抗豪豬大腸桿菌卵黃抗體的制備

張保平 李娜 高惠林 王前光 任國冀 童學(xué)勤

摘要：采用甲醛滅活的仔豪豬腹瀉大腸桿菌為抗原，免疫健康140日齡桃源蛋雞，刺激機(jī)體反應(yīng)生成血清抗體和卵黃抗體，并采用平板凝集試驗檢測抗體效價，研究獲得含有高效價血清和高免蛋的最佳條件。結(jié)果表明，雙翼下靜脈注射1012 CFU/mL大腸桿菌懸浮液的最佳免疫劑量為1 mL/次。在大腸桿菌懸液中添加等量的完全福氏佐劑對免疫應(yīng)答加強(qiáng)的程度最高。強(qiáng)化免疫程序能大大加強(qiáng)產(chǎn)蛋母雞的免疫應(yīng)答強(qiáng)度，其中初免后，每周強(qiáng)化免疫1次，連續(xù)4次，效果最好。無菌檢測及動物安全性試驗表明，制備的卵黃抗體安全可靠。制備的卵黃抗體效價和血清抗體效價變化幅度小、穩(wěn)定性好、持續(xù)時間久，為臨床上防治仔豪豬腹瀉大腸桿菌病提供了新的手段。

關(guān)鍵詞：大腸桿菌；豪豬；蛋雞；血清抗體；卵黃抗體；免疫應(yīng)答強(qiáng)度；制備

中圖分類號： S858.285.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）10-0133-03

豪豬（porcupines）別稱箭豬、刺豬，在動物分類學(xué)上屬于哺乳綱嚙齒目豪豬科[1-3]，是一種經(jīng)濟(jì)價值很高的珍稀動物，具有食用價值、藥用價值和觀賞價值[4-5]。豪豬的抗病能力很強(qiáng)，很少發(fā)生疾病，仔豪豬腹瀉是引起豪豬死亡的主要病因。雞卵黃抗體（IgY）是蛋雞受免疫刺激后，雞體內(nèi)產(chǎn)生免疫應(yīng)答，血液中免疫球蛋白G（IgG）被選擇性地轉(zhuǎn)移到卵黃中唯一的免疫球蛋白類[6]。與哺乳動物的IgG相比，雞蛋的IgY具有取材方便、提取方法比較簡單、產(chǎn)量高、穩(wěn)定性較好等優(yōu)點，可作為口服劑或飼料添加劑用于預(yù)防和治療動物早期的消化道疾病[7]。我國豪豬的養(yǎng)殖尚處于起步階段，對豪豬的研究主要在繁殖、營養(yǎng)和生理等方面[8-10]，有關(guān)豪豬疾病防治的研究報道較少。本研究以仔豪豬腹瀉大腸桿菌為抗原，獲得含有高效價卵黃抗體的免疫雞蛋的最佳條件，為大量制備特異性卵黃抗體防治仔豪豬大腸桿菌腹瀉病提供重要依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗動物

純種桃源蛋雞140日齡，購自湖南省桃源縣良種場。試驗期間試驗雞日常管理與衛(wèi)生防疫按常規(guī)進(jìn)行。

1.1.2試驗菌株

仔豪豬腹瀉大腸桿菌（Escherichia coli）菌株，由常德職業(yè)技術(shù)學(xué)院農(nóng)林工程系微生物實驗室自行分離鑒定并傳代培養(yǎng)得到[11]。

1.1.3主要試劑

牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉、瓊脂、氫氧化鈉、磷酸二氫鈉、甲醛、三氯甲烷、硫酸銨（分析純）等，購自浙江省杭州微生物試劑有限公司；弗氏佐劑，購自北京鼎國昌盛生物有限責(zé)任公司；10號白油（食品級）、司班-80、硬脂酸鋁、磷酸氫鈉（分析純）等，購自上?；瘜W(xué)試劑總廠；卡拉膠、低甲氧基果膠和氯化鈣，購自天津市福辰化學(xué)試劑廠。

