yǎng)箱中催芽（20℃，黑暗），期間保持蛭石濕潤。待空心菜發(fā)芽后移至模擬光源條件下培養(yǎng)，待株高長至10厘米左右時，將其移植進(jìn)行營養(yǎng)液培養(yǎng)。

選擇長勢相似一致的空心菜苗，移植入黑色聚丙烯培養(yǎng)罐（內(nèi)裝1.0L霍格蘭營養(yǎng)液）中，毎罐用苗3株，罐蓋中心開直徑1cm左右小孔，用海綿固定菜苗，使其根部浸入營養(yǎng)液中。

1.4 空心菜根表鐵膜的培養(yǎng)

向營養(yǎng)液中加入不同體積1000mg/L的EDTA-Fe溶液并調(diào)節(jié)pH至5.5，設(shè)置CK、A、B、C、D5個處理組，使Fe2+在每個處理組營養(yǎng)液中濃度分別為0、1、5、10和20mg/L，每組設(shè)3個平行樣。菜苗在20℃下培養(yǎng)5天，每天光照時間16h，期間每天向罐中補(bǔ)充營養(yǎng)液至原體積。

1.5 抗生素暴露實(shí)驗(yàn)

待根表形成鐵膜[4]（根表顏色變成暗紅）后，將原營養(yǎng)液棄去，重新向培養(yǎng)罐中加入1.0L新鮮并且不含F(xiàn)e2+的霍格蘭營養(yǎng)液（pH5.5），然后加入8種1000mg/L抗生素混合標(biāo)樣（甲醇溶解）1.0mL，使各種抗生素濃度達(dá)到1.0mg/L，連續(xù)培養(yǎng)一周。

1.6 樣品前處理

暴露實(shí)驗(yàn)一周后，將空心菜移出培養(yǎng)罐，純水洗滌根部3次后用DCB提取法（馬微， 2015）去除根表鐵膜及其吸附的抗生素，然后將地上部分與地下部分分開，經(jīng)冷凍干燥48h后高速粉碎，過100目篩。

1.7 抗生素提取

參考趙慧蘭（2014）的方法：稱取0.2g粉碎的樣品于15mL聚丙烯離心管重，加入0.2g乙二胺四乙酸二鈉和pH3.0磷酸鹽緩沖液、乙腈各5.0mL，機(jī)械振蕩10min再超聲波提取10min，4000rpm離心5min，上清液移至另一50mL離心管中，再加入pH3.0磷酸鹽緩沖液、乙腈各5.0mL重復(fù)提取兩次。合并提取液，取15mL提取液過0.45?m 濾膜以除去懸浮物[5]，濾液加入到200mL純水中，用甲酸調(diào)節(jié)pH至3.0，過Oasis HLB固相萃取小柱凈化。

HLB小柱上樣之前依次用6.0mL甲醇、6.0mL超純水和6.0mL pH3磷酸鹽緩沖液預(yù)淋，然后水樣以5-8mL/min流速通過HLB小柱。樣品過柱后，用10mL純水洗滌小柱，然后在氮?dú)獗Ｗo(hù)下真空抽濾干燥20min，然后用10.0 mL甲醇洗脫，洗脫液在40℃下用氮?dú)獯蹈?，加?.0 mL 50%甲醇水溶液并超聲助溶，過0.22?m濾膜，待測定。

1.8 抗生素的測定

1.8.1 色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC? BEH C18，1.7μm，2.1mm×100mm；流速[6]：0.15mL/min；進(jìn)樣量：10μL；流動相：A： 2/98=甲醇/水（V/V）+0.1%甲酸 B：甲醇+0.1%甲酸，流動相采用梯度洗脫，具體如表1所示。

1.8.2 質(zhì)譜條件

電離方式：ESI+； 毛細(xì)管電壓：3kv；離子源溫度：150℃；錐孔反吹氣流量：50L/Hr；脫溶劑氣溫度：400℃；脫溶劑氣流量：800L/Hr；監(jiān)測模式：MRM模式，離子監(jiān)測條件（表2）。

1.8.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線配制與方法驗(yàn)證

配制10-500?g/L抗生素混合標(biāo)樣，在上述添加下測定其峰面積，利用峰面積[7]和濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。同時在空白空心菜莖葉和根樣品中添加50?g/kg抗生素混標(biāo)并重復(fù)三次以驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確度和靈敏度，利用S/N=10計(jì)算方法的最低檢測濃度（LOQ）。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法準(zhǔn)確度與精密度

8種抗生素的標(biāo)準(zhǔn)曲線如表3所示，多級反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式總離子流圖見圖1。由表3可見，待測種目標(biāo)抗生素在10-500?g/L濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，決定系數(shù)R2>0.99，8種抗生素添加回收率在78%-95%，RSD<10%，最小檢測濃度為檢測限介于0.83?g/kg和12.58?g/kg之間，能夠滿足樣品中抗生素[8]測定的要求。

