姜煜郭東煒郭奕斌

綜 述

致死性侏儒癥Ⅰ型高發(fā)突變發(fā)生機制淺析

姜煜1郭東煒2郭奕斌1

致死性侏儒癥（thanatophoric dysplasia，TD）是重型短肢畸形病中相對常見的致死性遺傳性骨病，分為TD-I和TD-II 2型，它們都是由于FGFR3基因發(fā)生致死突變所致。TD-I型存在多種致病性突變，其中以c.742C〉T/p.R248C突變最為常見。本病為常染色體顯性遺傳（autosomal dominant，AD），雜合突變即可致死，但為何表型、基因型正常的父母會生出帶有p.R248C突變的患胎并且是純合突變的死胎？如果是新生突變，又為何會接連數(shù)胎生出同樣的患胎？p.R248C高發(fā)突變的機制是什么？本文重點圍繞這些問題，從“FGFR3（Fibroblast growth factor receptor 3）基因和FGFR3受體（Fibroblast growth factor receptor 3）的結構和功能，TD-I型p.R248C高發(fā)突變的發(fā)生機制，正常父母生出純合致死突變的可能機制”幾方面進行剖析，指出：①FGFR3基因及其受體蛋白結構和功能的特殊性是高發(fā)突變發(fā)生的物質(zhì)基礎；②位于IgⅡ和IgⅢ結構域連接區(qū)的氨基酸是極性很強的親水氨基酸，很容易與帶電離子結合而影響α螺旋結構，故易受外來理化因素的攻擊、誘變而發(fā)生改變；③正常父母生出純合致死突變，推測有兩種可能：一種是夫婦一方的生殖腺已帶有該高發(fā)突變，當胎兒從親代遺傳了一次突變后，只需在另一位點上再發(fā)生一次新生突變即可產(chǎn)生；另一種是夫婦雙方的生殖腺都是該突變的嵌合體，當兩者結合在一起，就有可能產(chǎn)生純合突變。此外，還對未來發(fā)展趨勢進行了展望。本文旨在探討c.742C〉T/p.R248C高發(fā)突變和純合突變發(fā)生的機制，進而為其今后的診斷和防治工作提供理論依據(jù)。

致死性侏儒癥I型（TD-I）；FGFR3基因；p.R248C；高發(fā)突變；發(fā)生機制

致死性侏儒癥（thanatophoric dysplasia，TD，MIM187600）又稱致死性骨發(fā)育不良，是新生兒致死性骨發(fā)育不良病中相對常見的一種，主要表現(xiàn)為肢體顯著短小，巨顱，前額隆凸，腦部畸形，脊柱異常，肋骨極短，胸廓極度狹窄，四肢外旋或外展，呈蛙式體態(tài)［1-4］，見圖1、圖2。本病為AD遺傳，新生兒發(fā)生率國內(nèi)報道約為1/40 000［3］，國外報道為1/20 000～1/50 000［5］?；继ザ喟胩ニ栏怪谢蛴诔錾蟛蛔?4 h即因重癥急性呼吸衰竭而夭折，但不同病例其病程進展會有差異［6-7］，但一年存活率幾乎為 0［8］。

圖1 TD-Ⅰ型Figure 1 TD typeⅠ［2］

圖2 TD-Ⅱ型［2］Figure 2 TD typeⅡ［2］

TD是由成纖維細胞生長因子受體3（Fibroblast growth factor receptor 3，F(xiàn)GFR3）基因發(fā)生不同突變所致，其中p.R248C錯義突變?yōu)門D-Ⅰ最高發(fā)的致死突變，而TD-Ⅱ型多由p.K650E錯義突變所引起。