1.1.4主要儀器

立式高壓蒸汽滅菌鍋，購自上海東亞壓力容器制造公司；生化培養(yǎng)箱、干燥箱，購自上海一恒科學(xué)儀器有限公司；電子天平，購自北京賽多利斯儀器有限公司；超凈臺，購自中國上海浦東物理光學(xué)儀器廠；醫(yī)用血球計數(shù)板，購自江蘇醫(yī)用電子儀器公司；注射器，購自四川省成都市雙流雙陸醫(yī)療器械公司；冰箱，購自海爾有限公司。

1.2方法

1.2.1培養(yǎng)基與免疫佐劑配制方法

（1）牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。按常規(guī)方法[12]制備，高壓滅菌，置于4 ℃冰箱中保存，備用。（2）白油佐劑。取96 mL 的10號白油放入燒杯中，文火加熱，當(dāng)溫度達(dá)160 ℃以上時，邊攪拌邊加入56 ℃水浴中預(yù)熱30 min的司班-80 2 mL和硬脂酸鋁 4 g，當(dāng)后者完全溶解，混合液呈透明膠凍狀時，小量分裝，高壓滅菌后4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2抗原制備

將仔豪豬腹瀉大腸桿菌接種于牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h，用無菌0.01 mol/L磷酸緩沖液（PBS，pH值7.2），小心沖洗菌苔，調(diào)成濃度為 1012 CFU/mL 菌液，再加甲醛溶液至終濃度為0.4%，37 ℃滅活24 h，在此過程中每隔2 h搖勻1次，滅活完畢4 ℃保存。

取滅活的大腸桿菌液分別與等量佐劑乳化混合，當(dāng)溶液乳化至滴在水面上呈“油包水”狀，即合格，否則繼續(xù)乳化，3種佐劑與滅活菌的乳化制備方法相同，4 ℃保存。

1.2.3產(chǎn)蛋雞免疫方案

桃源蛋雞分組，6羽/組，分2籠飼養(yǎng)，按照免疫抗原的不同劑量、佐劑種類和間隔時間等3種免疫強(qiáng)化方式分組。（1）不同劑量的免疫抗原。分3組，菌體濃度依次是1010、1012、1014 CFU/mL。（2）不同佐劑依次是完全弗氏佐劑、不完全弗氏佐劑和10號白油3個組。（3）免疫強(qiáng)化方式分組。程序1：初免1次，無免疫強(qiáng)化；程序2：初免后每周免疫強(qiáng)化1次，連續(xù)4周；程序3：初免后每2周免疫強(qiáng)化1次，連續(xù)4次。

1.2.4高免卵黃抗體的制備

收集未免疫雞蛋，初次免疫接種當(dāng)天記為0 d，以后每周收集免疫蛋作為樣本，依次編號記錄，4 ℃保存，連續(xù)收集9周，同時設(shè)未免疫對照組，注射PBS乳化劑。先將收集的雞蛋用清水洗凈，再噴灑0.1%新潔爾滅消毒，無菌收集卵黃。分離卵黃與等量PBS混勻，然后加4倍體積的脫脂溶液[13]（含0.06%卡拉膠、0.18%低甲氧基果膠和10 μmol/L氯化鈣）混勻，于12 000 r/min、4 ℃下離心 25 min，取上清；再加硫酸銨至終濃度330 mg/mL，混勻，4 ℃下放置1 h，12 000 r/min下離心25 min，取沉淀用PBS溶解，加入硫酸銨至終濃度為200 mg/mL，混勻，放于透析袋內(nèi)透析，無菌過濾后加0.01%硫柳汞和青鏈霉素1 000 IU/mL，小量分裝，-20 ℃ 保存。

1.2.5蛋雞血清抗體的制備

免疫前1 d采血，免疫后每周自雞翅靜脈采血1 mL，分離血清，于3 500 r/min下離心5 min除紅細(xì)胞，標(biāo)記，置于-20 ℃下凍存，連續(xù)采血9周。

