孔杰++李小義+王艷艷+曾圣+周洲

摘要：為研究鱘魚體內(nèi)微生物多樣性，從貴州省水產(chǎn)研究所惠水鱘魚繁育基地采集鱘魚進(jìn)行微生物的分離培養(yǎng)，從肝臟中分離純化獲得1株優(yōu)勢菌株，命名為菌株Liver 5。經(jīng)生理生化試驗(yàn)、菌體形態(tài)觀察及16S rRNA序列分析，初步鑒定該菌為金黃桿菌（Chryseobacterium sp.）。人工感染試驗(yàn)表明，菌株Liver 5未引起鱘魚發(fā)病死亡現(xiàn)象。藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，菌株Liver 5對左氧氟沙星敏感，對新霉素、紅霉素中度敏感，對氯霉素、青霉素-G、鏈霉素及頭孢唑啉等21種抗生素均耐受。本研究結(jié)果對金黃桿菌引起的細(xì)菌性疾病用藥治療具有重要意義。

關(guān)鍵詞：金黃桿菌；抗生素；生理生化；病原菌

中圖分類號： S941.42文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）10-0129-04

金黃桿菌屬為革蘭氏陰性、無鞭毛、嚴(yán)格好氧生長的一類菌屬，廣泛分布于水體和土壤中。腦膜膿毒金黃桿菌（Chryseobacterium meningosepticum）、產(chǎn)吲哚金黃桿菌（Chryseobacterium indologenes）及黏金黃桿菌（Chryseobacterium gleum）等是引起人體發(fā)病的常見條件致病菌，可引起新生兒腦膜炎、敗血癥及呼吸道感染等疾病的發(fā)生[1]。部分金黃桿菌株還會(huì)造成魚蟹和畜禽等養(yǎng)殖動(dòng)物體感染發(fā)病[2-4]。但Krause在研究金黃桿菌對蘿卜生長影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，黏金黃桿菌對蘿卜抵抗病原菌具有積極作用[5]。Ramos在擬南芥植物根際細(xì)菌對植物抗病效果研究中發(fā)現(xiàn)菌株Chryseobacterium balustinum AUR9能顯著減少植株疾病發(fā)生[6]。近年來，金黃桿菌的產(chǎn)蛋白酶、抗氧化劑及生物防治劑等功效相繼有所報(bào)道。王繼元從無指盤臭蛙皮膚表面分離到1株產(chǎn)蛋白酶的金黃桿菌CW-E2T，并對其產(chǎn)胞外蛋白酶的特性進(jìn)行了初步研究[7]。Kim等在研究金黃桿菌對植物病原菌拮抗機(jī)理中發(fā)現(xiàn)菌株Chryseobacterium wanjuense KJ9C8可通過產(chǎn)蛋白酶和HCN等物質(zhì)對胡椒根際細(xì)菌菌群產(chǎn)生影響[8]。

鱘魚為高蛋白、高脂肪性魚類，是優(yōu)良的淡水魚品種，也是現(xiàn)存于世界上的最珍奇和最古老的冷水性生物魚群之一，其肉厚骨軟，同時(shí)鱘魚卵可以加工成鱘魚籽醬，具有“黑色黃金”之稱。魚體含有多種人體必需的氨基酸，具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和藥用價(jià)值。目前，對鱘魚體內(nèi)微生物多樣性研究較少。本研究從貴州省水產(chǎn)研究所惠水鱘魚繁育基地采集鱘魚樣品，對其體內(nèi)微生物進(jìn)行了分離鑒定。旨在為了解鱘魚微生物多樣性、篩選有益微生物及細(xì)菌性疾病治療提供參考。

1材料與方法

1.1主要試劑

按常規(guī)方法自配LB（Luria-Bertani）固體培養(yǎng)基和水解酪蛋白瓊脂（MH）培養(yǎng)基；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、Taq DNApolymerase、dNTP等，購自TaKaRa公司；藥敏試紙片、細(xì)菌生化微量鑒定管，購自杭州濱和微生物試劑有限公司。

1.2樣品采集與菌株分離

2014年7月于貴州省水產(chǎn)研究所惠水鱘魚繁育基地采集鱘魚；無菌條件下取鱘魚肝臟，將肝臟組織在無菌生理鹽水中研磨均勻，適當(dāng)稀釋后涂布在LB固體培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)24 h，從中選取優(yōu)勢菌落進(jìn)行純化，直至獲得純培養(yǎng)物。

