盧昱希+程搏幸+郭巧生+劉飛+史紅專+勾玲

[摘要] 研究了不同水溫（18，22，26，30，34，38 ℃），不同養(yǎng)殖密度（30，60，120，180，240條/L），不同投喂周期（2，5，10，20 d）對(duì)水蛭生長(zhǎng)、攝食、存活的影響。結(jié)果表明，特定增長(zhǎng)率與溫度之間存在顯著二次函數(shù)關(guān)系（P<0.05），且回歸方程為y=-0.016 5x²+0.836 9x-6.847 5（R²=0.990 8）?；貧w分析顯示當(dāng)溫度為25.36 ℃時(shí)，水蛭特定增長(zhǎng)率最大，達(dá)到3.76。當(dāng)溫度高于30 ℃時(shí)，隨著溫度升高，存活率急劇下降。水蛭的特定增長(zhǎng)率隨著密度的增大而減小。隨著密度增加，存活率呈現(xiàn)顯著下降趨勢(shì)（P<0.05）。投喂周期與特定增長(zhǎng)率之間存在著顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系（P<0.05），且線性方程為y=-0.094 1x+3.832 9（R²=0.992 7）。經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)研究可推測(cè)，30～120條/L為適合水蛭生長(zhǎng)的密度，22～26 ℃為水蛭最適生長(zhǎng)溫度，投喂周期越小越好。

[關(guān)鍵詞] 溫度；養(yǎng)殖密度；投喂周期；特定增長(zhǎng)率；餌料系數(shù)

[Abstract] Effects of different water temperature， stocking density and feeding cycle on growth， feeding and survival of Hirudo nipponica have been studied， six temperature gradients were set： 18， 22， 26， 30， 34 and 38 ℃， five stocking density gradients were set： 30， 60， 120， 180 and 240 leech/L， four feeding cycle gradients were set： 2， 5， 10 and 20 d， respectively. The results showed that there exists a significant regression relationship between water temperature and specific growth rate： y=-0.016 5x²+0.836 9x-6.847 5（R²=0.990 8）（P<0.05）， a regression analysis indicated that specific growth rate reached the maximum （3.76） at 25.36 ℃. When water temperature was beyond 30 ℃， the survival rate significantly decreased as water temperature increased （P<0.05）. The specific growth rate and survival rate decreased as stocking density increased. A linear relationship exists between the feeding cycle and the SGR： y=-0.094 1x+3.832 9（R²=0.992 7）. From this study， it can be concluded that the optimal water temperature and stocking density for the growth of H. nipponica is 22-26 ℃ and 30-120 leech/L， respectively.

[Key words] temperature；stocking density；feeding cycle；specific growth rate；feed conversion rate

水蛭Hirudo nipponica，是《中國(guó)藥典》2015年版動(dòng)物藥材水蛭的基原動(dòng)物之一，《中國(guó)動(dòng)物志》稱日本醫(yī)蛭，常年棲息于水田及其與之相通的溝渠中 [1]。作為一種吸血蛭類，水蛭具有較好的抗凝血酶活性[2-3]，已廣泛用于除瘀血、膿血、毒血等傳統(tǒng)中醫(yī)治療及顯微外科手術(shù)、心腦血管疾病等治療[4-6]。但由于水蛭棲息環(huán)境的惡化及過(guò)度捕撈，水蛭的野外種群數(shù)量急劇減少，無(wú)法滿足日益增長(zhǎng)的市場(chǎng)需求[7]。因此，研究水蛭的相關(guān)生物學(xué)特性已迫在眉睫。目前，關(guān)于水蛭的研究主要集中在活性成分、遺傳學(xué)等方面[8-10]，對(duì)水蛭生長(zhǎng)、攝食的研究還相對(duì)較少。本試驗(yàn)將考察溫度、密度、投喂周期對(duì)水蛭的生長(zhǎng)性能、攝食性能的影響，以期為以后的人工飼養(yǎng)提供科學(xué)的理論依據(jù)。

1 材料

實(shí)驗(yàn)用水蛭采集于遼寧大連地區(qū)，經(jīng)中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所動(dòng)物學(xué)專家楊潼鑒定為無(wú)吻蛭目醫(yī)蛭科動(dòng)物日本醫(yī)蛭H.nipponia。實(shí)驗(yàn)用水使用前已經(jīng)過(guò)曝氣處理，實(shí)驗(yàn)期間所有水蛭均用新鮮牛血投喂。

