石蓮花，金有訓(xùn)，何海紅，全燦，徐蓓，李紅梅

(中國計(jì)量科學(xué)研究院，北京 100029)

血清中尿酸和尿素含量測定的超高效液相色譜-單四級桿質(zhì)譜法國際比對＊

石蓮花，金有訓(xùn)，何海紅，全燦，徐蓓，李紅梅

(中國計(jì)量科學(xué)研究院，北京 100029)

基于單四極桿質(zhì)譜建立了血清中尿酸、尿素含量準(zhǔn)確測定的同位素稀釋超高效液相色譜-質(zhì)譜方法，并以該方法參加了國際物質(zhì)量咨詢委員會(CCQM)組織的“血清中尿酸尿素含量測定”的K、P國際比對。血清樣品用乙腈除去蛋白質(zhì)，分別采用C18反相柱和電噴霧(ESI)負(fù)離子模式檢測尿酸、CN正相柱和ESI正離子模式檢測尿素，同位素稀釋的單點(diǎn)校準(zhǔn)法進(jìn)行定量，用3種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(GBW 09157，GBW 09169，NIST SRM 909c)進(jìn)行方法驗(yàn)證，測量比對血清樣品(Ⅰ，Ⅱ)獲得國際等效一致性。該方法操作簡單、快速準(zhǔn)確，適用于血清中尿酸尿素的定量分析。

單四級桿質(zhì)譜；同位素稀釋液相色譜-質(zhì)譜法；尿酸；尿素；血清；國際比對

AbstractThe method to determine uric acid and urea in serum was established by single quadrupole-based isotope dilution ultra performance liquid chromatography-mass spectrometer, which was used for CCQM-K and P international comparison. Acetonitrile was added in the sample for protein precipitation, a C18reversed-phase column and electrospray ionization (ESI) negative ion mode was used to determine uric acid, and CN normal-phase column and ESI positive ion mode were used to determine urea, and a single point calibration method for quantitative isotope dilution. This method was veri fied with GBW 09157, GBW 09169 and NIST SRM 909c certi fied reference materials, and serum samples (Ⅰ，Ⅱ)were measured to obtain international equivalent consistency. The method is simple in operation, rapid and accurate, it is suitable for quantitative analysis of urea in serum uric acid.

Keywordssingle quadrupole mass spectrometry; isotope dilution high performance liquid chromatography-mass spectrometry; uric acid; urea; serum; international comparison

血清尿酸、尿素是醫(yī)學(xué)臨床檢查腎功能的重要指標(biāo)［1］。尿酸是嘌呤代謝物的最終產(chǎn)物，其在血清中的濃度若超過正常值則會引起痛風(fēng)、腎結(jié)石、冠心病等疾?。?-4］；尿素是蛋白質(zhì)代謝產(chǎn)物，是蛋白質(zhì)代謝與尿毒癥臨床診斷的重要指標(biāo)之一［5］。因此血清尿酸、尿素的準(zhǔn)確定量對臨床診斷及治療具有重要意義。

目前血清尿酸、尿素的測定方法［6-8］中，質(zhì)譜技術(shù)因具有快速、準(zhǔn)確、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)而得以廣泛應(yīng)用，其中同位素稀釋液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用(LC-IDMS/MS)［9-12］、氣相色譜 - 質(zhì)譜 (GC-ID/MS)［13-15］技術(shù)，是國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)溯源聯(lián)合委員會(JCTLM)認(rèn)可的參考測量方法。近年來，質(zhì)譜技術(shù)發(fā)展迅速，一級和二級質(zhì)譜性能進(jìn)一步提升，分辨率和靈敏度、特異性都有了顯著提高。本研究結(jié)合同位素稀釋技術(shù)，建立了操作簡便、特異性強(qiáng)、靈敏度高的液相色譜-單四級桿質(zhì)譜(LC-IDMS)法，可代替前處理繁瑣的氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)和易被高濃度待測物污染的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)。用此方法參加國際物質(zhì)量咨詢委員會組織的K，P國際比對，使用中國計(jì)量科學(xué)研究院的純物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和血清基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行了校準(zhǔn)和方法驗(yàn)證，使比對結(jié)果的量值溯源到中國計(jì)量科學(xué)研究院，保證了測量結(jié)果的準(zhǔn)確、可靠，實(shí)現(xiàn)了我國與國際尿酸和尿素參考系統(tǒng)的互認(rèn)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：ACQUITY?UPLC/SQD型，美國Waters公司；

