徐 磊，馬金龍

（1.大連市標(biāo)準(zhǔn)化研究院，大連 116001；2.大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，大連 116601）

基于人工囊泡研究跨膜蛋白的結(jié)構(gòu)和功能綜述

徐 磊1，馬金龍2

（1.大連市標(biāo)準(zhǔn)化研究院，大連 116001；2.大連民族學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，大連 116601）

綜述近年來(lái)利用脂質(zhì)體人工囊泡對(duì)跨膜蛋白在結(jié)構(gòu)和功能方面的研究成果和方法，分類介紹了合成多肽片段的實(shí)驗(yàn)方法、融膜多肽及細(xì)胞穿膜肽的融膜機(jī)理，并通過(guò)疏水片段整合跨膜蛋白結(jié)構(gòu)及功能的研究方法。

脂質(zhì)體；人工囊泡；跨膜蛋白；結(jié)構(gòu)功能

膜蛋白大約占細(xì)胞總蛋白質(zhì)的30%，在細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)、胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和生長(zhǎng)調(diào)節(jié)方面起到重要作用。根據(jù)其與脂質(zhì)分子的結(jié)合方式，膜蛋白分為整合蛋白（即跨膜蛋白）、外周蛋白和脂質(zhì)錨定蛋白。盡管膜蛋白在生命科學(xué)中占有重要地位，但因其難以大量表達(dá)且在體外難以保持活性而僅有少量研究比較透徹。為了維持膜蛋白的疏水結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)活性，目前多以脂質(zhì)和去垢劑整合膜蛋白，進(jìn)行膜蛋白的研究。而將跨膜蛋白整合到囊泡上進(jìn)行結(jié)構(gòu)和功能研究則是膜蛋白研究的熱點(diǎn)。

近年來(lái)國(guó)外有許多專家學(xué)者對(duì)跨膜蛋白利用脂質(zhì)體囊泡進(jìn)行結(jié)構(gòu)和功能方面的研究，在結(jié)構(gòu)方面的研究有：Ca-ATP酶整合到脂質(zhì)體囊泡通過(guò)NMR技術(shù)研究其結(jié)構(gòu)[1]，通過(guò)固相NMR技術(shù)研究流感病毒蛋白在脂質(zhì)體囊泡上的定向[2]，線粒體ATP合成酶重組脂質(zhì)體囊泡進(jìn)行結(jié)構(gòu)研究[3]。在功能方面的研究有：抗體修飾脂質(zhì)體囊泡與抗原作用研究，大腸桿菌PagP蛋白整合到脂質(zhì)體囊泡,瘋牛病病毒蛋白通過(guò)糖基磷脂酰肌醇整合到固定脂質(zhì)體囊泡上，質(zhì)子泵跨膜蛋白整合研究，低密度脂蛋白受體整合，鈉離子通道蛋白，降鈣素蛋白，細(xì)胞色素C氧化酶，Na-K ATP酶，非肌肉組織肌動(dòng)蛋白，陽(yáng)離子通道RIP蛋白，ATP合成酶，細(xì)菌視紫紅質(zhì)，Ca-ATP酶,天門冬氨酸受體蛋白，谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白研究[4]。在這里對(duì)近年來(lái)利用人工囊泡研究跨膜蛋白結(jié)構(gòu)和功能的進(jìn)展做一概述。

1 跨膜蛋白與脂質(zhì)體囊泡的結(jié)構(gòu)

1.1 跨膜蛋白的結(jié)構(gòu)

跨膜蛋白在結(jié)構(gòu)上主要分為兩大類：一種是跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)為α-螺旋(alpha-helix)，TM H(Transmembrane alpha-helical)；一種跨膜區(qū)-桶狀(beta-barrel)結(jié)構(gòu)，即TMB(Transmembrane betabarrel)。目前發(fā)現(xiàn)，除細(xì)菌和線粒體外膜蛋白的跨膜部分折疊成β桶狀結(jié)構(gòu)外，其它大多數(shù)的跨膜區(qū)均為α-螺旋結(jié)構(gòu)，有一個(gè)或更多的α-螺旋構(gòu)型的疏水片段形成跨膜結(jié)構(gòu)，一個(gè)α-螺旋結(jié)構(gòu)約含有15～25個(gè)氨基酸。膜蛋白可以通過(guò)疏水性、氫鍵和雙極性與脂雙層和水界面作用，脂雙層影響膜蛋白的結(jié)構(gòu)，進(jìn)而調(diào)控蛋白的活性，綜述[5-6]詳細(xì)介紹了脂雙層厚度對(duì)膜蛋白結(jié)構(gòu)和組織的影響,包括多肽長(zhǎng)度與脂雙層厚度的正、負(fù)不匹配的研究，多肽中氨基酸殘基側(cè)鏈與雙親性脂分子的相互作用以及對(duì)多肽構(gòu)型的影響[5]。一級(jí)結(jié)構(gòu)中氨基酸序列決定其是否跨膜和與膜內(nèi)其他螺旋如何作用。疏水氨基酸殘基傾向于形成跨膜結(jié)構(gòu)，而極性和可電離氨基酸殘基則會(huì)導(dǎo)致跨膜結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定，例如脯氨酸，然而這樣的氨基酸也存在于許多跨膜序列中，而且在膜蛋白結(jié)構(gòu)和功能中起到重要的作用。極性氨基酸可以通過(guò)形成氫鍵降低插膜所需能量，可電離氨基酸通過(guò)非電離狀態(tài)或形成鹽橋來(lái)降低在埋藏于脂雙層中所需能量消耗[6]。