TD-Ⅰ為AD遺傳，雜合突變即可致死，但臨床實踐中，我們發(fā)現(xiàn)不少表型、基因型正常的父母會生出TD-Ⅰ患胎特別是p.R248C突變的患胎，如近幾年，我們在10例TD-Ⅰ患胎中，就發(fā)現(xiàn)有6例是由p.R248C突變所致的死胎，其中純合突變占了一半（3例），比例相當高。為何表型、基因型正常的父母會生出p.R248C的患胎特別是純合突變的患胎？如果是新生突變，又為何會接二連三孕育出同樣的患胎？是什么原因?qū)е翭GFR3受體蛋白的第248位的精氨酸（R）如此容易受到攻擊？患胎的純合突變又來自哪里？本文重點圍繞這些問題，從“FGFR3基因和FGFR3受體的結構和功能，TD-Ⅰ型p.R248C高發(fā)突變的發(fā)生機制，正常父母生出純合致死突變的可能機制”幾方面進行剖析，以期為其今后的診斷和防治工作提供理論依據(jù)。

1 FGFR3基因和FGFR3受體的結構和功能

人FGFR3基因（OMIM：134934）定位于4p16.3，gDNA全長15 561 bp，有18個外顯子和17個內(nèi)含子。其中，第1外顯子的全部和第2外顯子的前半部分均不參與編碼蛋白質(zhì)，F(xiàn)GFR3跨膜區(qū)由第9外顯子編碼。FGFR3基因的序列在不同物種之間具有高度同源性。其開放閱讀框（open reading frame，ORF）長13 328 bp，cDNA 2 421 bp，編碼806個氨基酸（from RefSeq NM_000142），分子量為110 kDa～135 kDa。分子量的不同可能與其mRNA的剪接方式有關，功能上有重要意義的剪接主要發(fā)生在IgⅢ（圖3）。作為發(fā)育調(diào)節(jié)跨膜受體之一的FGFR3，它能通過誘導骨成型蛋白質(zhì)（bone morphogenetic protein，BMP）Ⅰ型受體的降解來調(diào)控骨骼的發(fā)育［9］。FGFR3屬于免疫球蛋白樣受體酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinases，RTKs）家族，該家族還包括 FGFR 1、2、4。成纖維細胞生長因子（fibroblast-growth factors，F(xiàn)GFs）的靶細胞的表面廣泛分布這些跨膜受體，并且能夠介導FGFs的生物學活性。同族的跨膜受體的結構相似，均為跨膜受體［10-11］。FGFR3受體蛋白由胞內(nèi)區(qū)、跨膜區(qū)和胞外區(qū)3部分組成，其中胞外區(qū)包含3個免疫球蛋白樣功能域（IgⅠ，IgⅡ和IgⅢ）和一個肝素結合功能域（heparin-binding domain），IgⅠ和IgⅡ之間有一酸性區(qū)（acidic region，A）［12］。FGFRs只跨膜一次。膜內(nèi)部分由一個內(nèi)在激酶功能域（interkinase domain）、2個保守的酪氨酸激酶功能域（TK1，TK2）、近膜區(qū)和可發(fā)生自身磷酸化的C末端構成。FGFR3由18個外顯子編碼，7、8、9號外顯子編碼IgⅢ，其中7、8號外顯子編碼IgⅢb，7、9號外顯子編碼IgⅢc，多種FGFs可與之結合。FGFs是肝素結合生長因子（heparin binding growth factor，HBGF）家族的一員，在硫酸乙酰肝素蛋白多糖（heparan sulfate proteoglycans，HSPGs）協(xié)同下FGFs與受體（FGFRs）的IgⅡ及IgⅢ區(qū)結合之后，受體自身的酪氨酸殘基磷酸化，受體二聚化而活化，酪氨酸殘基磷酸化后和SH2信號分子相互結合，導致胞漿內(nèi)的SH2結構域蛋白與含絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（MAPK，MAPKK和MAPKKK）產(chǎn)生磷酸化，從而激活核內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子（signal transdusor and activator of transcription，STAT）和調(diào)控信號向細胞內(nèi)傳導［13-14］，通過 PLC-γ 、Ras-MAPK、PI3K等途徑傳遞信號［15］。FGFRs家族有多個成員，它們均參與調(diào)控長骨的生長，包括軟骨基質(zhì)的鈣化，血管的入侵，軟骨細胞的增生和成骨的形成等多個階段［16］。最近，研究人員采用定量成像福斯特共振能量轉(zhuǎn)移（quantitative imaging f?rster resonance energy transfer，QI-FRET）法對衍生自囊泡的血漿膜（plasma membrane）的膜蛋白的相互作用特性進行深入研究，發(fā)現(xiàn)RTKs在骨骼發(fā)育過程中起著極為重要的作用，從而影響了FGFR3的二聚化［17］。突變引起的FGFR3激活程度會極大影響軟骨疾病表型的嚴重程度，其中引起TD的突變的激活程度最強。TD-Ⅰ型患者已發(fā)現(xiàn)12種不同突變（見HGMD數(shù)據(jù)庫，http：//www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php），都會導致突變后的FGFR3功能持續(xù)地激活，導致FGFR3對骨骼生長的負向調(diào)節(jié)作用劇增，進而會導致患者骨骼生長發(fā)育的障礙。圖3為已知人FGFR3突變分布及受體結構的圖。

