肖洪賀，教亞男，閆宇輝，李紅艷，楊靜嫻

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 大連 116600)

蛇床子素上調(diào)miRNA-107減少APP595/596轉(zhuǎn)基因神經(jīng)元Aβ的生成

肖洪賀，教亞男，閆宇輝，李紅艷，楊靜嫻

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 大連 116600)

目的 考察蛇床子素(osthole，Ost)對(duì)轉(zhuǎn)染APP595/596基因的小鼠神經(jīng)元的保護(hù)作用，并探討其作用機(jī)制。方法 原代培養(yǎng)小鼠神經(jīng)元，轉(zhuǎn)染APP595/596基因構(gòu)建AD細(xì)胞模型；采用CCK-8法檢測(cè)神經(jīng)元存活率；試劑盒法檢測(cè)乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase，LDH)釋放量，評(píng)價(jià)神經(jīng)元的損傷程度；TUNEL染色法檢測(cè)神經(jīng)元凋亡；免疫熒光化學(xué)法檢測(cè)β-淀粉樣蛋白(beta-amyloid peptide，Aβ)和β-分泌酶1(β-site APP cleaving enzyme 1，BACE1)的蛋白表達(dá)；RT-PCR檢測(cè)miRNA-107的表達(dá)。結(jié)果 與模型組比較，Ost干預(yù)組神經(jīng)元的存活率明顯升高，LDH釋放量明顯降低，凋亡率明顯降低，Aβ和BACE1的蛋白表達(dá)均明顯降低，而miRNA-107的表達(dá)明顯升高。結(jié)論 Ost對(duì)轉(zhuǎn)染APP595/596基因的小鼠神經(jīng)元具有良好的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與上調(diào)miRNA-107表達(dá)，抑制BACE1表達(dá)，進(jìn)而減少Aβ生成有關(guān)。

獨(dú)活；蛇床子素；阿爾茨海默?。簧窠?jīng)保護(hù)；β-淀粉樣蛋白；miRNA-107

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是多發(fā)于65歲以上人群的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性的記憶損傷、認(rèn)知障礙以及精神行為異常。β-淀粉樣蛋白(beta-amyloid peptide，Aβ)沉積形成的老年斑和細(xì)胞微管連接蛋白tau的高度磷酸化產(chǎn)生的神經(jīng)纖維纏結(jié)是AD的兩大病理特征[1]。Aβ異常產(chǎn)生與沉積可引起tau蛋白磷酸化、遞質(zhì)丟失、神經(jīng)膠質(zhì)增生和炎癥等復(fù)雜的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，引發(fā)了神經(jīng)纖維纏結(jié)、神經(jīng)元丟失和腦組織萎縮等AD病理現(xiàn)象[2-3]。目前治療AD的藥物，如多奈哌齊、加蘭他敏等，主要通過調(diào)節(jié)興奮性神經(jīng)遞質(zhì)通路而改善輕、中度AD癥狀，但不能預(yù)防、終止或逆轉(zhuǎn)AD進(jìn)程，且伴有嘔吐、腹瀉等胃腸道不良反應(yīng)[4-6]。因此，研發(fā)療效確切、安全無毒的AD防治藥物迫在眉睫。

蛇床子素(osthole，Ost)，又名甲基歐芹酚或歐芹酚甲醚，是中藥獨(dú)活的主要活性成分。研究表明，蛇床子素具有改善學(xué)習(xí)記憶、延緩衰老、抗腫瘤等藥理活性[7]。近年來本實(shí)驗(yàn)組發(fā)現(xiàn)，蛇床子素能改善AD模型細(xì)胞損傷[8-9]，維持AD神經(jīng)元突觸的結(jié)構(gòu)和功能[10]，并能夠促進(jìn)AD神經(jīng)干細(xì)胞向多種神經(jīng)細(xì)胞分化[11-12]，提示蛇床子素有可能成為治療AD的潛在開發(fā)藥物。但蛇床子素對(duì)Aβ的影響及機(jī)制尚不明確，故本實(shí)驗(yàn)采用APP595/596基因感染小鼠神經(jīng)元，構(gòu)建AD細(xì)胞模型，探討蛇床子素是否通過上調(diào)miRNA-107，抑制將淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein, APP)剪切成Aβ的β-分泌酶1(β-site APP cleaving enzyme 1，BACE1)的表達(dá)，進(jìn)而減少Aβ的生成，發(fā)揮對(duì)AD細(xì)胞的保護(hù)作用。

