李翔

摘要：水凝膠分子在藥物靶向制劑方面具有廣闊的應(yīng)用前景。為此，主要對常用抗癌藥紫杉酚制備水凝膠分子進(jìn)行研究。將紫杉酚衍生物（Taxol-SAGSSG，化合物1）制成水凝膠，注入固體腫瘤，可顯著抑制腫瘤生長，阻止新陳代謝。通過靜脈注射紫杉酚，可以提高抗癌效果；血液中的紫杉酚濃度較低，可提高小鼠對紫杉酚的耐藥性，減少化療過程中的副作用。

關(guān)鍵詞：紫杉酚納米纖維；水凝膠；抑制

中圖分類號：TB

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

doi：10.19311/j.cnki.1672.3198.2016.28.104

1 引言

采用臨床用紫杉酚制備水凝膠。為克服化療期間抗癌藥物的缺點(diǎn)（低水溶性和系統(tǒng)毒性），對藥物載體進(jìn)行了大量研究，藥物載體可以增加抗癌藥（如：紫杉酚、喜樹堿和阿霉素）的水溶性，靶向給藥于癌細(xì)胞。聚合物水凝膠、納米藥物載體已得到廣泛應(yīng)用，如脂質(zhì)體、DNA、共聚物，自組裝的分子水凝膠在用作疏水性抗癌藥的靶向給藥系統(tǒng)方面具有很大的潛力。

盡管分子水凝膠已經(jīng)在抗癌藥給藥系統(tǒng)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，但制備時間長、成本高。FDA認(rèn)可的分子水凝膠給藥系統(tǒng)中，只有兩種是未經(jīng)化學(xué)修飾，由藥劑本身形成的。由藥劑本身形成的分子水凝膠給藥系統(tǒng)具有更廣闊的應(yīng)用前景。本文主要研究紫杉酚水凝膠，用于瘤內(nèi)給藥，提高抗癌效果，降低系統(tǒng)毒性。

2 材料和方法

2.1 制備水凝膠

在37℃條件下，將20mg的化合物1和2.2當(dāng)量的Na2CO3溶解于1.0mLPBS緩沖溶液（pH=7.4）中，放置12h制得膠體。

2.2 分析制備水凝膠時的水解過程

在不同時點(diǎn)，取20mL上述濃度的溶液，加入200mL甲醇，然后取一定量清液進(jìn)行液質(zhì)色譜分析，通過液質(zhì)色譜的峰面積測定Taxol-SA-GSSG水解后的成分。

2.3 水凝膠體外釋放紫杉酚規(guī)律

0.25mL的凝膠（在37℃條件下，放置4天形成1.0wt%，1.5wt%，和2.0wt%的凝膠），分別用0.25mL新鮮的PBS緩沖溶液（pH7.4）進(jìn)行滴定。每隔一段時間，取出0.2mL上述溶液和對照溶液進(jìn)行LC-MS檢測，通過液質(zhì)光譜峰的面積來測定凝膠釋放紫杉酚的百分含量，每組進(jìn)行4次平行實(shí)驗(yàn)。

2.4 體內(nèi)藥物毒性

在小鼠右翼注射一定量的水凝膠，每隔一天計(jì)算一次小鼠的相對體重。計(jì)算公式：相對體重=體重/原體重*100%。

2.5 藥代動力學(xué)分析

在年齡、性別相當(dāng)?shù)男∈笥乙恚謩e注射50μL三種劑量的水凝膠（10、20、40mg/kg）PBS溶液，在指定時間內(nèi)抽取血樣，對照組經(jīng)過同樣的方法處理。在指定時間間隔內(nèi)，收集500μL血樣放入肝素化管中。離心10min后制得血漿樣品，通過液萃取，將紫杉酚從血漿中分離出來，測算藥物動力學(xué)參數(shù)。

