劉娟+紀(jì)瑞鋒+陳同+袁媛+郭娟+王英平+高文遠(yuǎn)+黃璐琦

[摘要] 采用生物信息學(xué)及實時熒光定量方法對10個人參皂苷生物合成關(guān)鍵酶基因的組織表達(dá)特性進(jìn)行研究。運用轉(zhuǎn)錄組熱圖聚類方法分析了四年生吉林人參14個不同部位人參皂苷生物合成基因的表達(dá)；運用實時熒光定量PCR的方法測定人參組培苗、不定根中人參皂苷生物合成基因的表達(dá)；運用Pearson相關(guān)對這10個人參皂苷生物合成關(guān)鍵酶基因表達(dá)特性進(jìn)行分析。結(jié)果表明，β-AS，CYP716A52v2在吉林人參及組培苗的根中表達(dá)高，與Ro分布相一致；與達(dá)瑪烷型人參皂苷合成相關(guān)的CYP716A47，CYP716A53v2表達(dá)呈顯著正相關(guān)，從分子水平證明了人參皂苷化學(xué)成分分布的差異主要由轉(zhuǎn)運引起。

[關(guān)鍵詞] 人參；人參皂苷生物合成基因；組織表達(dá)

[Abstract] The study is aimed to characterize the tissue expression of 10 key ginsenoside biosynthetic genes using bioinformatics method and real-time quantitative PCR. Heatmap and cluster analysis of 10 ginsenoside biosynthetic genes were performed in four-year-old Jilin ginseng. Using real-time quantitative PCR， the expression correlation of 10 key genes involved in ginsenoside biosynthesis was analyzed in different organs of four-year-old Jilin ginseng including， tissue culture seedling and adventitious root. Pearson correlation was used to analyze the relation between those 10 key genes involved in ginsenoside biosynthesis. The results showed that β-AS and CYP716A52v2 were expressed highly in root of Jilin ginseng and ginseng culture seedling， which was consistent with Ro distribution. In addition， CYP716A53v2 and CYP716A47 which involved in dammarane type ginsenoside biosynthesis were positively correlated， which revealed that the difference of ginsenoside distribution was caused by transport system.

[Key words] ginseng；ginsenoside biosynthetic genes；tissue expression

人參為五加科Araliaceae植物人參Panax ginseng C. A. Mey.的干燥根及根莖，是名貴中藥材，在我國已有超過2 000年的用藥歷史[1]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，人參的主要有效成分人參皂苷具有抗腫瘤、抗衰老、抗炎、抗氧化等藥理活性[2-4]。人參皂苷屬于三萜類成分，至今已從人參中分離并確定了110余種[5]，根據(jù)苷元不同，可分為3種類型：一類為齊墩果烷型五環(huán)三萜類皂苷（如Ro等）；另2類屬于達(dá)瑪烷型四環(huán)三萜類皂苷，包括人參二醇型皂苷（如Rb₁，Rb₂，Rc，Rd，F(xiàn)₂，Rg₃，Rh₂等）和人參三醇型皂苷（如Re，Rg₁，Rg₂，Rf，Rh等），后兩者在人參皂苷中占大多數(shù)，具有較好的新藥開發(fā)前景[6]。

人參皂苷在人參中含量較低，而人參人工種植需要4～15年的生長栽培周期，又面臨農(nóng)藥殘留、重金屬污染及品質(zhì)退化等問題[7]。因此，為了適應(yīng)日益增長的用藥需求、保護(hù)人參資源，近年來國內(nèi)外學(xué)者通過組織培養(yǎng)、生物轉(zhuǎn)化及合成生物學(xué)等途徑對人參皂苷合成進(jìn)行探索研究[8]。人參已在中國、日本及韓國成功建立了組培苗、不定根及懸浮細(xì)胞等體系，但存在細(xì)胞株系不穩(wěn)定、放大培養(yǎng)困難、目的產(chǎn)物低及培養(yǎng)條件復(fù)雜導(dǎo)致成本高等問題[7]。因此，如何有效地分析人參皂苷在不同體系中的合成規(guī)律，有助于解析以上問題。