1 材料

1.1 藥品與試劑 蛇床子素，購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所(純度≥98.0%，批號(hào)：110822-200305)；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶-EDTA消化液和青霉素-鏈霉素均購(gòu)自Gibco；APP595/596質(zhì)粒、綠色熒光蛋白(green fluorescein protein，GFP)質(zhì)粒及慢病毒包裝系統(tǒng)(pLP1、pLP2、pLP/VSV-G)由天津醫(yī)科大學(xué)閆亞平教授構(gòu)建；脂質(zhì)體2000(Invitrogen公司)；DH5α感受態(tài)大腸桿菌、無內(nèi)毒素質(zhì)粒小提試劑盒(Omega公司)；CCK-8試劑盒(Dojindo公司)；二甲基亞砜(Amresco公司)；乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase，LDH)試劑盒(南京建成公司)；cDNA合成試劑盒和PCR Master Mix試劑，購(gòu)自Fermentas；兔抗人NF-M、APP、Aβ1-42、BACE1一抗(Bioss公司)；二抗Cy3標(biāo)記羊抗兔免疫球蛋白G(Jackson公司)。

1.2 儀器與設(shè)備 Ti-S型熒光顯微鏡(日本尼康)、DIV-86L386超低溫冰箱(青島海爾)、CO2培養(yǎng)箱(NUAIRE，BPN)、酶標(biāo)儀(深圳邁瑞，MR-96A)、PCR儀(杭州朗基，MG96G)、凝膠成像系統(tǒng)(UVP，GeneGenius)。

1.3 動(dòng)物 SPF級(jí)C57BL/6小鼠，購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物有限公司，許可證號(hào)：SCXK(遼)2015-0001。出生48 h內(nèi)的新生小鼠用于實(shí)驗(yàn)。

2 方法

2.1 蛇床子素溶液的配制 精密稱取2.31 mg Ost，溶于50 μL DMSO中，加DMEM稀釋至1 mL,制成濃度為10 mmol·L-1的Ost母液，加DMEM稀釋至終濃度為50 μmol·L-1的Ost工作液，-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 小鼠皮層神經(jīng)元的分離與培養(yǎng) 取新生小鼠大腦皮層，剪成糜狀，胰酶消化15 min，篩網(wǎng)過濾得到細(xì)胞懸液，以6×108·L-1的密度接種于96孔板(經(jīng)多聚賴氨酸包被過)，加入DMEM完全培養(yǎng)基，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。接種d 3，培養(yǎng)基替換為含有2.5 μmol·L-1阿糖胞苷的DMEM完全培養(yǎng)基，48 h后更換新的完全培養(yǎng)基。待細(xì)胞融合度達(dá)70%～80%以上，用于轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。

2.3 APP595/596轉(zhuǎn)染神經(jīng)元構(gòu)建AD細(xì)胞模型 GFP-APP595/596質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)大腸桿菌，接種于LB固體培養(yǎng)基，37℃倒置培養(yǎng)16 h，挑取陽性克隆，置于LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)18 h，提取GFP-APP595/596質(zhì)粒。取GFP或GFP-APP595/596質(zhì)粒15 μg、pLP1質(zhì)粒6.5 μg、pLP2質(zhì)粒2.5 μg、pLP/VSV-G質(zhì)粒3.5 μg，采用脂質(zhì)體2000介導(dǎo)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，空白對(duì)照組轉(zhuǎn)染GFP質(zhì)粒。培養(yǎng)24 h后，熒光顯微鏡下觀察，呈現(xiàn)綠色熒光。轉(zhuǎn)染72 h后，分別收集含有病毒的細(xì)胞培養(yǎng)液上清，離心，濃縮，檢測(cè)病毒滴度；濃縮的病毒上清轉(zhuǎn)染神經(jīng)元，72 h后，采用免疫熒光化學(xué)法檢測(cè)轉(zhuǎn)染情況，RT-PCR檢測(cè)APP的mRNA表達(dá)，Western blot檢測(cè)APP的蛋白表達(dá)。

2.4 實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)分為正常對(duì)照組(轉(zhuǎn)染GFP的神經(jīng)元，GFP)、模型對(duì)照組(轉(zhuǎn)染GFP-APP595/596基因的神經(jīng)元，APP)和Ost干預(yù)組(轉(zhuǎn)染GFP-APP595/596基因的神經(jīng)元，Ost)。Ost組給予蛇床子素(終濃度為50 μmol·L-1)，GFP組和APP組給予等量溶媒，作用24 h后，檢測(cè)下列指標(biāo)。