2 TD-Ⅰ型p.R248C高發(fā)突變的發(fā)生機制

臨床上發(fā)現(xiàn)好多基因型和表型均正常的父母卻生出了帶有p.R248C突變的患胎。是什么原因?qū)е翭GFR3基因發(fā)生該致死突變？為何第248位的精氨酸（R）如此容易受到攻擊？

雖然目前發(fā)現(xiàn)有12種突變（多數(shù)為單個氨基酸突變成Cys）都可以引起TD-Ⅰ，比如集中在FGFR3蛋白胞外區(qū)IgⅡ和IgⅢ結合域連接區(qū)的第248位精氨酸（R）、第249位絲氨酸（S），近膜區(qū)的第370位甘氨酸（G）、371位絲氨酸（S）、373位酪氨酸（Y）都是被半胱氨酸（C）取代即R248C、S249C、G370C、S371C、Y373C，此外，還有 K650M以及終止密碼子（TGA）發(fā)生的突變（X807R、X807C、X807G、X807L、X807S、X807W，突變使羧基端延長141個氨基酸）均可導致TD-Ⅰ型的發(fā)生［19］。但最常見的仍是發(fā)生在第248位的p.R248C錯義突變，已報道的由此突變引起的TD-Ⅰ病例已超過100例，約占所有突變的55%［20］。

圖3 人FGFR3受體結構及已知突變的分布［12，18］Figure 3 The structure of human FGRG3 receptor and the distribution of known mutations［12，18］

從FGFR3的分子結構可知跨膜區(qū)（E9）為保守的疏水性區(qū)段（AGSVYAGILSYGVGFFLFILVVAAVTLC），2個酪氨酸激酶活性區(qū)位于細胞的內(nèi)段（即胞內(nèi)區(qū)）。此兩者之間有一插入序列（GPLYVLVEYAAKGNLRE）將其分開，是FGFR3受體的高度保守部分［21］。當配體和胞外區(qū)結合后，受體就會形成同源或異源的二聚體（dimer）［5］，導致酪氨酸激酶在細胞內(nèi)段的活化，催化細胞的酪氨酸殘基發(fā)生磷酸化，也致使酪氨酸殘基在受體靶蛋白上磷酸化，使得級聯(lián)反應在細胞內(nèi)發(fā)生，使DNA最終合成導致細胞分裂［22］。

在小鼠模型研究中，加入酪氨酸激酶抑制劑可改善與FGFR3受體相關的侏儒癥的癥狀［23］。高度疏水的跨膜區(qū)被該跨膜區(qū)的突變氨基酸所影響，在缺乏FGFs配體（ligand）時，此突變導致一個α螺旋形成，可以激活受體（receptor）。功能獲得性FGFR3基因突變常導致骨骼發(fā)育不良類的疾病，增高了受體酪氨酸磷酸化的水平，導致了非配體（unligand）的依賴性及組成性的激活（constitutive activation）。由于FGFR3基因突變的類型和位置不同，所以產(chǎn)生異常的氫鍵、二硫鍵，使FGFR3單體異常聚合成二聚體，或者激酶區(qū)構象改變形成激活環(huán)，這些可能都是受體激活的原因［24］。位于IgⅡ和IgⅢ結構域的連接區(qū)，前后幾個氨基酸（E，R，P，H，R，P）都是極性很強的親水氨基酸或亞氨基酸，很容易與帶電離子結合而影響原來的α螺旋結構，故易受外來理化因素（電離射線和多種多樣的化學藥物）的攻擊而發(fā)生改變。一旦突變成Cys，就有可能形成二硫鍵，從而導致IgⅡ和IgⅢ結構的改變，致使穩(wěn)定性較跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)（羧基端側(cè)）差。