1.2.6抗體效價測定

采用平板凝集試驗進(jìn)行抗體效價測定。96孔“V”形微量血凝板中加入滅菌生理鹽水25 μL/孔，再吸抗體25 μL加入第1孔中，混勻，吸混合液25 μL于第2孔，混勻，吸混合液25 μL于第3孔，依次倍比稀釋至256倍（即第8孔，多余25 μL溶液吸棄）；留第9孔作空白對照，加滅菌生理鹽水25 μL。加仔豪豬腹瀉大腸桿菌抗原（含菌量為1012 CFU/mL）25 μL/孔，混勻各孔中溶液（每孔更換槍頭），微量血凝板放振蕩器上振蕩，2～3 min后記錄每孔凝集現(xiàn)象，對照孔溶液應(yīng)為均勻渾濁。與對照孔中溶液一樣渾濁者判定為無凝集反應(yīng)，記為“-”；凡是孔中溶液有肉眼可見絮狀凝集塊者，判定為有凝集反應(yīng)，記錄為“+”，絮狀凝集塊愈多，陽性反應(yīng)判定愈強(qiáng)，分別用“+[KG-*3]+”“+[KG-*3]+[KG-*3]+”“+[KG-*3]+[KG-*3]+[KG-*3]+”表示。凡發(fā)生凝集反應(yīng)結(jié)果判定為“+[KG-*3]+”的最高稀釋度即是該樣本抗體效價，效價用log2（稀釋倍數(shù)，x）表示。

2結(jié)果與分析

2.1免疫菌液濃度對卵黃抗體效價和雞血清抗體的影響

不同濃度（含菌數(shù)1010、1012、1014 CFU/mL）的大腸桿菌懸浮液1 mL分別免疫蛋雞，無佐劑，經(jīng)翅靜脈注射1次，免疫后特定時間收蛋和采血，測定卵黃抗體和血清抗體效價，結(jié)果如圖1所示。從圖1-a可以看出，不同濃度菌液免疫的雞蛋卵黃抗體的效價有較大差異，其中1010 CFU/mL菌量免疫的雞蛋卵黃抗體效價明顯低于1012、1014 CFU/mL菌量免疫的雞蛋，但1012、1014 CFU/mL菌量免疫的雞蛋卵黃抗體效價差別不明顯。將圖1-b和圖1-a對比可知，在同等條件下，被免疫雞的血清抗體效價比卵黃抗體效價略高，但就變化趨勢看，卵黃抗體效價與血清抗體效價的變化規(guī)律基本相同，均呈先上升再平穩(wěn)后下降的趨勢，并且基本同步。因此，選擇注射菌液濃度為1012 CFU/mL的大腸桿菌懸浮液1 mL作為最佳免疫劑量。

2.2不同免疫佐劑對卵黃抗體和雞血清抗體效價的影響

對蛋雞注射菌液濃度是1012CFU/mL菌懸浮液1 mL，添加不同佐劑（完全弗氏佐劑、不完全弗氏佐劑和10號白油），經(jīng)翅靜脈免疫注射1次，免疫后不同時間收蛋和采血測卵黃抗體和血清抗體效價；同時無佐劑免疫組同步免疫，作陰性對照，結(jié)果如圖2所示。研究發(fā)現(xiàn)，佐劑的添加均可在一定程度上提高卵黃抗體和血清抗體的效價。但從3種佐劑產(chǎn)生的免疫應(yīng)答看，完全弗氏佐劑效果最好，不完全弗氏佐劑和白油佐劑效果略差，且兩者對免疫應(yīng)答的加強(qiáng)作用差異不明顯。添加完全弗氏佐劑后，可使6周收集的免疫蛋卵黃抗體效價從3log2上升到5log2，同時6周采集的血清抗體效價從4log2上升至7log2，增加幅度明顯。因此，在制備免疫原時選擇大腸桿菌懸液與弗氏完全佐劑等量混合。