2.5 CCK-8法檢測(cè)神經(jīng)元活力 各組細(xì)胞藥物干預(yù)24 h后，每孔加入CCK-8溶液10 μL，37℃孵育4 h后，450 nm下檢測(cè)吸光度。

2.6 試劑盒法檢測(cè)神經(jīng)元LDH釋放量 各組細(xì)胞藥物干預(yù)24 h后，離心取上清液，根據(jù)試劑盒說明書操作，510 nm下檢測(cè)各組吸光度，計(jì)算LDH的釋放量。

2.7 TUNEL染色法檢測(cè)神經(jīng)元凋亡 按照TUNEL試劑盒說明書進(jìn)行操作。各組細(xì)胞藥物干預(yù)24 h后，以1%多聚甲醇固定30 min，0.2%的Triton X-100透化5 min，PBS沖洗，加入PE，37℃孵育1 h，用PBS洗凈，DAPI避光染色5 min，置熒光顯微鏡下觀察神經(jīng)元凋亡情況。用Image J軟件進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算凋亡率。凋亡率/%=紅色凋亡細(xì)胞數(shù)/DAPI陽性細(xì)胞數(shù)×100%。

2.8 免疫熒光化學(xué)法檢測(cè)Aβ和BACE1蛋白表達(dá) 各組細(xì)胞進(jìn)行藥物干預(yù)24 h后，棄去上清液，以4%多聚甲醛固定30 min，0.1%的Triton X-100透化20 min，加入一抗稀釋液(1 ∶100)，4℃過夜，再加入Cy3標(biāo)記的二抗稀釋液(1 ∶100)室溫避光1 h，用PBS洗凈，加入DAPI避光孵育15 min，再洗凈加入抗熒光淬滅劑進(jìn)行封片，倒置熒光顯微鏡下觀察，并用Image J軟件對(duì)各組細(xì)胞中Aβ及BACE1蛋白的熒光強(qiáng)度進(jìn)行掃描和定量。

2.9 RT-PCR法檢測(cè)APP和miRNA-107基因表達(dá) 試劑盒法提取各組細(xì)胞總RNA，按Revert AidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit所示比例配制成RT反應(yīng)體系，65℃ 5 min；42℃ 60 min，70℃ 5 min，合成cDNA，-80℃凍存?zhèn)溆?。進(jìn)行PCR反應(yīng)(50 μL體系)：按PCR Master Mix Kit所示比例配制成PCR反應(yīng)體系，樣品DNA用量為2.5 μL。反應(yīng)條件為95℃ 2 min，95℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min，72℃ 10 min，35個(gè)循環(huán)后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，Image J進(jìn)行光密度掃描分析。各引物序列見Tab 1。

3 結(jié)果

3.1 APP在轉(zhuǎn)染APP595/596基因的神經(jīng)元中高表達(dá) 經(jīng)免疫熒光法鑒別，培養(yǎng)的小鼠皮層神經(jīng)元表達(dá)神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)記物神經(jīng)絲蛋白M(neurofilament M,NF-M)(Fig 1A)。轉(zhuǎn)染APP595/596基因后，在熒光顯微鏡下觀察GFP的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，感染了GFP-APP和感染了GFP的神經(jīng)元都呈現(xiàn)綠色熒光(Fig 1A)。RT-PCR法與Western bolt結(jié)果顯示，感染了GFP-APP的神經(jīng)元中，APP呈現(xiàn)高表達(dá)(Fig 1B、1C)，證明穩(wěn)定表達(dá)APP595/596的轉(zhuǎn)基因神經(jīng)元構(gòu)建成功。

Tab 1 Sequences of primers for RT-PCR

F：forward primer，R：reverse primer

Fig 1 Highly expressed APP in neurons transfected with APP595/596 gene

A:Immunocytochemistry staining. NF-M is short for neurofilament M, NF-M+(Red), GFP+(green); B: The mRNA of APP assessed by RT-PCR; B: The protein of APP assessed by Western blot

3.2 蛇床子素提高轉(zhuǎn)染APP595/596基因的神經(jīng)元活力 如Fig 2所示，轉(zhuǎn)染APP595/596的神經(jīng)元存活率為(57.9±4.6)%，明顯低于正常對(duì)照組(100±4.4)%(P<0.01)，而給予Ost(終濃度50 μmol·L-1)后，神經(jīng)元存活率升高至(79.5±3.6)%，與模型組(57.9±4.6)%比較，差異有顯著性(P<0.01)，提示Ost能提高APP595/596轉(zhuǎn)基因神經(jīng)細(xì)胞的存活率。

Fig 2 Ost developed viability of neurons transfected with APP595/596 gene(±s,n=3)