FPG3型三溫區(qū)可編程光照培養(yǎng)箱（寧波萊福科技有限公司），奧克丹多參數(shù)水質(zhì)分析儀（奧克丹科技有限公司），WT-1002高精度電子天平（杭州萬(wàn)特衡器有限公司），高精度溫度計(jì)。

2 方法

2.1 溫度對(duì)水蛭生長(zhǎng)、攝食、存活的影響 選取0.19 g、活性較好、表面無(wú)傷痕的水蛭，共設(shè)置6個(gè)溫度組，溫度分別為18，22，26，30，34，38 ℃。密度為50條/L，投喂間隔為5 d，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組3個(gè)重復(fù)。將放有水蛭的塑料瓶放入可調(diào)節(jié)溫度的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)箱置于有自然光散射的房間內(nèi)。初始溫度均設(shè)置成22 ℃，待水蛭適應(yīng)5 d后，按照2 ℃·d^-1的速率將各瓶子水體溫度升高或降低到實(shí)驗(yàn)設(shè)置溫度。

2.2 密度對(duì)水蛭生長(zhǎng)，攝食，存活的影響 選取0.15 g，活性較好，表面無(wú)傷痕的水蛭，共設(shè)置5個(gè)密度組，分別為30，60，120，180，240條/L。實(shí)驗(yàn)在室溫下進(jìn)行，水溫變化為17.6～23.5 ℃，光照為自然光，投喂間隔為5 d。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組3個(gè)重復(fù)。

2.3 投喂周期對(duì)水蛭生長(zhǎng)、攝食、存活的影響 選取0.18 g、活性較好、表面無(wú)傷痕的水蛭，共設(shè)置4個(gè)投喂周期組，投喂周期分別為2，5，10，20 d。密度為50條/L，實(shí)驗(yàn)在室溫下進(jìn)行，水溫變化范圍為17.6～23.5 ℃，光照為自然光，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組3個(gè)重復(fù)。

2.4 抗凝血酶活性測(cè)定 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后的第8天，從各試驗(yàn)組中隨機(jī)挑選適量的水蛭，置于陽(yáng)光下曬干。根據(jù)《中國(guó)藥典》2015年版中的方法進(jìn)行測(cè)量[11]。

將水蛭干品磨成粉，過(guò)3號(hào)篩。精確稱量1 g粉末放入燒杯中，在燒杯中加入5 mL，濃度為0.9%的氯化鈉溶液。靜置30 min，期間每隔10 min用玻璃棒將混合物攪拌1次；將上清液倒入試管中（8 mm×38 mm），離心10 min。離心后將100 μL上清液和200 μL 包含0.5%纖維蛋白原（以固體計(jì)算）的三羥甲基氨基甲烷鹽酸緩沖液（需要時(shí)再配置）精確加入玻璃試管中，搖勻，水浴5 min。水浴后將凝血酶溶液（40 U· mL^-1）逐滴加入玻璃試管中，每分鐘加1次，每次加5 μL，整個(gè)過(guò)程始終保持在水浴箱（37±5） ℃中進(jìn)行；邊滴加邊輕輕搖勻，直至玻璃管內(nèi)的溶液凝固。記錄消耗的凝血酶溶液體積，并計(jì)算水蛭抗凝血酶活性（U）。

式中，U代表每1 g水蛭抗凝血酶活性；C₁代表凝血酶溶液濃度（U·mL^-1）；C₂代表樣品溶液濃度（g·mL^-1）；V₁代表凝固狀態(tài)時(shí)消耗的凝血酶溶液體積（μL）；V₂代表加入到試管中的樣品溶液體積（μL）。

2.5 日常管理 所有水蛭均投放于塑料瓶中，用膠圈將80目的過(guò)濾網(wǎng)套在瓶口上，以防止水蛭逃跑。實(shí)驗(yàn)周期為60 d，每天清洗瓶子并換水，以保證水體清潔。需要注意的是，溫度實(shí)驗(yàn)中換水時(shí)需將溫差控制在±1 ℃。每次投喂足夠量的新鮮牛血，每次喂食后記錄喂食數(shù)據(jù)；每天巡查各塑料瓶，發(fā)現(xiàn)死亡的水蛭及時(shí)移到瓶外，并記錄存活率；最后一次投喂后的第5 天稱末體重。

2.6 參數(shù)計(jì)算 本研究從增重率（weight gain rate）、特定增長(zhǎng)率（specific growth rate）、單條進(jìn)食總量（total weight of food consumed）、餌料系數(shù)（feed conversion rate）、存活率（survival rate）等5個(gè)方面來(lái)考察溫度、密度、投喂周期對(duì)水蛭生長(zhǎng)和攝食的影響。