2.3不同強(qiáng)化免疫程序?qū)β腰S抗體和雞血清抗體效價的影響

給蛋雞免疫濃度是1012CFU/mL菌懸液1 mL，添加等量弗氏完全佐劑，經(jīng)翅靜脈注射，不同程序強(qiáng)化免疫，免疫后不同時間收蛋和采血，測卵黃抗體和血清抗體效價，結(jié)果如圖3所示。圖3顯示，與未進(jìn)行免疫強(qiáng)化的程序1相比，2種免疫強(qiáng)化的程序2、程序3均可明顯提高卵黃抗體和血清抗體效價。重要的是，在未進(jìn)行免疫強(qiáng)化的雞血清和卵黃中，其抗體效價分別在8、9周明顯下降，但免疫強(qiáng)化后，下降趨勢或者被推遲出現(xiàn)或者被完全消除。對比3種免疫程序發(fā)現(xiàn)，程序2和程序3在效果上差異不明顯，因此為節(jié)約時間，選擇采用免疫強(qiáng)化程序2對蛋雞進(jìn)行免疫。

3討論與結(jié)論

免疫蛋的制備實質(zhì)上是對蛋雞進(jìn)行抗原免疫，讓其在血

液中產(chǎn)生的抗體轉(zhuǎn)化到蛋黃中貯藏而形成含有較高特異性抗體濃度的雞蛋。研究顯示，抗原進(jìn)入機(jī)體要經(jīng)過1個潛伏期才會發(fā)生免疫作用，細(xì)菌抗原多是5～7 d。本研究結(jié)果表明，免疫初期，免疫組與對照組卵黃抗體效價和血清抗體效價均無明顯差別，說明是處在免疫潛伏階段。動物在受到抗原刺激后，在免疫應(yīng)答不同階段所產(chǎn)生的抗體類別是有差異的。初次應(yīng)答所產(chǎn)生的抗體水平不高，IgG很少，多數(shù)為IgM；但免疫加強(qiáng)后，抗體效價迅速增高，產(chǎn)生抗體則主要為IgG，而IgM很少，此現(xiàn)象的原因是記憶細(xì)胞開始重新分化、增殖，產(chǎn)生大量抗體。本研究結(jié)果也印證了這一點，在免疫加強(qiáng)后，卵黃抗體和血清抗體效價均有大幅度升高現(xiàn)象。以仔豪豬大腸桿菌懸浮液對140日齡純種桃源蛋雞免疫時，若固定免疫抗原劑量為1 mL，則當(dāng)菌液濃度低于1012 CFU/mL時，免疫應(yīng)答強(qiáng)度隨免疫劑量的降低而降低；當(dāng)菌液濃度高于1012 CFU/mL時，免疫應(yīng)答強(qiáng)度則不會隨免疫劑量的增加而得到明顯增強(qiáng)。因此，確定免疫菌液濃度是1012 CFU/mL，劑量定為1 mL/次。在菌懸液中分別添加等量完全弗氏佐劑、不完全弗氏佐劑和10號白油免疫蛋雞時，均可明顯加強(qiáng)雞體免疫應(yīng)答強(qiáng)度，其中弗氏完全佐劑對免疫應(yīng)答加強(qiáng)的程度最高，且對受試動物無不良作用。初免后，每周強(qiáng)化免疫1次，連續(xù)4周的強(qiáng)化免疫程序既經(jīng)濟(jì)又有效。本試驗研究了仔豪豬腹瀉大腸桿菌高免卵黃抗體及免疫雞血清抗體的變化規(guī)律，制備出了高效價的卵黃抗體和血清抗體。免疫后高效價卵黃抗體可以維持4周以上。試驗數(shù)據(jù)為臨床防治仔豪豬大腸桿菌腹瀉病提供了技術(shù)依據(jù)。

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