1.2 脂質(zhì)體囊泡的結(jié)構(gòu)

脂質(zhì)體囊泡根據(jù)其結(jié)構(gòu)一般分為小單層囊泡(small unilamellar vesicle, SUV)、多層囊泡(multilayervesicle, MLV)、巨大單層囊泡(giant unilamellar vesicle,GUV)和多囊脂質(zhì)體囊泡(multivesicular liposome, MVL)等。單層囊泡是由一層脂質(zhì)雙分子層構(gòu)成的囊泡結(jié)構(gòu)，直徑為幾十～幾百nm；多層囊泡是指由若干層脂質(zhì)雙分子層構(gòu)成的囊泡，直徑一般在幾百nm；巨大單層囊泡和單層囊泡結(jié)構(gòu)相同，但直徑可以從幾到幾十μm，可以方便地使用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行觀察；多囊脂質(zhì)體囊泡是指由若干個(gè)單層或多層囊泡組成的復(fù)合囊泡，其直徑可達(dá)幾百μm，在一個(gè)大囊泡體系中包含若干個(gè)小囊泡[7]。由于囊泡的結(jié)構(gòu)與細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)相似，在生物膜模擬、藥物的封裝和靶向釋放、納米粒子的合成以及用作微反應(yīng)器等方面有著重要的應(yīng)用價(jià)值，因此囊泡成為近年來(lái)一個(gè)熱門話題[8-10]。構(gòu)成囊泡的物質(zhì)要求具有雙親性（既有親水的頭部，又有疏水的尾部），如磷脂類（分為天然磷脂和合成磷脂）、非離子表面活性劑、嵌段共聚物等。生物膜主要由鑲嵌著各種蛋白質(zhì)分子的磷脂雙分子層構(gòu)成，各種組成分子按照一定的規(guī)律有序地排列在一起，擔(dān)負(fù)起復(fù)雜的生物機(jī)能。

2 跨膜蛋白整合到囊泡的方法

2.1 直接法

在囊泡形成過(guò)程中，直接進(jìn)行蛋白整合，比如薄膜法和逆向蒸發(fā)法過(guò)程中，在水相直接將可溶或微溶蛋白加入，再進(jìn)行脂質(zhì)體的制作。此方法傾向于可溶性蛋白，對(duì)大多數(shù)膜蛋白來(lái)說(shuō)并不適用。

2.2 化學(xué)法

采用去垢劑，跨膜蛋白因含有跨膜疏水區(qū)在水溶液中一般為聚集狀態(tài)，然而去垢劑可以用來(lái)屏蔽疏水區(qū)，使得膜蛋白很好地整合到囊泡中，之后將去垢劑去除即可，去除方法為透析、疏水樹(shù)脂或膠珠吸收、凝膠色譜分離、離子交換色譜分離等（圖1）[11-12]。一般采用稀釋、透析或疏水吸附等方法，將復(fù)合體系中的去垢劑去除，進(jìn)行膜蛋白和囊泡的整合，此方法難點(diǎn)在于掌握去除去垢劑的速度和去垢劑的使用濃度，不同種類蛋白質(zhì)和膜體系有不同要求，一般規(guī)律可參看圖1，膜蛋白在和囊泡的不同結(jié)合形態(tài)其光吸收數(shù)值會(huì)有不同，常常通過(guò)這個(gè)指標(biāo)完成體系整合，因?yàn)榻^大多數(shù)膜蛋白疏水性較強(qiáng)。而且此方法所需條件溫和，可以很好地保持膜蛋白的天然結(jié)構(gòu)和活性，所以得到廣泛應(yīng)用和發(fā)展。