研究發(fā)現(xiàn)，TD-Ⅰ的FGFR3基因的c.742C〉T/p.R248C突變可以引起c-fos基因（為一種即刻早期基因，其表達產(chǎn)物Fos蛋白與靶基因的特異序列結合，調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄水平發(fā)揮信使作用）的轉(zhuǎn)錄活性比野生型增加4倍［25］。而對照組p.R248A突變體與野生型則無明顯差別。c-fos基因高度保守，是編碼核蛋白的基因，F(xiàn)os內(nèi)磷酸化蛋白是c-fos基因的表達產(chǎn)物，此產(chǎn)物的結構特點：DNA結合區(qū)域由堿性氨基酸構成。附近的亮氨酸殘基是由7個氨基酸組成的，亦稱之為亮氨酸拉鏈（LZ），它與另一端的并列的亮氨酸形成第一個α螺旋，含有該結構的其他蛋白和亮氨酸殘基并列形成二聚體，然后與靶基因的堿性激活因子-1（AP-1）結合，調(diào)節(jié)靶基因的表達［17］。

研究還發(fā)現(xiàn)p.R248C突變的FGFR3嵌合受體可以引起NIH3T3細胞（小鼠胚胎成纖維細胞，是疏松結締組織的主要細胞成分）的轉(zhuǎn)化，而NIH3T3細胞的轉(zhuǎn)化不受p.R248A突變的嵌合受體影響，可以說明功能獲得性方式引起TD-Ⅰ型。引入Cys可以導致通過二硫鍵在受體之間形成二聚體，影響此區(qū)域的α螺旋結構，導致受體非配體依賴性的組成性活化［23］。當孕婦在孕期由于患病而用藥時或在孕早期接觸了一些電離射線，由于帶電離子容易與p.248的精氨酸（R）等極性氨基酸結合而發(fā)生突變，故當接觸或服用了含有帶電離子的藥物等理化誘變因子時就容易導致p.248位的R的基團發(fā)生改變而引起致死突變，這一點與同是AD遺傳的成骨不全癥I型（或Ⅱ型）的COL1A1/COL1A2基因的突變機制類似［26］。這也許可以部分解釋為何表型和基因型正常的父母會生出帶有p.R248C新生致死突變的患胎。

3 正常父母生出純合致死突變的可能機制

如果只引起一個位點（特別是突變熱點）的新生突變，并不難理解。令人費解的是基因型（來自外周血組織）和表型均正常的父母為何會那么湊巧在同一位點發(fā)生相同突變而生出純合突變的患胎？Takagi等［27］2012年報道：一些非典型軟骨發(fā)育不全（achondroplasia，ACH）癥狀的患兒存在著p.R248C突變的體細胞嵌合體。因此，我們推測生出純合突變的患胎有2種可能：一種是夫婦一方的生殖腺（如父親的精巢或母親的卵巢）已經(jīng)帶有該高發(fā)突變，當胎兒從父或母遺傳了一次突變后，只需在另一個高發(fā)等位基因位點上再發(fā)生一次新生突變即可產(chǎn)生純合突變（類似于腫瘤發(fā)生的二次突變學說）；另一種情況可能是夫婦雙方的生殖腺（精巢和卵巢）都是該突變的嵌合體，因此都有可能產(chǎn)生帶有這一突變的生殖細胞（精子和卵子）。當兩者結合在一起，就有可能產(chǎn)生純合突變。在這種情況下，正常的父母連續(xù)數(shù)胎生出TD-Ⅰ患胎就不難理解了。這種情況與成骨不全患胎的父母的生殖腺存在COL1A1/COL1A2突變嵌合體類似。對于成骨不全Ⅱ型（胎兒致死型）來說，一般是見不到家族史的，因此再次生育成骨不全型Ⅱ型（osteogenesis imperfecta typeⅡ,OI-Ⅱ）型患胎的可能性很小。但有文獻報道，有些家系卻多次孕育致死的OI-Ⅱ型患胎，經(jīng)研究，原來是與夫婦的生殖腺存在突變嵌合體有關［28］。