增重率（WGR） =（末體重-初始體重）/初始體重×100%

特定增長(zhǎng)率（SGR）=（L_n末體重-L_n初始體重）/試驗(yàn)周期×100%

單條進(jìn)食總量（TWFC）= 水蛭進(jìn)食總量/水蛭條數(shù)

餌料系數(shù)（FCR）=單條進(jìn)食總量/（末體重-初始體重）

存活率（SR）=試驗(yàn)結(jié)束時(shí)剩余條數(shù)/投放條數(shù)×100%

實(shí)驗(yàn)結(jié)果均采用SPSS 19.0 進(jìn)行單因素方差分析，不同組間采用Duncan法比較差異，顯著性水平設(shè)置為P<0.05。

3 結(jié)果

3.1 溫度對(duì)水蛭生長(zhǎng)、攝食、存活及抗凝血酶活性的影響 當(dāng)溫度在18～26 ℃時(shí)，水蛭末體重、增重率、特定增長(zhǎng)率均隨著溫度的升高而升高，當(dāng)溫度超過(guò)26 ℃后，又隨著溫度的升高而降低。當(dāng)溫度為26 ℃時(shí)，末體重、增重率、特定增長(zhǎng)率顯著高于其他溫度試驗(yàn)組（P<0.05）（表1）?；貧w分析表明，特定增長(zhǎng)率與溫度之間存在顯著二次函數(shù)關(guān)系（P<0.05），且回歸方程為y=-0.016 5x²+0.836 9x-6.847 5（R²=0.990 8）。從回歸方程可知，當(dāng)溫度為25.36 ℃時(shí)，水蛭特定增長(zhǎng)率最大，達(dá)到3.76。

餌料系數(shù)先隨著溫度的升高而降低，當(dāng)溫度超過(guò)26 ℃時(shí)，隨著溫度升高，餌料系數(shù)呈上升趨勢(shì)（表1）。當(dāng)溫度介于22～30 ℃，水蛭單條進(jìn)食總量無(wú)差異，且顯著高于18，34 ℃實(shí)驗(yàn)組（P<0.05）。

當(dāng)溫度介于18～30 ℃時(shí)，存活率較高，均達(dá)到85%以上，且相互之間無(wú)顯著差異（P<0.05）。當(dāng)溫度高于30 ℃時(shí)，隨著溫度升高，存活率急劇下降，當(dāng)溫度為38 ℃時(shí)，水蛭在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中全部死亡。當(dāng)溫度為34 ℃時(shí)，抗凝血酶活性最大，顯著高于18，22，26，30 ℃（P<0.05）

3.2 密度對(duì)水蛭生長(zhǎng)、攝食、存活及抗凝血酶活性的影響 水蛭的末體重、增重率、特定增長(zhǎng)率均隨著密度的增大而減小，且低密度組（30，60條/L）的末體重、增重率、特定增長(zhǎng)率顯著高于高密度組（120，180，240條/L）（P<0.05）。當(dāng)密度為30條/L時(shí)，水蛭的特定增長(zhǎng)率達(dá)到最大值，為3.65（表2）。

餌料系數(shù)隨著密度的增加而增大，低密度組（30條/L）的存活率能達(dá)到90%以上，且顯著高于其他試驗(yàn)組（P<0.05）。240條/L密度組抗凝血酶活性最大，達(dá)到131.05 U·g^-1，與180條/L無(wú)顯著差異（P<0.05），且顯著高于30，60，120條/L密度組（P<0.05）。

3.3 投喂周期對(duì)水蛭生長(zhǎng)、攝食、存活及抗凝血酶活性的影響 末體重、增重率、特定增長(zhǎng)率均隨著投喂周期的增大而呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)（表3），且相互之間差異顯著（P<0.05）。回歸分析表明，投喂周期與特定增長(zhǎng)率之間存在著顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系（P<0.05），且線性方程為：y=-0.094 1x+3.832 9（R²=0.992 7）。單條進(jìn)食總量隨著投喂周期的增大而呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，投喂周期對(duì)水蛭存活率無(wú)影響?？鼓富钚噪S著投喂周期的增加而增加，投喂周期為20 d時(shí)，抗凝活性最大，顯著高于其他試驗(yàn)組（P<0.05）。