近年來，關(guān)于人參皂苷生物合成途徑的解析取得一定進(jìn)展（圖1）[8-11]。其中的關(guān)鍵酶包括上游的3-羥基-3-甲基戊二酰CoA還原酶（3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase，HMGR）、法呢基焦磷酸合酶（farnesyl diphosphate synthase，F(xiàn)PS）、鯊烯合酶（squalene synthase，SQS）、鯊烯環(huán)氧酶（squalene epoxidase，SQE），下游的3個分支酶達(dá)瑪烯二醇-Ⅱ合酶（darmmarenediol-Ⅱ synthase，DDS）、β-香樹素合酶（β-amyrin synthase，β-AS）、環(huán)阿爾廷醇合酶（cycloartenol synthase，CAS）和3個細(xì)胞色素P450酶CYP716A47（形成人參二醇型皂苷前體原人參二醇），CYP716A53v2（形成人參三醇型皂苷前體原人參三醇），CYP716A52v2（oleanolic acid synthase，OAS，形成齊墩果烷型皂苷前體齊墩果酸）。本研究通過人參植株、組培苗及不定根體系，對以上10個關(guān)鍵酶基因進(jìn)行組織表達(dá)特性分析，并探討了基因表達(dá)的相關(guān)性，為深入闡明人參皂苷合成途徑提供理論依據(jù)，為有效篩選皂苷轉(zhuǎn)產(chǎn)型組培材料提供指標(biāo)基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 人參組培苗 取人參種子，用70%乙醇水溶液浸泡3 min，然后用1%次氯酸鈉浸泡30 min，滅菌去離子水洗3遍，將已成熟的胚狀體從種子中轉(zhuǎn)移出來，并在含有1%蔗糖的1/2 MS固體培養(yǎng)基中（25±2） ℃培養(yǎng)3周（16 h光照/8 h黑暗），萌發(fā)后的材料轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基（MS+3 mg·L^-1 6-BA+5 mg·L^-1 NAA +1 mg·L^-1 IAA）中誘導(dǎo)成苗，可作為后續(xù)的實驗材料使用。

1.2 人參不定根 組培苗的葉柄切成1.0 cm長，作為誘導(dǎo)人參不定根的外植體。將外植體在1/2 MS（含3.0 mg·L^-1 IBA）固體培養(yǎng)基中（25±2） ℃暗培養(yǎng)4周，待外植體形成不定根后將其分離，并繼代到1/2 MS液體培養(yǎng)基（含3.0 mg·L^-1 IBA）中（25±2） ℃暗培養(yǎng)。3周繼代1次，12周后，不定根生長穩(wěn)定快速，可作為后續(xù)的實驗材料使用。

1.3 試劑 TRIzol Plant RNA Kit （Life technologies） 購于北京江晨源遠(yuǎn)生物科技有限責(zé)任公司；M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit，SYBR Premix Ex Taq均購于大連寶生物公司。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成?；驕y序由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司完成。

1.4 儀器 凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad），制冰機(jī)（Sanyo），NanoDrop 2000 核酸/蛋白定量儀（Thermo），臺式高速離心機(jī)（Eppendorf），超低溫冰箱（Thermo），高壓蒸汽滅菌鍋（TOMY SX-700），實時熒光定量PCR儀（Applied Biosystems 7500）。

2 方法

2.1 Total RNA 提取與單鏈cDNA的合成 人參不定根分為根尖1 cm （A）、有分支部位（B）、棕黃色老根（C）3個組織部位，人參組培苗分為根、葉及種子3個組織部位。取人參組培苗及不定根不同組織樣品分別在液氮中研磨，根據(jù)TRIzol Plant RNA Kit說明書提取總RNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳確定RNA完整性，用核酸/蛋白定量儀對RNA定量。cDNA合成按M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit說明書進(jìn)行，合成的cDNA作為下游反應(yīng)模板。