回歸感染用的健康施氏鱘魚也來自該基地，健康施氏鱘魚放水族箱中暫養(yǎng)7 d，無異常后進(jìn)行試驗(yàn)。

1.3菌株鑒定

菌株Liver 5生理生化反應(yīng)鑒定方法參照文獻(xiàn)[9]。

16S rRNA基因測序及系統(tǒng)發(fā)育分析：用細(xì)菌基因組DNA試劑盒提取單菌基因組DNA，擴(kuò)增16S rRNA基因。16S rRNA基因正向擴(kuò)增引物（位于E.coli 16S rRNA基因的第 8～27 個(gè)堿基位置）：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；反向擴(kuò)增引物（位于E.coli 16S rRNA基因的第1 512～1 493個(gè)堿基位置）：5′-ACGGCTACCTTGTTACGACT-3′[10]。PCR擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性5.0 min；94 ℃變性1.0 min，55 ℃復(fù)性1.0 min，72 ℃延伸1.5 min，30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃，溫育 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳確定條帶后交由生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行序列測定。

1.4鱘魚人工感染試驗(yàn)

選取健康的鱘魚進(jìn)行人工注射感染試驗(yàn)。菌株Liver 5過夜培養(yǎng)，取對數(shù)期菌液，離心收集菌體，用無菌PBS溶液洗滌2～3次，制備成菌懸液。腹腔注射菌濃度為9×108 CFU/mL，同時(shí)設(shè)置注射PBS液體的為對照組。取30尾體長為10～12 cm的鱘魚，每尾注射100 μL菌懸液。室溫下養(yǎng)殖連續(xù)養(yǎng)殖11 d，試驗(yàn)期間持續(xù)充氧。每天觀察記錄各組鱘魚死亡情況。

1.5菌株Liver 5藥敏試驗(yàn)

抗生素敏感試驗(yàn)采用紙片法。將菌懸液均勻涂布在LB固體培養(yǎng)基表面，貼上抗生素試紙，28 ℃培養(yǎng)24 h，檢測記錄形成的敏感圈大小，以此判斷待測菌株對各種抗生素的敏感程度。試驗(yàn)抗生素包括：頭孢噻肟、卡那霉素、羧芐青霉素、四環(huán)素、多黏菌素B、強(qiáng)力霉素、環(huán)丙沙星、阿莫西林、麥迪霉素、鏈霉素、頭孢唑啉、頭孢曲松、新生霉素、阿米卡星、克林霉素、左氧氟沙星、慶大霉素、青霉素G、阿奇霉素、呋喃唑酮、妥布霉素、氨芐西林、新霉素、紅霉素、氯霉素。

2結(jié)果與分析

從貴州省水產(chǎn)研究所惠水鱘魚繁育基地采集鱘魚樣品，取其肝臟組織進(jìn)行富集、分離和篩選，獲得1株優(yōu)勢菌株，命名為菌株Liver 5。以下試驗(yàn)均以菌株Liver 5為試驗(yàn)材料。

2.1菌株Liver 5的生理生化鑒定

對菌株Liver 5生理生化的各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行檢測。由表1可知，在LB培養(yǎng)基上生長24 h菌株Liver 5菌落形態(tài)為圓形，邊緣整齊，中間微隆，表面光滑且有光澤、金黃色，不透明。革蘭氏染色觀察顯示，菌株Liver 5為革蘭氏陰性菌，短桿狀。氧化酶、接觸酶呈陽性，能水解利用淀粉、木糖、葡萄糖、賴氨酸、鳥氨酸、苯丙氨酸等，但不能利用纖維素、棉籽山梨醇及尿素等。

2.2菌株Liver 5系統(tǒng)進(jìn)化分析

提取菌株Liver 5總DNA，經(jīng)16S rRNA基因序列擴(kuò)增測序得到1 167 bp片段的DNA序列，將所得序列在EZTaxon上進(jìn)行序列比對，結(jié)果顯示菌株Liver 5與Chryseobacterium oncorhynchi 701B-08T相似性最高，為98.89%，其次為Chryseobacterium viscerum 687B-08T（98.32%）、Chryseobacterium artocarpi UTM-3T（97.79%）、Chryseobacterium jejuense JS17-8T（97.73%）等。結(jié)合其生理生化特性，初步鑒定其為金黃桿菌（Chryseobacterium sp.）。采用MEGA 6.0分析軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖1）。