分析天平：XP10003S型(感量為1 mg)，XP205型(感量為0.01 mg)，XP26型(感量為0.001 mg)，瑞士梅特勒-托利多公司；

混合器：VORTEX GENIE 2型，美國Scienti fic Industries公司；

多用途旋轉(zhuǎn)搖床：ROTO-SHAKE GENIE型，美國SI公司；

移 液器：10～100 μL，20～200 μL，100～1 000 μL，0.5～5 mL，德國 Eppendorf公司；

氮吹儀：N-EVAP112型，美國OA-SYS公司；

離心機(jī)：Sigma 3K15型，美國Sigma公司；

過濾膜：0.22 μm，親水性聚丙烯膜，美國Pall公司；

尿酸純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：編號為GBW 09202，純度為99.8%，中國計(jì)量科學(xué)研究院；

尿酸同位素標(biāo)記物：1，3-15N2，純度為 98%，美國劍橋同位素實(shí)驗(yàn)室；

尿素純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：編號為GBW 09201，純度為99.8%，中國計(jì)量科學(xué)研究院；

尿素同位素標(biāo)記物：Urea-13C，15N2，純度不小于98%，13C含量為99%，15N含量為98%，美國劍橋同位素實(shí)驗(yàn)室；

冰凍人血清中尿素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：編號分別為GBW 09157，GBW 09169，中國計(jì)量科學(xué)研究院；

冰凍人血清中尿素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：編號為NIST 909C，美國國家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院；

比對血清樣品：編號分別為I和II，均為1 mL，于-70℃冰箱中保存，新加坡衛(wèi)生科學(xué)局；

乙酸銨：色譜純，美國Sigma公司；

氨水：色譜純，中國阿拉丁公司；

甲醇、乙腈：色譜純，德國Merk公司；

甲酸：色譜純，德國Merk公司；

實(shí)驗(yàn)用水為超純水，由美國Mililpore公司超純水儀制得。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜條件

(1)測定尿酸的色譜條件。

色譜柱：BEH C18柱 (150 mm×2.1 mm，1.7μm，美國Waters公司)；柱溫：37℃；進(jìn)樣體積：5μL ；流動相：A 為 10 mmol/L 乙酰胺溶液 (pH 4.6)，B 為乙腈，梯度洗脫，0～4.5 min 100% A，4.5～5.5 min A由100%變化至20%，5.5～7.5 min保持20%A，7.5～8 min A由20%變化至100%且保持至12.5 min；流量：0.2 mL/min。

(2)測定尿素的色譜條件。

色譜柱：ZORBAX SB-CN柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm，美國安捷倫科技有限公司)；柱溫：37℃；進(jìn)樣體積：5 μL；流動相：0.1%甲酸水溶液-甲醇(體積比為1∶1)；等梯度洗脫。

1.2.2 質(zhì)譜條件

(1)測定尿酸的質(zhì)譜條件。

采用電噴霧離子源(ESI)負(fù)離子模式；離子源溫度：150℃；脫溶液溫度：450℃；脫溶劑：N2，流量為 550 L/h；錐孔氣：N2，流量為 50 L/h；毛細(xì)管電壓：2.2 kV ；監(jiān)測離子(m/z)：167.1，169.1。

(2)測定尿素的質(zhì)譜條件。

采用電噴霧離子源(ESI)正離子模式；離子源溫度：150℃；脫溶液溫度：450℃；脫溶劑：N2，流量為 550 L/h；錐孔氣：N2，流量為 50 L/h；毛細(xì)管電壓：3.0 kV ；監(jiān)測離子(m/z)：61.1，64.1。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 樣品準(zhǔn)備