2.2 引物的設(shè)計與合成 根據(jù)文獻(xiàn)[8，12-13]及序列信息合成了人參皂苷生物合成關(guān)鍵基因HMGR，F(xiàn)PS，SQS，SQE，DDS，β-AS，CAS，CYP716A47，CYP716A53v2，CYP716A52v2及內(nèi)參基因IF3G1[14]的引物，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成（表1）。

2.3 實時熒光定量PCR 利用實時熒光定量PCR （Real-time PCR，qRT-PCR） 的方法檢測上述基因在不同樣品的表達(dá)模式。選取人參的IF3G1作為內(nèi)參基因[14]。實時熒光定量PCR反應(yīng)體系為5 μL SYBR Premix Ex Taq酶，上下游引物（10 μmol·L^-1）各0.5 μL，cDNA模板（100 mg·L^-1）1 μL，加水補(bǔ)足至10 μL，每個反應(yīng)體系至少重復(fù)3次。擴(kuò)增程序如下：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性5 s，60 ℃退火延伸34 s（每次循環(huán)后采集熒光信號），40個循環(huán)；95 ℃變性10 s，65～95 ℃做熔解曲線分析，每個溫度以每步0.5 ℃上升，停留5 s，獲得每個基因的Ct進(jìn)行相對表達(dá)量分析。

2.4 基因相對表達(dá)量的計算 人參不定根基因表達(dá)的計算是以不定根C部位作為基準(zhǔn)參比部位，假定10種基因在C部位表達(dá)量均為100%，計算10種基因在A，B，C部位的相對表達(dá)量；人參組培苗基因表達(dá)的計算是以種子作為基準(zhǔn)參比部位，計算10種基因在人參組培苗根、葉、種子部位的相對表達(dá)量；人參愈傷組織基因表達(dá)的計算是以30 d樣品作為參比部位，計算10種基因在30，60 d人參愈傷組織的相對表達(dá)量。利用美國ABI公司SDS V2.3軟件對PCR過程的數(shù)據(jù)進(jìn)行收集和分析，然后計算樣品基因相對表達(dá)量，計算公式為：2-ΔΔCT=2-[（CT目的基因-CT管家基因）待測組-（CT目的基因-CT管家基因）對照組]。

2.5 人參轉(zhuǎn)錄組熱圖聚類分析 將NCBI SRA （sequence read archive）庫中四年生果期吉林人參不同組織部位轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（SRR2952867～SRR2952880）進(jìn)行從頭拼接，構(gòu)建完整的轉(zhuǎn)錄本庫，運用BioEdit建立本地文庫，通過Local BLAST比對分別篩選出與熒光定量一致的序列信息（序列號見表1，E-value=0）。運用Heml軟件（Heatmap Illustrator，version 1.0）對基因表達(dá)進(jìn)行熱圖聚類分析，分析這10個人參皂苷生物合成基因在吉林人參不同組織部位的表達(dá)模式及相互關(guān)系。

2.6 基因表達(dá)相關(guān)性分析 利用SPSS 20.0軟件對人參不同組織部位的10個基因表達(dá)進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析，|r|>0.7說明兩者呈現(xiàn)高度線性相關(guān)，0.7≥|r|≥ 0.5說明兩者呈現(xiàn)中度線性相關(guān)，0.5≥|r|≥0.3則兩者呈現(xiàn)低度相關(guān)，|r|<0.3兩者相關(guān)性極低，P≤0.05為顯著水平，P≤0.01為極顯著水平[15]。