##P<0.01vsGFP group;**P<0.01vsAPP group

3.3 蛇床子素降低轉(zhuǎn)染APP595/596基因的神經(jīng)元LDH釋放量 如Fig 3所示，轉(zhuǎn)染APP595/596的神經(jīng)元LDH的釋放量明顯升高，與正常對(duì)照組比較，差異有顯著性(P<0.01)，給予50 μmol·L-1的Ost后，LDH水平與模型組比較明顯降低(P<0.01)。提示Ost可減少APP595/596轉(zhuǎn)基因神經(jīng)元的LDH釋放量。

Fig 3 Ost decreased LDH release of neurons transfected with APP595/596 gene(±s,n=3)

##P<0.01vsGFP group;**P<0.01vsAPP group

3.4 蛇床子素抑制轉(zhuǎn)染APP595/596基因的神經(jīng)元凋亡 如Fig 4所示，轉(zhuǎn)染APP595/596基因的神經(jīng)元紅色斑點(diǎn)明顯多于正常對(duì)照組(P<0.01)，說明模型組神經(jīng)元發(fā)生了凋亡反應(yīng)；給予Ost后，紅色斑點(diǎn)減少，神經(jīng)元凋亡率降低，與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。提示Ost能夠抑制APP595/596轉(zhuǎn)基因神經(jīng)元的凋亡。

Fig 4 Ost inhibited apoptosis of neurons transfected with APP595/596 gene(±s,n=3)

##P<0.01vsGFP group;**P<0.01vsAPP group

3.5 蛇床子素下調(diào)轉(zhuǎn)染APP595/596基因的神經(jīng)元Aβ的蛋白表達(dá) 如Fig 5所示，轉(zhuǎn)染APP595/596基因的神經(jīng)元Aβ的表達(dá)明顯高于正常對(duì)照組(P<0.01)；給予Ost后，Aβ的表達(dá)明顯降低，與模型組比較，差異有顯著性(P<0.01)。提示Ost能夠抑制Aβ的表達(dá)。

Fig 5 Ost reduced expression of Aβ in neurons transfected with APP595/596 gene(±s,n=3)

##P<0.01vsGFP group;**P<0.01vsAPP group

3.6 蛇床子素下調(diào)轉(zhuǎn)染APP595/596基因的神經(jīng)元BACE1的蛋白表達(dá) 如Fig 6所示，轉(zhuǎn)染GFP的對(duì)照組神經(jīng)元BACE1的表達(dá)較弱，而轉(zhuǎn)染APP595/596基因的模型組BACE1的表達(dá)明顯增強(qiáng)(P<0.01)；給予Ost后，BACE1的表達(dá)明顯降低，與模型組比較差異有顯著性(P<0.01)。提示Ost能夠抑制BACE1的表達(dá)。

3.7 蛇床子素上調(diào)轉(zhuǎn)染APP595/596基因的神經(jīng)元miRNA-107的表達(dá) 如Fig 7所示，模型組與對(duì)照組相比，miRNA-107的表達(dá)明顯降低(P<0.01)，給藥組miRNA-107的表達(dá)明顯升高，與模型組比較差異有顯著性(P<0.01)。提示Ost能夠上調(diào)APP595/596轉(zhuǎn)基因神經(jīng)元中miRNA-107的表達(dá)。

4 討論

AD的Aβ致病假說已被廣泛接受，認(rèn)為Aβ在腦組織中的積聚是各種原因誘發(fā)AD的共同通路，也是AD形成和發(fā)生的關(guān)鍵因素。研究發(fā)現(xiàn)，APP基因595/596位點(diǎn)發(fā)生突變，導(dǎo)致細(xì)胞及動(dòng)物腦內(nèi)具有神經(jīng)毒性的Aβ分泌量明顯升高，表現(xiàn)出與AD患者類似的病理和臨床特征，如大腦內(nèi)局限性Aβ沉積、行為障礙及癡呆癥狀出現(xiàn)的早晚與年齡相關(guān)等[13-15]。本實(shí)驗(yàn)采用APP595/596基因轉(zhuǎn)染小鼠皮層神經(jīng)元，在體外構(gòu)建AD細(xì)胞模型，經(jīng)RT-PCR及Western blot法鑒定，轉(zhuǎn)基因神經(jīng)細(xì)胞過表達(dá)APP595/596基因，說明AD細(xì)胞模型制備成功。

##P<0.01vsGFP group;**P<0.01vsAPP group

Fig 7 Ost inhibited miRNA-107 in neurons transfected with APP595/596 gene(±s,n=3)