2.6 體外評估抗腫瘤效果

EL-4細(xì)胞和4T1-熒光素酶細(xì)胞均在實(shí)驗(yàn)室保存。注射2×105EL-4細(xì)胞的小鼠作為淋巴瘤的動物模型；在乳房脂肪墊中注射2×1054T1-熒光素酶細(xì)胞的雌性小鼠，作為乳腺腫瘤的動物模型；每隔一天測算一次腫瘤的體重，通過公式來計(jì)算腫瘤體積：長×寬×（長+寬）/2。當(dāng)腫瘤體積達(dá)到500mm3時，將小鼠隨機(jī)分組，包括：（1）淋巴瘤動物模型：10mg/kg*2紫杉酚；乳腺腫瘤的動物模型：10mg/kg*4TaxolR；從0天起，在規(guī)定的時間內(nèi)，每隔一天注射一次TaxolR；（2）瘤內(nèi)注射50mL10mg/kg，20mg/kg和40mg/kg的水凝膠；（3）瘤內(nèi)注射PBS緩沖溶液作為對照組；給藥當(dāng)日記為0天。小鼠在接受治療后的體重，記作相對重量（%）。

3 結(jié)果與討論

3.1 分子設(shè)計(jì)與水凝膠形成過程

紫杉酚衍生物經(jīng)過酯鍵水解，釋放出紫杉酚分子，從而形成分子水凝膠。設(shè)計(jì)的化合物1Taxol-SA-GSSG具有以下優(yōu)勢：（1）丁二酸（SA）和氧化谷胱甘肽（GSSG），可用于活的有機(jī)體內(nèi)；（2）GSSG具有較強(qiáng)的親水性，可以提高化合物1的水溶性；（3）GSSG市場上有賣，使化合物1的合成簡單易行。因此可用作分子凝膠因子（紫杉酚）的前體。

在室溫（22～25℃）或37℃下，用磷酸鹽緩沖液（PBS，pH7.4），制備含有2.0wt%的化合物1溶液，用于測定凝膠性能。在室溫和37℃條件下，6小時后，觀察水凝膠的形成過程。LC-MS檢測結(jié)果顯示，在凝膠點(diǎn)、4天后和7天后，紫杉酚和SA分別自組裝形成57%，90%和95.4%的酯鍵。酯鍵的水解速度，主要依賴于溶液的pH值，pH值越高越容易，反之亦然。溶液的pH值不高于8.0，此外，紫杉酚上的酯鍵也可以被水解。水凝膠在室溫或在4℃時，可以穩(wěn)定存在，在PBS緩沖溶液（pH7.4）的水凝膠，在室溫下可保存3個月，酯鍵沒有發(fā)生任何水解?；衔?和PBS緩沖溶液水解過程的濃度范圍0.5～15.0wt%（低于0.5wt%一周后溶液澄清，化合物1在緩沖溶液中濃度為15wt%時最穩(wěn)定）。紫杉酚水凝膠只能通過水解過程形成，加熱-冷卻或借助有機(jī)溶劑都不能制得。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，紫杉酚可以通過水解過程形成水凝膠，在形成的水凝膠中紫杉酚濃度范圍較大。

3.2 血流計(jì)

采用血流計(jì)表征水凝膠的機(jī)械性能，測試水凝膠能否注射。血流計(jì)在含有2wt%化合物1的PBS溶液中靜止24h后，進(jìn)行動態(tài)頻率掃描。用注射器吸入凝膠，然后注入到小瓶中，5分鐘后，會再形成凝膠。結(jié)果顯示，形成的紫杉酚水凝膠可用于動物皮下組織注射。

3.3 納米纖維形態(tài)學(xué)

可以通過掃描電鏡（TEM）觀察到寬約25nm、長約幾個微米的納米纖維。這些納米纖維組成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，形成水凝膠。