測定兩份比對血清樣品中尿酸、尿素的含量。測定時(shí)每瓶比對樣品取0.2 mL，進(jìn)行樣品前處理。

1.3.2 尿酸、尿素標(biāo)準(zhǔn)溶液配制與樣品前處理

準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量的尿酸純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用1 mmol/L 氨水溶液稀釋至 100 μg/g，制得尿酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液，置于搖床混合儀中充分溶解。以同樣步驟制備［15N2］尿酸標(biāo)記儲備液(100 μg/g)。各取一定量尿酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液、［15N2］尿酸標(biāo)記儲備液，用10 mol/L乙酰胺流動相溶液制備尿酸校準(zhǔn)混合溶液，其中尿酸和［15N2］尿酸含量比約為1∶1，尿酸校準(zhǔn)混合溶液中尿酸的濃度盡量接近于血清尿酸含量。

血清樣品于室溫下平衡2 h，取0.2 mL并精確稱量，加入［15N2］尿酸標(biāo)記物使尿酸標(biāo)記物含量與血清尿酸含量比接近與1∶1，搖勻。然后加入約4倍體積的乙腈，振蕩混勻，再置于4℃離心機(jī)中以8 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心15 min。取上清液，用45℃氮?dú)獯蹈桑尤肓鲃酉鄰?fù)溶至10 μg/g，用0.22μm過濾膜過濾，進(jìn)行LC-IDMS分析。

以相同步驟用水稀釋制備400 μg/g尿素和［13C，15N2］尿素標(biāo)記儲備液、尿素校準(zhǔn)混合溶液、血清前處理樣品。

尿酸及尿素監(jiān)測離子色譜圖如圖1所示。為了確保血清中尿酸、尿素含量測定結(jié)果的準(zhǔn)確性，以冰凍人血清中尿素、尿酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行方法驗(yàn)證。

圖1 比對血清I離子色譜圖

2 結(jié)果與討論

2.1 結(jié)果計(jì)算

使用同位素稀釋單點(diǎn)校準(zhǔn)法計(jì)算血清中尿酸或尿素(待測物)含量按下式：

式中：c——血清樣品中待測物含量，mg/kg；

cs——校準(zhǔn)混合溶液中待測物含量，mg/kg；

Ms——校準(zhǔn)混合溶液中加入的待測物質(zhì)量，mg；

Rx——血清樣品中待測物與標(biāo)記待測物峰面積比；

Mix——血清樣品中加入的標(biāo)記待測物質(zhì)量，mg；

Mis——校準(zhǔn)混合溶液中加入的標(biāo)記待測物質(zhì)量，mg；

Rs——校準(zhǔn)混合溶液中待測物與標(biāo)記待測物峰面積比；

Wx——血清樣品質(zhì)量，mg。

2.2 方法驗(yàn)證

用建立的LC-IDMS法測定尿酸、尿素基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，以評價(jià)方法的準(zhǔn)確性，測定結(jié)果見表1。由表1可知，基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的測量值均在證書標(biāo)準(zhǔn)值不確定度范圍內(nèi)。

表1 基體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)LC-IDMS法測定結(jié)果 mg/kg

2.3 比對樣品測定結(jié)果

按照校準(zhǔn)混合溶液、樣品1、樣品2順序循環(huán)進(jìn)樣5次，利用單點(diǎn)校準(zhǔn)法計(jì)算血清中尿酸、尿素含量，測量結(jié)果及不確定度評定結(jié)果分別見表2、表3。

表2 比對血清樣品Ⅰ、Ⅱ中尿酸含量及不確定度

表3 比對血清樣品I、II中尿素含量及不確定度

2.4 參與國間的比對結(jié)果

本次比對有兩種不同濃度尿酸、尿素血清(Ⅰ、Ⅱ樣)，共有15個(gè)國家計(jì)量院參加。此比對使用的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及測定方法見表4。由表4可知，大部分參與國使用了美國國家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院提供的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和 LC-IDMS/MS、GC-ID/MS測定方法，而本研究則使用自制的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和LC-IDMS方法。結(jié)果 IDMS(LC/MS、LC/MS/MS、GC/MS)法測定尿酸的平均值為(136.4±0.93) mg/kg (Ⅰ 樣)，(39.37±0.15) mg/kg (Ⅱ 樣)；尿素的平均值為(1 486.20±8.67) mg/kg (Ⅰ樣)，(334.50±1.29) mg/kg (Ⅱ樣)。對比表 2、表 3 可以看出，中國計(jì)量科學(xué)研究院的比對結(jié)果與同法測量平均值接近，從而驗(yàn)證了LC-IDMS測量方法的準(zhǔn)確性和可靠性。