2.2 根表鐵膜對空心菜根部抗生素富集的影響

空心菜根部富集8種抗生素的結(jié)果見表4。由表4中CK（對照）組可見，空心菜根部富集抗生素的能力較強(qiáng)，其中沙星類和四環(huán)素類富集濃度均超過100mg/kg，強(qiáng)力霉素富集能力最大，富集系數(shù)達(dá)660.03。同時，投加不同濃度Fe2+形成根表鐵膜后，根部富集的抗生素濃度都明顯下降，較對照組而言濃度降低率可達(dá)26.56%-84.15%。從鐵膜對不同類型抗生素富集阻滯作用來看，鐵膜對磺胺類抗生素的作用最明顯（降低率64.91%-84.15%），其次是沙星類抗生素（降低率51.54%-61.78%），對四環(huán)素類抗生素富集阻滯作用較弱（降低率26.56%-46.87%）。

2.3 根表鐵膜對空心菜地上部位抗生素富集的影響

8種抗生素在空心菜地上部分（莖葉）中富集濃度見表5。CK（對照）組營養(yǎng)液中沒有添加Fe2+形成根表鐵膜，空心菜莖葉中各種抗生素含量均明顯高于其它處理組。對照組莖葉中磺胺嘧啶濃度最低（0.48mg/kg），環(huán)丙沙星最高（9.31 mg/kg），說明沙星類抗生素在空心菜莖葉部位最容易富集，其次是四環(huán)素類，磺胺類抗生素富集能力最低，這可能與抗生素自身的物理化學(xué)特性有關(guān)。通過向營養(yǎng)液中加入1-20mg/L Fe2+，空心菜根表形成不同量鐵膜[9]對其地上部分富集抗生素具有明顯的阻滯作用，其中添加5mg/L Fe2+的處理組（B）莖葉中抗生素濃度相對其它組而言是最低的，8種抗生素富集濃度降低率可達(dá)29.03%-67.38%。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)中，沙星類和四環(huán)素類抗生素在空心菜體內(nèi)富集能力較強(qiáng)，兩類抗生素富集濃度之和為26.59mg/kg，這與廖杰（2015）得出夏季沙星類和四環(huán)素類抗生素在空心菜體內(nèi)濃度達(dá)到22.89-103.7mg/kg的研究結(jié)果基本一致，說明這兩類抗生素在空心菜體內(nèi)富集能力強(qiáng)，水中抗生素容易通過食物鏈進(jìn)入人體。馬薇（2015）研究表明水稻根表鐵膜在土培條件下可以很好抑制根系對諾氟沙星和土霉素[10]的富集，而水培條件下效果不明顯。

本研究中，投加Fe2+在空心菜根表形成鐵膜后，可以有效降低根部富集抗生素濃度（降低26.56%-84.15%）和地上部位富集抗生素[11]濃度（降低29.03%-67.38%），且鐵膜對磺胺類抗生素富集抑制作用最明顯，說明空心菜根表鐵膜對抗生素的富集抑制效果較水稻明顯，可以更好的發(fā)揮對抗生素類污染物的富集調(diào)控作用。通過不同濃度Fe2+的實(shí)際抑制效果分析，5mg/L 的Fe2+在根表形成的鐵膜更有利于調(diào)控空心菜根系對抗生素的富集，這主要與Fe2+對空心菜的營養(yǎng)生長的影響有關(guān)，培養(yǎng)液中加入高濃度Fe2+更有利于誘導(dǎo)根表形成鐵膜，但空心菜生長會受到不利影響，表現(xiàn)為生物量的下降根系發(fā)育的不良，因此會造成富集濃度放大的效應(yīng)，而低濃度的Fe2+誘導(dǎo)生成的鐵膜量有限，不足以承擔(dān)抗生素“富集庫”或者“屏障”作用，因而限制其發(fā)揮對抗生素的富集抑制作用。本實(shí)驗(yàn)關(guān)于濃度為5mg/L 的Fe2+在根表形成的鐵膜更有利于調(diào)控空心菜根系對抗生素[12]富集的結(jié)果可供參考，關(guān)于空心菜根表鐵膜培養(yǎng)及其培養(yǎng)液篩選等有待于更進(jìn)一步的研究。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，空心菜對沙星類和四環(huán)素類抗生素富集作用明顯，而加入Fe2+誘導(dǎo)根表形成鐵膜后，可以較好發(fā)揮其對根系吸收抗生素的抑制作用；培養(yǎng)液中Fe2+量為5mg/L時效果最為明顯，有利于調(diào)控空心菜對水中抗生素的富集。

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作者簡介：唐?。?981-），男，碩士，安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院副教授，研究領(lǐng)域?yàn)榄h(huán)境污染物監(jiān)測與評價、水污染控制技術(shù)。