4 討論

4.1 溫度對(duì)水蛭的影響 水體溫度作為一個(gè)重要的環(huán)境因子，對(duì)水生動(dòng)物的生長(zhǎng)、發(fā)育、存活具有重要影響[12-13]。不同水溫會(huì)導(dǎo)致水生生物在代謝率、生理活動(dòng)方面存在差異[14-15]，進(jìn)而影響其生長(zhǎng)、攝食及蛋白質(zhì)合成等。本研究中，在18～26 ℃，水蛭末體重、增重率、特定增長(zhǎng)率均隨著溫度的升高而升高，當(dāng)溫度超過(guò)26 ℃后，水蛭末體重、增重率、特定增長(zhǎng)率均隨著溫度的升高而呈現(xiàn)出降低的趨勢(shì)。劉鑒毅等[16]在研究中指出，水生動(dòng)物生長(zhǎng)和溫度之間通常存在多元回歸方程關(guān)系?；貧w分析表明，水蛭特定增長(zhǎng)率與溫度之間呈二次函數(shù)關(guān)系，經(jīng)計(jì)算可知，當(dāng)溫度為25.36 ℃時(shí)，水蛭的特定增長(zhǎng)率最大，達(dá)到3.76。當(dāng)溫度介于22～26 ℃時(shí)，水蛭的單條進(jìn)食總量較高；當(dāng)溫度超過(guò)26 ℃時(shí)，單條進(jìn)食總量隨著溫度的升高而降低。實(shí)驗(yàn)期間可觀察到，當(dāng)溫度介于22～26 ℃時(shí)，水蛭活性較好，當(dāng)水體溫度為18 ℃時(shí)，水蛭大多沉于瓶底、行動(dòng)緩慢，耗能較少，且食欲較低。當(dāng)水體溫度達(dá)到34 ℃時(shí)，水蛭活動(dòng)過(guò)于頻繁，可能處于不適狀態(tài)，該溫度可能超出水蛭最適生長(zhǎng)溫度，從而導(dǎo)致攝食率降低[17]。

餌料系數(shù)，即餌料用量與體重增量的比值，比值越低，說(shuō)明增加單位體重所用餌料的量越小。本研究中，餌料系數(shù)隨著溫度的升高呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢(shì)，并在26 ℃達(dá)到最低。有研究表明，在一定溫度范圍內(nèi)，水生動(dòng)物的消化酶活性隨著溫度升高而上升，當(dāng)溫度超過(guò)最適溫度后，呈下降趨勢(shì)[18-19]；因此可推測(cè)水蛭在26 ℃時(shí)酶活性較好使得消化速度加快、食物轉(zhuǎn)換效率較高，從而導(dǎo)致在進(jìn)食量無(wú)差異的情況下，水蛭在26 ℃時(shí)的生長(zhǎng)較22，30 ℃好。關(guān)于溫度對(duì)水蛭消化系統(tǒng)酶活性的影響還需進(jìn)一步研究。

本研究中，溫度對(duì)存活率的影響較為顯著，當(dāng)溫度超過(guò)30 ℃時(shí)，水蛭的存活率顯著下降。溫度為34 ℃時(shí)，60 d后水蛭存活率不足一半，僅為46.67%；當(dāng)溫度達(dá)到38 ℃時(shí)，水蛭在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中全部死亡。說(shuō)明此溫度段已超出水蛭能耐受的高溫范圍。楊潼[1]在《動(dòng)物志》一書(shū)中記載，水蛭耐高溫能力較差，高溫暴曬即可致死。與本研究結(jié)果相符。18～30 ℃，水蛭存活率無(wú)顯著差異，均達(dá)到85%以上。據(jù)野外考察所知，水蛭在我國(guó)分布較廣，北起東北各省南至兩廣地區(qū)均有發(fā)現(xiàn)，因此水蛭對(duì)低溫耐受力較強(qiáng)，關(guān)于其耐受低溫還需進(jìn)一步研究。

在適宜生長(zhǎng)溫度范圍內(nèi)，水生動(dòng)物的生長(zhǎng)率會(huì)隨著溫度的升高而升高，當(dāng)環(huán)境溫度超過(guò)最適生長(zhǎng)溫度范圍后，水生動(dòng)物生長(zhǎng)逐漸減緩、甚至停滯[20]。本研究中，當(dāng)溫度介于22～26 ℃時(shí)，水蛭生長(zhǎng)相對(duì)較快、增重相對(duì)較大、存活率較高，同時(shí)在該溫度范圍內(nèi)，水蛭抗凝血酶活性達(dá)到《中國(guó)藥典》2015年版標(biāo)準(zhǔn)。綜上所述，22～26 ℃為最適生長(zhǎng)溫度。此研究結(jié)果與溫度對(duì)螞蟥生長(zhǎng)影響研究的結(jié)果基本一致[21]。