2.3 物理法

可以采用超聲法和反復(fù)凍融法，超聲法是將組成囊泡的膜蛋白和蛋白質(zhì)混合物進(jìn)行超聲處理，對(duì)超聲頻率和間歇時(shí)間都有一定要求。對(duì)于對(duì)超聲和去垢劑、有機(jī)溶劑不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)，可將囊泡與跨膜蛋白混合后反復(fù)進(jìn)行凍融處理，也能達(dá)到整合的效果。采用凝膠色譜、超速離心、蔗糖密度梯度離心等方法分離囊泡和其他物質(zhì)，尤其是蔗糖密度梯度離心法常用來(lái)分離跨膜蛋白和脂質(zhì)體囊泡的復(fù)合物，而凝膠色譜法和超速離心法多用來(lái)分離脂質(zhì)體囊泡和未包封的小分子物質(zhì)。

圖1 跨膜蛋白通過(guò)去垢劑輔助整合到脂質(zhì)體囊泡的步驟圖示（左圖橫坐標(biāo)為去垢劑濃度，縱坐標(biāo)為目標(biāo)溶液的光吸收數(shù)值；1表示去垢劑與囊泡融合的初始濃度，2表示去垢劑輔助整合的最大臨界濃度。）

3 脂質(zhì)體囊泡在研究跨膜蛋白結(jié)構(gòu)和功能上的應(yīng)用

將脂質(zhì)體囊泡應(yīng)用在研究跨膜蛋白的結(jié)構(gòu)和功能上，具有重要意義。首先，將膜蛋白正確整合到囊泡上，可以進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)和催化功能方面的研究而不受其他膜組分的干擾。其次，大量的膜蛋白整合到囊泡上可形成晶體結(jié)構(gòu)，進(jìn)行膜蛋白二維結(jié)構(gòu)的研究，解決了疏水性膜蛋白無(wú)法在水溶液中形成晶體結(jié)構(gòu)和天然構(gòu)象的問(wèn)題。

3.1 合成的疏水多肽片段

因合成多肽方法的改進(jìn)和操作的可行性，合成多肽片段是研究跨膜蛋白作用簡(jiǎn)便且有效的實(shí)驗(yàn)方法，可以任意定點(diǎn)改變各種氨基酸殘基，進(jìn)而研究一級(jí)結(jié)構(gòu)中氨基酸種類對(duì)多肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)乃至蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行研究，一直以來(lái)是研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的重點(diǎn)。

合成亮氨酸疏水片段，并通過(guò)氨基酸替換研究多肽與脂雙層的作用[13]，天冬酰胺在跨膜螺旋中作用[14]，天冬氨酸在跨膜和非跨膜螺旋構(gòu)象中的作用[15]，荷正電和負(fù)電氨基酸殘基在跨膜螺旋中的不同作用[16]，芳香族氨基酸在跨膜結(jié)構(gòu)中的作用[17]，賴氨酸在跨膜螺旋中的作用[18]，合成聚丙氨酸多肽插膜和定向研究[19]，研究合成疏水多肽α-螺旋跨膜定向受長(zhǎng)度及脂雙層厚度和膽固醇濃度的影響[20]，通過(guò)肽段長(zhǎng)度控制跨膜定向及膜內(nèi)螺旋的相互作用[21]，合成螺旋多肽折疊和跨膜研究[22]，堿性兩親α-螺旋多肽與酸性和中性脂質(zhì)體囊泡作用研究[23]，接有PEG的多肽插膜研究[24]，親水氨基酸對(duì)跨膜螺旋橫向位置的影響[25]，合成多肽插膜機(jī)理研究[26]，通過(guò)DSC檢測(cè)研究合成多肽PADH對(duì)膜熱力學(xué)性質(zhì)的影響[27]，跨膜多肽螺旋構(gòu)型的插膜能量依賴于膜的組成[28]。

3.2 融膜多肽及細(xì)胞穿膜肽的研究

融膜多肽是一類可以改變細(xì)胞膜雙層結(jié)構(gòu)曲率變化的多肽，包括病毒產(chǎn)生的抗菌多肽和動(dòng)植物分泌的毒素，例如蛇毒、峰毒等，通過(guò)與細(xì)胞膜結(jié)合而插入細(xì)胞膜，改變細(xì)胞膜中脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)曲率的變化，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性增加，使細(xì)胞凋亡。今年來(lái)，通過(guò)與脂質(zhì)體囊泡在體外的相互作用，研究其融膜機(jī)理，稱為這方面的研究熱點(diǎn)。例如：合成Bcl-2蛋白C端多肽與脂質(zhì)體作用導(dǎo)致囊泡包封物的泄露研究[29]，全新合成融膜多肽與脂質(zhì)體囊泡表面嵌合的研究[30]，溶血素E蛋白頭部N端添加7個(gè)疏水性氨基酸殘基增強(qiáng)其跨兩性脂膜的能力[31]，合成泡沫病毒融膜多肽對(duì)脂質(zhì)體囊泡的影響[32]，合成融膜肽從脂質(zhì)體囊泡內(nèi)部促使膜融解的研究[33]等等。