此外，正常表型的父母產(chǎn)生的TD-Ⅰ型患胎可能與父親的年齡及精液中存在突變的嵌合體的關系更為密切。據(jù)文獻報道，大多數(shù)AD遺傳的新突變基因都發(fā)生在父親的等位基因［29］，這可能是由于隨著父親年齡增長，精子細胞的不斷產(chǎn)生，其發(fā)生突變的機會也在不斷增加。有研究表明突變是通過異常的侵襲過程完成的［18-19，30-31］。當然也不能排除患胎的突變是來自高齡母親的嵌合體卵巢。

4 展望

致死性侏儒癥胎兒多自發(fā)流產(chǎn)或人工引產(chǎn)［32］，少數(shù)出生的患胎也多于出生后24 h內(nèi)死亡。雖然有個別TD-Ⅰ型病例（帶有p.R248C突變）可以存活下來，癥狀有點類似于ACH，但研究表明該病例的體細胞存在著嵌合體，而且正常細胞的比例比較大［27］。該病至今仍無行之有效的根治療法，但 Yamashita等［33］2014 年報道，他們用“他汀類”（statin）治療劑在TD-Ⅰ的軟骨分化和ACH多能干細胞（induced pluripotent stem cell，iPSCs）的誘導過程中能矯正初級軟骨（degraded cartilage）的形成。用“他汀類”治療的ACH老鼠模型能明顯促進骨的生長的恢復。這些結果提示，“他汀類”能代替TD-Ⅰ和ACH嬰幼患兒的醫(yī)學治療［33］。但這些研究仍只停留在動物模型階段，因此目前應對該病的最好方法就是預防突變的發(fā)生以及對高危妊娠進行產(chǎn)前診斷以防止患兒出生，或采取胚胎植入前遺傳學診斷（preimplantation genetic diagnosis，PGD）的手段預防患胎的孕育。而揭示TD的發(fā)病機制尤其是高發(fā)突變的發(fā)生機制將有助于進行有效的防患。

然而，對于TD-Ⅰ型p.R248C高發(fā)突變的機制至今仍未被完全闡明。對于正常父母接連生出患胎的可能原因——源自生殖腺嵌合體，目前也只是處于理論推測階段。因此科研人員今后可朝這方面進行深入研究以獲得更有說服力的實驗證據(jù)。

而要徹底揭示其發(fā)生機制，還有必要對患胎父母的多種組織進行深入研究以及對他們進行詳細隨訪，了解其家族史及孕前、孕期的生活、工作環(huán)境和生活習慣等，或許患胎的自發(fā)突變并非遺傳自父母的一方或雙方，而是由于后天接觸某類化學或生物或物理因素而誘發(fā)生殖細胞發(fā)生基因突變，關于這一點，前面已有闡述，但理、化、生誘變因素具體是哪些？它們的原子、電子結構如何？誘變機制又是怎樣？動物模型又該如何建立？則有待科研人員今后花費大量的精力、人力和財力去探究。