4.2 密度對(duì)水蛭的影響 養(yǎng)殖密度對(duì)水生動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育、生存有著重要的影響[22-23]。虹鱒魚(yú)在高密度下呈現(xiàn)出較低的生長(zhǎng)率[24]；同樣地，隨著密度的增加，雜交鱘幼魚(yú)生長(zhǎng)減緩[25]。本研究中水蛭生長(zhǎng)率隨著養(yǎng)殖密度的增大而減小，與上述研究結(jié)果一致。在高密度環(huán)境下，水生動(dòng)物的生長(zhǎng)影響機(jī)制較為復(fù)雜[26]。本研究中，隨著養(yǎng)殖密度的增加，水蛭的餌料系數(shù)也隨之增加。說(shuō)明在高密度環(huán)境下，水蛭的食物轉(zhuǎn)換效率較低，從而影響其生長(zhǎng)。分析原因可能為：密度對(duì)水生動(dòng)物的生理生化有較大的影響[27]，由于密度過(guò)高而發(fā)生的競(jìng)爭(zhēng)行為會(huì)引起機(jī)體生理活動(dòng)加強(qiáng)[28]，所以高密度環(huán)境下的水蛭會(huì)消耗更多能量來(lái)產(chǎn)生一系列生理生化的變化來(lái)適應(yīng)脅迫壓力，從而生長(zhǎng)緩慢。另外，在高密度環(huán)境下，種群內(nèi)會(huì)形成一種“社會(huì)階層”，階層的形成會(huì)導(dǎo)致處于低階層的個(gè)體進(jìn)食受到影響，進(jìn)而影響生長(zhǎng)[29]。

當(dāng)密度高于臨界養(yǎng)殖密度時(shí)，隨著密度的增大，會(huì)產(chǎn)生個(gè)體間相互殘殺、疾病的發(fā)生等消極影響[27，30]。本研究高密度組中，不定期會(huì)發(fā)現(xiàn)有個(gè)體較大的水蛭撕咬個(gè)體較小的水蛭，分析原因可能為高密度環(huán)境下“種群脅迫”加劇，個(gè)體間相互攻擊的機(jī)會(huì)增加。當(dāng)密度為30條/L時(shí)，水蛭存活率最大，當(dāng)密度大于120條/L時(shí)，水蛭存活率顯著下降，各密度條件下水蛭抗凝血酶活性均能達(dá)到《中國(guó)藥典》2015年版標(biāo)準(zhǔn)。因此可推測(cè)30～120條/L的密度較適合水蛭生長(zhǎng)發(fā)育。

4.3 投喂周期對(duì)水蛭的影響 已有研究表明，投喂周期可以顯著影響魚(yú)類的生長(zhǎng)發(fā)育和餌料利用[31]。星斑川鰈幼魚(yú)、銀鯽的生長(zhǎng)率均隨著投喂周期的增大而減小[32-33]。本研究中，投喂周期與特定增長(zhǎng)率之間存在著顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，隨著投喂周期增大，特定增長(zhǎng)率呈下降趨勢(shì)。當(dāng)投喂周期為2～10 d時(shí)，各組間餌料系數(shù)、存活率無(wú)顯著差異，單條進(jìn)食總量隨投喂周期增大而呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，說(shuō)明攝食不足是引起低投喂頻率組水蛭生長(zhǎng)緩慢的主要原因。水蛭耐饑能力較強(qiáng)，其用于消化的盲囊向體兩側(cè)伸展占據(jù)了大部分體積，食物能在體內(nèi)存儲(chǔ)。而且水蛭消化道內(nèi)的消化酶較少，這導(dǎo)致了水蛭的消化與吸收是個(gè)緩慢過(guò)程，所以水蛭飽食1次能維持生命較長(zhǎng)時(shí)間[1]，所以各組間存活率無(wú)顯著差異。本研究中，隨著投喂周期增大，水蛭抗凝血酶活性隨之增大，且各投喂周期條件下抗凝血酶活性均達(dá)到《中國(guó)藥典》2015年版標(biāo)準(zhǔn)。因此，生產(chǎn)上建議每隔2～5 d投喂1次水蛭，確保藥材品質(zhì)的同時(shí)，水蛭生長(zhǎng)更好。

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[責(zé)任編輯 呂冬梅]