##P<0.01vsGFP group;**P<0.01vsAPP group

課題組前期實(shí)驗(yàn)[16]，考察了終濃度為10、50、100 μmol·L-1的Ost作用24 h，對(duì)過表達(dá)APP595/596的神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用，發(fā)現(xiàn)50 μmol·L-1作用最佳。本實(shí)驗(yàn)選取50 μmol·L-1的Ost進(jìn)行機(jī)制研究。結(jié)果顯示，Ost能夠明顯提高神經(jīng)元存活率，減少LDH的釋放，并有效抑制神經(jīng)元凋亡，說明Ost對(duì)轉(zhuǎn)染APP595/596基因的神經(jīng)元具有良好的保護(hù)作用。

BACE1是裂解APP產(chǎn)生Aβ的第一限速酶，AD患者大腦中BACE1的蛋白量和酶活力明顯高于正常水平，通過抑制BACE1的活性，可以抑制APP水解生成Aβ，從而減少Aβ淀粉樣斑塊，改善損傷神經(jīng)元突觸的可塑性，提高學(xué)習(xí)記憶能力[17-18]。BACE1作為miRNA-107(一種內(nèi)源性非編碼RNA，能夠通過靶基因的互補(bǔ)配對(duì)，抑制靶蛋白的表達(dá))的靶基因之一，其mRNA的3′UTR區(qū)存在miRNA-107的結(jié)合位點(diǎn)，兩者表達(dá)呈負(fù)相關(guān)[19]。研究表明，上調(diào)miRNA-107的表達(dá)能夠減少Aβ斑塊沉積，從而減少腦組織中神經(jīng)纖維纏結(jié)[20]。為進(jìn)一步研究Ost保護(hù)神經(jīng)元的作用機(jī)制，作者分別采用免疫熒光化學(xué)法和RT-PCR法，檢測(cè)轉(zhuǎn)染APP595/596基因的小鼠神經(jīng)元在給予Ost前后BACE1和miRNA-107的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Ost明顯降低BACE1的蛋白表達(dá)，升高miRNA-107的表達(dá)，說明Ost有可能通過提高miRNA-107表達(dá)來降低BACE1的蛋白表達(dá)，從而抑制了APP向Aβ水解，減少Aβ產(chǎn)生，進(jìn)而改善細(xì)胞損傷，提高細(xì)胞活力，減少細(xì)胞凋亡和損傷，發(fā)揮保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞的作用。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)是在遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院楊靜嫻教授實(shí)驗(yàn)室完成，感謝教亞男、李少恒、王玉瑩等同學(xué)的幫助！)

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Osthole reduced Aβ synthesis by up-regulating miRNA-107 in neurons transfected with APP595/596gene

XIAO Hong-he,JIAO Ya-nan,YAN Yu-hui,LI Hong-yan,YANG Jing-xian
(SchoolofPharmacy,LiaoningUniversityofTraditionalChineseMedicine,DalianLiaoning116600,China)

Aim To investigate the neuroprotective effects of osthole (Ost) on the primary cultured cortical neurons transfected with APP595/596gene and its underlying mechanism. Methods Neonatal mouse cortical neurons were transfected with APP595/596gene to establish AD cell models for the further study. Then, the cell viability was detected by CCK-8 assay, and the leakage of lactate dehydrogenase (LDH) was assayed by LDH kit to evaluate the injury degree. Transferase-mediated nick end labeling (TUNEL) was used to evaluate the cell apoptosis. The expression of β-amyloid peptide (Aβ) and β-site APP cleaving enzyme 1(BACE1) was measured by immunofluorescence, while the miRNA-107 was measured by RT-PCR. Results Compared to model group, Ost could significantly improve the neurons viability, decrease the LDH release and prevent the apoptosis. Ost also inhibited the expression of Aβ and BACE1 at protein level, while enhanced the expression of miRNA-107 at gene level. Conclusion Ost plays a neuroprotective role in neurons transfected with APP595/596gene in part through up-regulating miRNA-107.

AngelicaePubescentisRadix; osthole; Alzheimer’s disease; neuroprotection; beta-amyloid peptide; miRNA-107

2017-04-11,

2017-05-19

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 81173580)；遼寧省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(No 201102144)；沈陽市科技專項(xiàng)資金(No F11-264-1-42)；遼寧省高等學(xué)校優(yōu)秀人才支持計(jì)劃(5組191號(hào))

肖洪賀(1989-)，男，碩士，助理實(shí)驗(yàn)師，研究方向：中藥物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制，E-mail: xiaohh89@163.com; 楊靜嫻(1963-)，女，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：神經(jīng)藥理學(xué)，通訊作者，E-mail: jingxianyang@yahoo.com

時(shí)間：2017-7-7 11:04 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170707.1104.018.html

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.08.009

A

1001-1978(2017)08-1079-07

R-332；R284.1；R329.25；R338.1；R745.702.2；R977.6