細(xì)胞穿膜肽（CPP）是一類能攜帶大分子物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞的短肽，其穿膜能力不依賴經(jīng)典的胞吞作用，經(jīng)過(guò)對(duì)天然存在的細(xì)胞穿膜肽的生物化學(xué)性質(zhì)研究，已經(jīng)逐漸掌握了細(xì)胞穿膜肽的一些共有特性，這類物質(zhì)均為帶有正電荷的長(zhǎng)短不等的多肽片段，其中富含精氨酸、賴氨酸等堿性氨基酸殘基，二級(jí)結(jié)構(gòu)皆具有α-螺旋的空間構(gòu)象。利用這些特性，目前已人工合成了穿透力更強(qiáng)、效率更高的穿膜肽PEp-1、MPG，并且成功地?cái)y帶大分子物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞發(fā)揮生物學(xué)活性，因而引起廣大科學(xué)家研究的熱情。大多在體外以脂質(zhì)體囊泡作為模擬細(xì)胞研究細(xì)胞穿膜肽，如合成PenArg, PenLys和Pen2W2F穿膜肽與脂質(zhì)體囊泡的作用[34]，合成TatP59W, TatLys-P59W和R7W穿膜肽，研究與不同直徑脂質(zhì)體囊泡的作用[35]，合成β七肽衍生物與脂質(zhì)體囊泡作用[36]。

3.3 通過(guò)疏水片段研究其蛋白結(jié)構(gòu)及功能

通過(guò)基因工程和蛋白質(zhì)工程的研究，可以得到要研究功能蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)序列和對(duì)應(yīng)的基因序列，科研工作者已經(jīng)總結(jié)出來(lái)大量蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)序列并構(gòu)建了蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)。除將目的蛋白通過(guò)大量表達(dá)提純外，也可以選擇部分功能片段進(jìn)行人工合成來(lái)對(duì)跨膜蛋白的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行推測(cè)，目前主要的研究成果如表1。

表1 利用脂質(zhì)囊泡與跨膜功能蛋白中的疏水片段整合研究蛋白結(jié)構(gòu)及功能一覽

4 展望

膜蛋白尤其是跨膜蛋白在細(xì)胞新陳代謝及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起到?jīng)Q定性作用，也是當(dāng)今科學(xué)研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)，但因其疏水性強(qiáng)，在表達(dá)、結(jié)構(gòu)分析以及功能研究方面困難重重。而利用脂質(zhì)囊泡體系構(gòu)建仿生環(huán)境在膜蛋白研究領(lǐng)域開(kāi)辟了一個(gè)嶄新的途徑，也突破了很多膜蛋白研究的瓶頸，例如膜蛋白表達(dá)對(duì)細(xì)胞毒性的影響、膜蛋白三維結(jié)構(gòu)的復(fù)位及生物活性的保留、膜蛋白功能的研究等。隨著新材料、新技術(shù)的出現(xiàn)，通過(guò)與脂質(zhì)囊泡研究的結(jié)合和改進(jìn)，不僅可以用來(lái)作為膜蛋白研究的工具，未來(lái)更可以出現(xiàn)人工仿生細(xì)胞，不僅在膜蛋白研究領(lǐng)域占有重要地位，更將為未來(lái)的細(xì)胞仿生學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域作出貢獻(xiàn)。

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Overview of Research on the Structure and Function of Transmembrane Proteins based on Artificial Vesicles

XU Lei1, MA Jin-long2
(1. Dalian City Institute of Standardization, Dalian, Liaoning 116001, China; 2. Life Science College, Dalian Nationalities University, Dalian, Liaoning 116601, China)

This review focuses on the recent research results and methods on the structure and function of transmembrane protein with the use of liposome artificial vesicles. And it classifies the experiment methods of synthetic peptide fragments, and the mechanism of melt membrane polypeptides and cell penetrating peptides. It tries to review the structure and function of transmembrane protein based on hydrophobic fragment.

liposome; artificial vesicles; transmembrane protein; structure function

Q51

A

1672-6286(2017)02-0058-09

徐磊，男，高級(jí)工程師，主要從事生物技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)體系建設(shè)研究工作。