3 結(jié)果與分析

3.1 吉林人參中人參皂苷生物合成基因的表達(dá)分析 人參皂苷在人參全株均有分布，主要積累于人參的根、根莖、葉、果實中[8]。因此，為了分析人參皂苷生物合成基因在人參不同器官的表達(dá)情況，利用NCBI SRA （Sequence Read Archive）對四年生果期吉林人參不同組織部位的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（SRR2952867～SRR2952880）進(jìn)行組裝拼接，通過基因序列同源比對及表達(dá)熱圖聚類分析，發(fā)現(xiàn)人參皂苷生物合成上游基因FPS，SQS在植株中表達(dá)較高，且沒有明顯的組織特異性；3個分支酶基因表達(dá)組織特異性較強(qiáng)，其中CAS主要在根中表達(dá)，DDS主要在根莖中表達(dá)，β-AS主要在主根及根莖中表達(dá)；3個P450基因中，CYP716A52v2主要在地下的根及根莖中表達(dá)，CYP716A47，CYP716A53v2在根、莖、葉中均有表達(dá)（圖2）。從結(jié)果可以看出，人參皂苷生物合成基因表達(dá)模式大致為根及根莖>葉>果實>種子，其中齊墩果烷型人參皂苷生物合成的組織特異性最明顯。

3.2 人參組培苗中人參皂苷生物合成基因表達(dá)分析 為了進(jìn)一步了解不同類型人參皂苷分布與基因表達(dá)的關(guān)系，采用受控實驗，對組培苗中人參皂苷生物合成基因的表達(dá)情況及其合成規(guī)律進(jìn)行研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除了HMGR在根、葉、種子中沒有表現(xiàn)出表達(dá)組織特異性外，其余9個基因均表現(xiàn)出組織表達(dá)差異。由于β-AS，CYP716A52v2與Ro合成密切相關(guān)，而SQS，β-AS，CYP716A52v2在根中高表達(dá)，這與Ro主要在根中分布具有一致性。在葉中表達(dá)高的有SQE，CAS，CYP716A47，CYP716A53v2（圖3），其中CYP716A47，CYP716A53v2與達(dá)瑪烷型人參皂苷密切相關(guān)，與達(dá)瑪烷型人參皂苷主要分布于人參葉中一致。其中三醇型人參皂苷在人參葉中含量高而二醇型人參皂苷在人參根中含量高，為從分子層面說明根中含有的二醇型人參皂苷部分來源于葉的合成與運輸提供了依據(jù)。

3.3 人參不定根中人參皂苷生物合成基因表達(dá)分析 人參皂苷主要分布于人參根中木栓化較高的木栓層[8]，由于人參不定根A，B，C 3個部位組織木栓化程度存在顯著差異，即根尖（A）組織木栓化程度較低，分支部位（B）組織木栓化程度居中，部位老根（C）組織木栓化程度較高[16]，因此進(jìn)一步分析了不同木栓化程度不定根中人參皂苷合成基因的組織特異性表達(dá)水平。結(jié)果顯示，不定根木栓化程度越高，SQS，CAS，CYP716A47，CYP716A53v2表達(dá)越高，β-AS表達(dá)趨勢則相反（圖4），暗示在人參不定根中，達(dá)瑪烷型人參皂苷合成很可能與其木栓化過程密切相關(guān)。

3.4 人參皂苷生物合成基因相關(guān)性分析 根據(jù)人參皂苷生物合成基因在人參不同體系中的表達(dá)情況，對這10個基因進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析。結(jié)果顯示，F(xiàn)PS與SQS，CAS，CYP716A47，CYP716A53v2，CAS與CYP716A53v2，CYP716A47與CYP716A53v2這6對基因具有顯著正相關(guān)（r>0.7）（圖5）。其中，上游FPS基因與通路多個酶基因表達(dá)具有顯著正相關(guān)，說明該基因與通路多個人參皂苷合成基因存在互作或具有相同的上游調(diào)控元件，是人參皂苷生物合成非常關(guān)鍵的基因；CYP716A47與CYP716A53v2表達(dá)呈現(xiàn)顯著正相關(guān)（r = 0.89），說明二醇型和三醇型達(dá)瑪烷型人參皂苷在植物中合成的組織部位較一致，因此更說明二醇型與三醇型人參皂苷在植株中分布的不同很有可能是運輸導(dǎo)致的。