另外，隨著各種罕見病例的增多和研究的不斷深入，已經(jīng)逐步闡明同是FGFR3基因突變引起的骨骼發(fā)育異常病，只要突變部位、突變類型以及作用于FGFR3受體蛋白的結構域存在不同，就可導致患者（或患胎）的臨床表型存在很大差異，從生長發(fā)育、身高體重、智力水平、壽命基本正常如季肋發(fā)育不全（Hypochondroplasia，HCH）到個頭矮小、骨骼畸形、O型腿、頭顱異常、壽命較短如軟骨發(fā)育不全（ACH），再到胎死腹中或產(chǎn)下即死如致死性侏儒癥（TD-Ⅰ或TD-Ⅱ）。此外，還闡明即使帶有相同突變，只要突變等位基因的雜合或純合狀態(tài)不同，或患者體細胞或生殖腺細胞有無存在嵌合體，也會產(chǎn)生差別明顯的臨床癥狀，比如雜合的p.G380R突變僅僅引起ACH，但純合的p.G380R突變卻會導致胎兒圍產(chǎn)期死亡或產(chǎn)后不久即夭折，類似于TD病；而體細胞存在p.R248C雜合致死突變的嵌合體患者，卻能像ACH患者一樣正常存活，甚至生兒育女。可見FGFR3基因的突變存在著明顯的劑量效應。那么，多大劑量、多大比例的p.G380R突變才會導致類似于TD的癥狀出現(xiàn)？又是多大劑量、多大比例的p.R248C突變才會表現(xiàn)類似ACH呢？這些發(fā)生機制都有待于今后采用更先進、更精確的技術以及聯(lián)合采用各種組學的方法進行深入的研究。

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Analysis of the mechanism of high incidence of thanatophoric dysplasia type I

JIANG Yu1，GUO Dongwei2，GUO Yibin1
（1.Department of Medical Genetics，Zhongshan School of Medicine，SUN Yat-sen University，Guangzhou，Guangdong，China，510080；2.Clinical Medicine，Medical College，Xiamen University，Xiamen，F(xiàn)ujian，China 361102）

Thanatophoric dysplasia(TD),divided into TD type I and TD type II,is a genetic bone disease caused by the fatal mutation of FGFR3 gene.It is relatively common lethal hereditary osteopathy among severe short limb malformations.TD-I type has many kinds of pathogenic mutations,of which c.742C〉T/p.R248C mutation is the most common.This disease is an autosomal dominant(AD)genetic disease which means heterozygous mutations can be lethal.However,why some parents with normal genotypes and phenotypes can give birth to a stillbirth who carried the homozygous mutation p.R248C?If it is a novel mutation,why the successive fetuses with the same mutation were born?What is the high incidence mechanism of p.R248C mutation?This paper focus mainly around these problems,from“The structure and function of FGFR3 gene and FGFR3 receptor;The pathogenetic mechanism of high incidence of p.R248C in TD type I;The possible mechanisms of normal parents producing homozygous lethal mutation”,several aspects are analyzed and pointed out:①FGFR3 gene and the structure and function of its receptor protein is the material base of high frequentmutation;②Some amino acids,located in the connected region of IgⅡand IgⅢdomain,are strong polar hydrophilic amino acids,which tend to bind charged ions to influence the alpha helical structure,therefore,it is easy to be affected by external physical and chemical factors;③Normal parents give birth to fetus with homozygous lethal mutation,there are 2 possibilities:one is the reproductive gonad of one of the parents has carried the hot mutation,and the fetus inherited the hot mutation,under these circumstances,as long as a same mutation happen in its allele,which will lead to the generation of homozygous mutation;another is the reproductive glands of couples are the mutant chimeras,when the two are combined together,it is possible to generate homozygous mutation.In addition,the future development trend is prospected.The purpose of this paper is to explore the high-risk mutation and homozygous mutation mechanism of c.742C〉T/p.R248C,and to provide theoretical basis for the diagnosis and prevention and control work in future.

Thanatophoric dysplasia type I(TD-I);FGFR3 gene;p.R248C;High mutation;Pathogenetic mechanism

閩粵合作科研基金（71010025）

1.中山大學中山醫(yī)學院醫(yī)學遺傳室，廣東，廣州510080

2.廈門大學醫(yī)學院臨床醫(yī)學專業(yè)，福建，廈門361102

郭奕斌，E-mail:aguoabin@qq.com