3.4 體外釋放

在生理溫度37℃條件下，研究紫杉酚凝膠的體外釋放過程。將0.25mL的PBS緩沖溶液滴加到0.25mL含有不同濃度化合物1（原濃度=1.0，1.5和2.0wt%）的凝膠中。在預(yù)定時間點(diǎn)，取出適量溶液用于檢測凝膠中累計(jì)釋放紫杉酚的量，再加入0.25mL新鮮的PBS緩沖溶液。結(jié)果表明含有不同濃度的紫杉酚凝膠具有相似的釋放特性。在剛開始的8小時，均以每小時1.4mg的速度釋放，在隨后的16小時里，以每小時0.75mg的速度釋放。

3.5 最小致命劑量

單次注射紫杉酚的劑量不超過20mg/kg，會對小鼠造成嚴(yán)重毒性，小鼠恢復(fù)正常行動至少需要24小時。單次注射紫杉酚的劑量為40mg/kg時，對小鼠是致命的，因此臨床注射紫杉酚的致命劑量在20～40mg/kg之間。與紫杉酚相比，紫杉酚水凝膠在小鼠體內(nèi)毒性較低。盡管小鼠在皮下注射150mg/kg紫杉酚水凝膠后，最初的幾天里體重下降，但致命劑量高達(dá)300mg/kg，是紫杉酚的7.5倍。在皮下注射紫杉酚水凝膠的劑量高于40mg/kg之后，4～7天內(nèi)，會對小鼠的皮膚造成傷害，這是由于紫杉酚對所有細(xì)胞都有毒性。由此可知，高劑量紫杉酚水凝膠只能用于腫瘤內(nèi)注射，而不能用于皮下注射，因?yàn)樽仙挤铀z會對皮下細(xì)胞造成損傷，影響病人的身體健康。為了使紫杉酚水凝膠在皮下組織發(fā)揮作用，建議用量低于20mg/kg。

3.6 抗腫瘤效果

采用小鼠右側(cè)皮下組織的EL-4淋巴瘤動物模型和雌性小鼠4T1-熒光素酶乳腺腫瘤模型。研究紫杉酚水凝膠在體內(nèi)的抗腫瘤效果，當(dāng)乳腺腫瘤的體積達(dá)到435mm3時，向腫瘤中注射相同體積（50mL），不同劑量（10、20、40mg/kg紫杉酚）的水凝膠。結(jié)果顯示，紫杉酚水凝膠可以有效阻止乳腺腫瘤的生長，與相同劑量的紫杉酚相比，抗腫瘤效果更好。

3.7 抑制新陳代謝

直接將紫杉酚水凝膠注入腫瘤，可抑制乳腺癌的新陳代謝?？勺⑸湟欢繜晒馑孛缸鳛榛祝―-熒光素），對體內(nèi)癌細(xì)胞進(jìn)行定位。與對照組相比，注射紫杉酚水凝膠溶液（10，20和40mg/kg）的小鼠，沒有明顯的新陳代謝過程，說明腫瘤內(nèi)的癌細(xì)胞已經(jīng)被紫杉酚消滅。

3.8 對體重和血漿濃度的影響

為了研究紫杉酚水凝膠對不同腫瘤的效果，記錄小鼠的體重變化。結(jié)果表明采用水凝膠治療的小鼠體重沒有明顯降低，與對照組相比，注射水凝膠劑量低于80mg/kg的小鼠，都保持正常體重。采用體內(nèi)緩釋給藥時，小鼠血液中紫杉酚濃度較低，說明水凝膠具有較強(qiáng)的生物相容性，緩釋給藥可減小對正常組織的副作用。

4 結(jié)論

結(jié)果表明，制備的紫杉酚水凝膠，可用于阻止腫瘤生長和新陳代謝；GSSG、PEG等親水性化合物均可用作制備紫杉酚水凝膠的前體；紫杉酚水凝膠在血液中濃度低、抗腫瘤效果好；在化療和臨床應(yīng)用中都具有很大的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

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