4 討論

近年來，隨著多種人參皂苷藥理活性的確認(rèn)及相關(guān)產(chǎn)品的開發(fā)，對人參皂苷的需求量日益增大，因此揭示人參皂苷生物合成網(wǎng)絡(luò)及代謝調(diào)控機(jī)制將對提高人參皂苷的生物轉(zhuǎn)化率奠定理論基礎(chǔ)。由于人參皂苷的合成與人參生長年限、組織器官、環(huán)境因子等多因素密切相關(guān)，因此本文采用不同體系對人參皂苷生物合成基因的組織特性表達(dá)進(jìn)行探索研究，為深入挖掘人參皂苷代謝網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控機(jī)制提供依據(jù)，為整體提高代謝途徑中基因的表達(dá)水平、有效提高組培體系中人參皂苷的產(chǎn)量奠定基礎(chǔ)。

前人研究表明，人參皂苷在人參植株的不同器官分布的種類與含量不同，在一至四年生的人參根中主要分布有Rg₁，Re，Rb₁，在葉子中主要分布有Re，Rd，Rg₁[8]。在人參不同組織器官皂苷含量的研究中發(fā)現(xiàn)，總皂苷在人參果肉，葉及須根中含量最高，其中Rg₁，Re（三醇型人參皂苷）在葉中含量最高，而Rb₁，Rb₂，Rc（二醇型人參皂苷）在根中含量最高[12，17-18]，齊墩果烷型人參皂苷Ro在根中含量遠(yuǎn)高于葉（約10倍）[19]。Han[20]與Kim等[21]研究小組發(fā)現(xiàn)，人參皂苷成分分布與基因表達(dá)并不一致，Schramek等[22]用13C標(biāo)記的同位示蹤法發(fā)現(xiàn)，人參皂苷合成的前體能從葉子轉(zhuǎn)移到根中，因此有學(xué)者提出人參皂苷分布差異與運輸密切相關(guān)[8，23]，但對其轉(zhuǎn)運機(jī)制的研究尚未見報道。

本研究表明，不同人參皂苷生物合成基因在人參植株不同部位表達(dá)具有組織差異。上游的4個關(guān)鍵酶基因HMGR，F(xiàn)PS，SQS，SQE進(jìn)行表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)：不同組織部位4個基因地上地下均有表達(dá)，以FPS，SQS兩者表達(dá)最高；SQS在木栓化程度高的不定根C部位顯著高于A和B、根的表達(dá)高于葉和種子，說明SQS的表達(dá)很可能與組培材料的分化相關(guān)。合成齊墩果烷型人參皂苷的2個關(guān)鍵酶基因β-AS，CYP716A52v2進(jìn)行表達(dá)分析，發(fā)現(xiàn)兩者在根中表達(dá)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他部位，這與Ro的分布相一致。合成達(dá)瑪烷型人參皂苷的3個關(guān)鍵基因DDS，CYP716A47，CYP716A53v2進(jìn)行表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)：DDS在根和葉中表達(dá)較高，說明達(dá)瑪烷型人參皂苷前體在人參的根、葉均有合成；合成二醇型人參皂苷前體的CYP716A47與合成三醇型人參皂苷前體的CYP716A53v2表達(dá)一致（呈現(xiàn)顯著正相關(guān)，r=0.89），暗示CYP716A53v2表達(dá)間接促進(jìn)CYP716A47表達(dá)的提高，從而促進(jìn)合成更多二醇型的人參皂苷作底物。前人研究已經(jīng)表明，根中主要分布二醇型人參皂苷、葉中主要分布三醇型人參皂苷[12，17-18]，基因表達(dá)的結(jié)果較好證明了前人論述的結(jié)論[8，20-23]，同時暗示轉(zhuǎn)移的人參皂苷前體多是二醇型的人參皂苷。合成植物甾醇（如常見的植物激素油菜素內(nèi)酯、獨角金甾醇）前體的關(guān)鍵酶CAS進(jìn)行表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，它在人參的根、葉、木栓化的不定根C中表達(dá)高，與CYP716A47，CYP716A53v2表達(dá)模式基本一致，說明兩者的通路存在相關(guān)性，也有可能是甾醇類的植物激素對人參皂苷的合成具有調(diào)控作用。

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[責(zé)任編輯 呂冬梅]