表4 比對參與國家采用的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及測定方法統(tǒng)計(jì)

3 結(jié)論

本次比對重點(diǎn)是解決尿酸的難溶解性和尿素的高效分離。尿酸一般不溶于水和有機(jī)溶劑，溶于KOH，NaOH和氨水等堿性溶液和酸性緩沖溶液。而目前尿酸參考測量方法使用氨水，其濃度會影響尿酸的穩(wěn)定性［16］。本方法采用1 mmol/L氨水充分溶解尿酸(≥1 h)，且使用超高效色譜柱和乙酰胺緩沖溶液提高尿酸的分離效果及離子化效率。對于不易用C18反相色譜柱直接分離、易受質(zhì)譜干擾離子(質(zhì)荷比＜100)影響的尿素，則采用正相色譜技術(shù)高效分離，并結(jié)合高分辨率單四級桿質(zhì)譜準(zhǔn)確定量。此方法樣品前處理簡便，與中國計(jì)量科學(xué)研究院和美國國家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院提供的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)值之間的相對偏差小于0.8%，可以準(zhǔn)確測定血清中尿酸尿素含量。國際物質(zhì)量咨詢委員會組織的血清尿酸、尿素(K，P)國際比對獲得了良好的結(jié)果，保證了中國計(jì)量科學(xué)研究院尿酸和尿素檢測領(lǐng)域的量值溯源。

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首個(gè)國產(chǎn)檢測儀器設(shè)備驗(yàn)證與綜合評價(jià)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)發(fā)布

第五屆“國產(chǎn)檢測儀器設(shè)備驗(yàn)證與綜合評價(jià)技術(shù)服務(wù)推介會”正式發(fā)布了《分析化學(xué)儀器設(shè)備驗(yàn)證與綜合評價(jià)指南》行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。該標(biāo)準(zhǔn)系首個(gè)國產(chǎn)檢測儀器設(shè)備驗(yàn)證與綜合評價(jià)認(rèn)證認(rèn)可行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，將于2017年12月1日起正式實(shí)施。

此項(xiàng)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)是北京市科學(xué)技術(shù)委員會與北京市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局在驗(yàn)評項(xiàng)目工作基礎(chǔ)上，由北京出入境檢驗(yàn)檢疫局牽頭與北京海光儀器有限公司共同將組織工作上升為行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，概括性定義了國產(chǎn)檢測儀器驗(yàn)證與綜合評價(jià)的組織結(jié)構(gòu)、流程，確定了各個(gè)階段的實(shí)施步驟，形成了具有系統(tǒng)性、規(guī)范性、科學(xué)性的，適用于國產(chǎn)檢測儀器驗(yàn)證與綜合評價(jià)工作的指導(dǎo)性文件。

(李)

Determination of Uric Acid and Urea in Serum by Ultra Performance Liquid Chromatography-Single Quadrupole Mass Spectrometry for International Comparison

Shi Lianhua, JinYouxun, He Haihong, Quan Can, Xu Bei, Li Hongmei
(National Institute of Metrology, Beijing 100029, China)

O657.7

A

1008-6145(2017)03-0085-04

10.3969/j.issn.1008-6145.2017.03.022

*國家科技基礎(chǔ)專項(xiàng)(2011FY130100)；國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2016YFD0500800)；中國計(jì)量科學(xué)研究院比對專項(xiàng)(03-AJLSF15)

聯(lián)系人：石蓮花；E-mail: shilh@nim.ac.cn

2017-04-01