2.3鱘魚人工感染試驗(yàn)

選取健康的鱘魚，檢驗(yàn)菌株Liver 5對其的致病性。腹腔注射感染11 d，鱘魚無發(fā)病或死亡現(xiàn)象，表明菌株Liver 5對鱘魚無致病性。

2.4抗生素敏感性試驗(yàn)

通過紙片法檢測了菌株Liver 5對24種抗生素的敏感性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌株Liver 5對左氧氟沙星敏感，對新霉素、紅霉素[CM（25]中度敏感，對氯霉素、青霉素-G、鏈霉素及頭孢唑啉等種抗生素均耐受（表2）。

3討論

目前，對金黃桿菌屬的研究多集中于其致病性方面。王世瑜等對分離獲得的172株產(chǎn)吲哚金黃桿菌抗藥性及臨床分布進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)該菌表現(xiàn)出了多重耐藥性，且以呼吸道感染為主[15]。何樹光對216株金黃桿菌屬耐藥性分析結(jié)果表明，頭孢哌酮/舒巴坦對治療金黃桿菌屬細(xì)菌引起的感染具有較好效果[16]。此外，金黃桿菌在其他動(dòng)植物的分布及致病性也有較多的研究。養(yǎng)殖歐洲鰻鱺鰓部金黃桿菌屬所占比例較高，為28.3%[17]。胡文舉等從產(chǎn)后1、8、15、22 d牛的子宮中均分離得到產(chǎn)吲哚金黃桿菌，其中產(chǎn)后1 d產(chǎn)吲哚金黃桿菌所占比例較高，為14.29%，僅次于藤黃微球菌所占比列（15.71%）[2]。棘胸蛙歪頭病死亡率高，其典型癥狀為歪頭，李明等對浙江麗水發(fā)病棘胸蛙致病菌進(jìn)行分離鑒定，發(fā)現(xiàn)腦膜炎敗血金黃桿菌（Chryseobacterium meningosepticum）是引起該病發(fā)生的致病菌，人工感染試驗(yàn)4 d致死率達(dá)到100%，表明該菌株對棘胸蛙具有較強(qiáng)的致病性[18]。2014年重慶地區(qū)部分棘胸蛙養(yǎng)殖場出現(xiàn)棘胸蛙出血死亡的病例，吳寶紅等經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)致病菌為金黃桿菌[19]。通過生理生化鑒定及16S rRNA序列分析，初步鑒定菌株Liver 5為金黃桿菌（Chryseobacterium sp.）。鑒于金黃桿菌引起的養(yǎng)殖動(dòng)物疾病時(shí)有發(fā)生，本研究對分離獲得的金黃桿菌Liver 5進(jìn)行了鱘魚人工感染研究。人工注射感染試驗(yàn)表明，菌株Liver 5對鱘魚無致病性。

隨著鱘魚養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，集約化養(yǎng)殖規(guī)模擴(kuò)大，各種疾病不斷出現(xiàn)，消毒劑和抗生素等傳統(tǒng)的疾病防治方法不能有效地預(yù)防疾病發(fā)生，同時(shí)隨著耐藥菌株及抗生素對人體危害等問題的發(fā)生，多個(gè)國家對抗生素藥物作為飼料添加劑均有限制，抗生素的應(yīng)用也越來越受到重視。因此，在細(xì)菌性疾病暴發(fā)時(shí)，選擇針對性強(qiáng)的抗生素適量使用可以達(dá)到控制疾病進(jìn)一步暴發(fā)并減少抗生素濫用的目的。研究表明，金黃桿菌對頭孢菌素類、氨基糖苷類、碳青霉烯類等抗生素耐受性較強(qiáng)[20]。本試驗(yàn)選擇24種抗生素對菌株Liver 5的敏感性進(jìn)行研究，[JP3]結(jié)果表明菌株Liver 5對左氧氟沙星敏感，對新霉素、紅霉素中度敏感，可為金黃桿菌致病菌引發(fā)疾病用藥選擇提供參考。

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